Исследования свойств серосодержащих органических соединений методами радионуклидной диагностики Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 547.4/.8:543.52

Исследования свойств серосодержащих органических соединений методами радионуклидной диагностики

А. А. Мандругин, Т. П. Трофимова, В. М. Федосеев, С. Я. Проскуряков

АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ МАНДРУГИН — доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник кафедры радиохимии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Область научных интересов: органический синтез, механизмы органических реакций, медицинская химия, радиохимия, меченые соединения. E-mail mandrug@radio.chem.msu.ru

ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА ТРОФИМОВА — кандидат химических наук, научный сотрудник кафедры радиохимии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Область научных интересов: органический синтез, механизмы органических реакций, медицинская химия, радиохимия, меченые соединения. E-mail Jrof@radio.chem.msu.ru

ВЛАДИМИР МИХАЙЛОВИЧ ФЕДОСЕЕВ — доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой радиохимии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Область научных интересов: органический синтез, механизмы органических реакций, медицинская химия, радиохимия, меченые соединения. E-mail fedoseev@radio.chem.msu.ru

СЕРГЕЙ ЯКОВЛЕВИЧ ПРОСКУРЯКОВ — кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Медицинского радиологического научного центра РАМН (г. Обнинск). Область научных интересов: медицинская химия, радиохимия, меченые соединения. E-mail noo@mrrc.obninsk.ru

119992 Москва, Ленинские горы, д. 1, Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, факс (495)939-31-87.

Метод радионуклидной диагностики получил широкое распространение во многих областях химии, физики, биологии и медицины. Применение радионуклида серы 35Б (Р-излучатель, ЕШкс = 0,167 МэВ, Т\/2 = 87 сут [1]) в органической химии дает возможность осуществлять следующие направления исследований: детально изучать кинетические закономерности реакций образования серосодержащих веществ и их химических превращений; выбирать оптимальные условия получения и выделения новых соединений; рассматривать различные аспекты механизмов химических реакций, в том числе оценивать прочность связи атомов серы между собой и с другими элементами в молекуле, устанавливать места разрывов этих связей; обнаруживать промежуточные вещества и фиксировать обратимость ряда процессов [2].

Впервые изотоп серы 35Б был получен в 1939 г. на циклотроне в Беркли (Калифорния, США). К этому же году относятся и первые работы с использованием этого изотопа. Исследования X. Тарвера и К. Шмидта (кафедра биохимии Калифорнийского университета) были посвящены исследованию обмена серы в серосодержащих аминокислотах. С использованием изотопа 35Б они доказали, что цистеин превращается в метио-нин и что эта реакция обратима [3, 4].

Для введения радиоактивной серы в органические молекулы используют химические методы [5—7], изотопный обмен [8], биосинтез и ферментативный синтез [9—11], а также специальные ядерно-химические методы [12, 13].

Установление места разрыва связей в молекулах с использованием изотопов серы

Известно, что 4-алкил-2,6,7-триокса-1-фосфаби-цикло[2.2.2]октан-1-тиоксиды (бициклотионфосфаты), являясь селективными блокаторами С1~-проводящих каналов, обладают исключительно высокой физиологической активностью и токсичностью. Меченые радионуклидами соединения этого класса используются в настоящее время как радиолиганды в нейрохимии и нейрофармакологии [14—16]. Для получения меченых серой 35Б бициклотионфосфатов была исследована возможность изотопного обмена в системе 4-этил-бициклотионфосфат 1 — элементная сера 35Б [7]. Предположили, что соединение 1 вследствие стериче-ской доступности атома фосфора в структуре и способности образовывать спиросоединения может через спироинтермедиат 2 участвовать в изотопном обмене. Реакцию проводили в толуоле, в смеси толуола и амилового спирта (1 : 1) или без растворителя при 60— 120 °С. Состав реакционных смесей анализировали методом тонкослойной радиохроматографии. Установлено, что в этих условиях реакция изотопного обмена не идет (схема 1). Следует отметить, что нециклическое производное фосфора — тиофосфорилхлорид — может быть получено с высокой удельной радиоактивностью изотопным обменом тиофосфорилхлорида с элементной серой 35Б [6].

При получении Б-аллилизотиомочевины, меченной серой 358, впервые было обнаружено, что ее синтез

можно осуществить не только прямым аллилировани-ем [358]тиомочевины, но и с помощью «фрагментарного» обмена изотиомочевины 3 с меченым тиокарба-мидом 4, легко проходящем при нагревании веществ в этиловом спирте [17]. Обмен происходит в результате миграции радиоактивного атома в составе тиоамидно-го фрагмента. Реакция обратима, что подтверждается обратным обменом [358]аллилизотиомочевины 5 с немеченой тиомочевиной (схема 2).

ЫН-НХ 3-НХ

3Х .КН2 +

Т

НЫ^НХ 5-НХ

т

<

Г

Т(Г

н,мч 6

Схема 2

Процесс обмена описывается уравнением обратимой реакции первого порядка. Порядок реакции определяли по зависимости начальной скорости от исходной концентрации реагентов; скорость реакции практически не зависит от концентрации тиомочевины. Механизм обмена, по-видимому, подобен мономолекулярному механизму и включает образование промежуточной катионоидной структуры аллильного типа, обладающей высокой избирательностью по отношению к тиомочевине.

Показано [18], что в фрагментарный обмен вступают также 8-бсн-зилизотиомочевины и 2-амино-4-ок-со-2-тиазолин 6, однако в последнем случае механизм реакции включает стадию рециклизации гетероцикла (схема 3).

Ы-Аллилтиомочевины и Б-алкил-изотиомочевины [18] не обмениваются фрагментом тиомочевины даже в более жестких условиях (при длительном кипячении в водном спирте, воде, ДМФА).

[358]Аллилизотиомочевина 5 при хранении в растворах (в спиртах, водно-спиртовых смесях, ДМФА) или в

//

О

<

ин

кристаллическом виде (гидробромид, перхлорат и пи-крат изотиомочевины) претерпевает авторадиолитиче-ское разложение с выделением заметного количества меченой [358]тиомочевины [19]. Тонкослойной радиохроматографией показано, что при хранении гидробромида [358]аллилизотиомочевины (0,05 Ки/моль) при 5 °С в кристаллическом виде и в виде этанольного раствора (0,5 моль/л) в течение 30 дней образуется соответственно 10% и 17% меченой тиомочевины. Такой же эффект обнаружен и в случае 8-[14С]аллил-изотиомочевины. Вероятно причина этого эффекта — воздействие на меченую аллилизотиомочевину первичных продуктов радиолиза среды (электронов, гид-роксил-радикалов и т.д.), приводящее к распаду молекулы.

При синтезе меченой N-аллилтиомочевины изотопным обменом с элементной [35Б] реакция сопровождается образованием побочного вещества с многократным включением метки, по-видимому, продукта присоединения серы по двойным С=С- и С=8-связям [19]. Относительное содержание этого продукта растет при использовании в реакции ряда растворителей: смесь я-ксилол—этанол (5% от всей радиоактивности в смеси обнаруживается в виде этого продукта) < этанол (15%) « ДМФА (45—60%). Вероятно Ы-аллил-тиомочевина выступает в данном случае как «ловушка» реакционноспособных частиц, образующихся вследствие авторадиолиза меченой элементной серы.

.О

шн

011

о

«д

011

НДТЛМ!

н,мТ«^мн2

БС(ЫН2)2

358С(МН2)2 4

.О

о

шн

«

35§ 011

35о

ИЛГЛМ!,

Схема 3

+

35

8

4

8

R

о

nh2

7а-с

n nh

2 ОН

о

R

о

S^NH nh 10а"с

ОН

о

| *s

О

8а-с

H,n nh,

П "

О

S _ 9а-с

R = Н (а), Ме (b), Et (с); *S = 35S Схема 4

Механизмы и кинетические исследования некоторых реакций органических соединений, содержащих серу

Изучение возможных направлений реакций

Методом радионуклидной диагностики исследовано превращение [358]2-амино-2-тиазолидинона-4 7а и его 5-метил- и 5-этилпроизводных 7Ь,с, а также [14С]2-амино-2-тиазолидинона-4 в водных растворах щелочи [20] (схема 4).

Ранее предполагали, что в водных растворах при рН > 7 соединения 7а—с разлагаются с образованием мочевины, тиомочевины, 2-гидрокси- 8а—с и 2-мер-каптокарбоновых кислот 9а—с и что при таком составе продуктов реакции первоначально происходит раскрытие цикла в соединении 7 по связи Б—С(5) или Б—С(2) (см. схему 4, путь 1 или 3). При наличии лак-тамной группировки в соединении 7 в рассматриваемых условиях гетероцикл может раскрываться по связи N(3)—С(4) (см. схему 4, путь 2). Во всех случаях при разной глубине превращения мочевина не была обнаружена, следовательно путь 3 не реализуется. Образование 8-(1-карбоксиметил)изотиомочевин 10а—с свидетельствует о реализации пути 2, т.е. происходит раскрытие цикла по эндоциклической связи в соответствии с механизмом, близким гидролизу лактамов в щелочной среде.

Изучена перегруппировка некоторых Р-галоген-сульфидов в реакциях со свободными металлами [21]. При исследовании восстановления меченых 35Б-(2-бромэтил)изотиомочевин цинковой пылью в спирте и хлороводородной кислоте установлено, что продуктами реакции являются только тиомочевина и соответствующие непредельные соединения. Специальным опытом была доказана устойчивость связи С—8 в солях 3-амино- и 3-карбоксипропилизотио-мочевин к действию металлов. Это означает, что разрыв связи С—8 в ходе восстановления определяется присутствием галогена в Р-положении к атому серы.

С использованием 35Б показано [22], что в цепи последовательно-параллельных реакций З-амино-2-бромпропионовой кислоты 11 с тиомочевиной 4 образуются 8-(2-амино-1-карбоксиэтил)изотиомочевина 12, 2-амино-2-тиазолин карбоновая-5 кислота 13 и 2-амино-5-аминометил-2-тиазолинон-4 14 (схема 5).

NH, О

ОН

Вг и

h2^NH2

NH, О

NH,

.О

f

13

т

NH, 14

N

ОН "Sv^NH

NH, 12

*S = 35 S Схема 5

Показано [23], что гетероциклизация N-аллил-тиомочевины, меченной серой 35S, под действием протонных кислот приводит к целому ряду соединений, что противоречит результатам синтетической практики, использующей эту реакцию для количественного получения производных 5-метил-2-амино-2-тиазолина. Анализ реакционных смесей циклизации немеченой N-алл ил тиомочевины показал, что практически единственным ее продуктом при нагревании в водных растворах протонных кислот (HCl, НВг,

s

1Ь5().() является 5-метил-2-амино-2-тиазолин 15. При этом в следовых количествах образуется изомерный 2-амино-5,6-дигидро-4//-1,3-тиазин 16 (< 1,5%) (схема 6).

Ме

N1-1, ]МН2

15 16

X = С1, Вг, Н804-

Схема 6

В этих же условиях циклизация Ы-аллилтио-мочевины 17, меченной 358, приводит к образованию помимо соединений 15 и 16 аномальных продуктов реакции — 5-галогенметил-2-амино-2-тиазолинов 18а,Ь и 5-галоген-2-амино-5,6-дигидро-4//-1,3-тиа-зинов 19а,Ь. При действии на соединение 17 раствора серной кислоты образуются соединения 15, 16 и 5-гидроксиметил-2-амино-2-тиазолин 20 (схема 7). Особенно заметным оказалось влияние на эти

реакции кислотности среды. В разбавленных водных <

19 практически не образуются независимо от удельной радиоактивности Ы-аллилтиомочевины 17. В то же время в реакционной смеси появляется неиденти-фицированный, по-видимому, полимерный продукт, содержание которого увеличивается при понижении

концентрации кислоты и достигает 15—20% (при кон-<

всех случаях обнаружено существенное возрастание (по сравнению с циклизацией немеченой Ы-аллил-тиомочевины) содержания в реакционной смеси ди-гидротиазина — от 1,5 до 15—20%.

Количество аномальных продуктов циклизации в этих реакциях возрастает с увеличением: 1) удельной радиоактивности исходной тиомочевины; 2) концентрации кислоты; 3) содержания ионов галогена в рас-

творе (табл. 1). Необходимо также отметить, что во всех случаях содержание 5-членных гетероциклов 15, 18а,Ь и 20 существенно превосходило количество их 6-членных изомеров 16, 19а,Ь (соотношение 95 : 5 соответственно). Для идентификации этих продуктов реакций были проведены их встречные синтезы и показана идентичность хроматографических констант продуктов реакций и эталонных соединений (ТСХ).

Таблица 1

Суммарный выход аномальных продуктов 18а, 19а (или 18Ь, 19Ь) при циклизации [358]1Ч-аллилтиомочевины 17 в водных растворах кислот

Реагент Концентрация Удельная активность реагента, соединения 17, Со, моль/л Ки/моль Выход 18а+19а (или 18Ь+19Ь), %

НС1 0,1 5,0 1,5 ± 0,7

То же 0,5 5,0 3,9 ± 0,7

—«— 1,0 5,0 ±

—«— 1,0 0,5 ±

НВг 0,1 5,0 ±

То же 0,5 5,0 ±

—«— 1,0 5,0 ±

—«— 0,5 0,5 ±

—«— 1,0 0,5 ±

—«— 1,0 0,05 ±

НВг + 1,0 5,0 ±

КВг 0,05

То же 1,0 5,0 ±

0,1

—«— 1,0 5,0 ±

0,5

НС1 + 1,0 5,0 ±

№С1 0,5

Условия циклизации: Со (17) = 0,1 моль/л, 100 °С, 100%-е превращение исходного соединения 17

X х

N11, МН2

18а,Ь 19а, Ь

ОН

N11, 20

НХ

н,о

Ме^

.М N11,

Т "

17

1 + .Г 1

Б

N11, N11,

15 16

Н2804

н,о

15 + 16 +

X = С1 (а), Вг (Ь); 'Б = 358 Схема 7

Кинетические исследования сложных химических реакций органических соединений, содержащих сульфидную серу

Высокая нуклеофильность тиомочевины в сочетании с низкой основностью делают ее удобной моделью при изучении реакций нуклеофильного замещения для широкого круга галогенпроизводных.

Показано [24], что при взаимодействии тиомочевины с Ы-(а-галогенацил)аминокислотами реакция идет по второму порядку и ее скорость зависит от природы растворителя. Для подробного изучения влияния растворителя на скорость реакции была выбрана более простая модель — а-броммасляная кислота. Изучено взаимодействие [ :,58]тиомочсвины и а

и определены константы скорости реакции [25]. Скорость реакции зависит от растворителя и уменьшается в ряду диметилформамид, этанол, пропанол-2, уксусная кислота.

Ранее было изучено влияние вицинальных заместителей на реакционную способность в нуклеофиль-ном замещении у насыщенного атома углерода. Ра-диохроматографически определены константы скорости реакции тиомочевины с Р-замещенными бромэта-нами в диметилформамиде, рассчитаны энергии активации реакции [26]. Показано несоблюдение изокине-тической зависимости и уравнения Тафта для всех заместителей и выполнение изокинетических зависимостей для двух отдельных реакционных серий, одна из которых удовлетворительно описывается уравнением Тафта, учитывающим индуктивные и стерические эффекты заместителей.

На основании полученных данных предположили существование двух типов вицинальных заместителей в Р-замещенных бромэтанах с различными механизмами влияния на реакционную способность брома у насыщенного атома углерода. Для заместителей первого типа (Н, Р, Вг, СНз, С6Н5) основными факторами, определяющими реакционную способность, являются их индуктивные и стерические эффекты. Второй тип заместителей включает заряженные или сильно полярные заместители (СООН, СООС2Н5, СЫ, ЫН3+ВГ, 5С(ЫН2)ЫН2+Вг_), что позволяет ожидать проявления эффекта поля, приводящего к дополнительной стабилизации переходного состояния.

Расщепление вицинально замещенных бромэтанов наблюдается не только в случае реакции с тиомочеви-ной в диметилформамиде, но и в других растворителях, таких как метанол, этанол, этилацетат, уксусная кислота, а также в случае других нуклеофильных реагентов (тиофенолят натрия, тиосульфат натрия) [27].

Высокая чувствительность метода радиохромато-

20 40 60

Глубина превращения, %

Рис. Содержание промежуточных в-бромалкилизотиомочевин Вг(СН2)„:,58С(МОМ1:,+Вг п = 2 (Г), п = 3 (2), п = 4 (.?), п = 5 (4) в реакционной смеси при взаимодействии тиомочевины (Со = ОД моль/л) с дибромалканами Вг(СН2>яВг (С0 = 0,05 моль/л) в этаноле при 100 °С

графи и позволяет выявить образование промежуточных сероорганических продуктов. Так, реакция тиомочевины с а,Р~Дибромпроп:ионовой кислотой идет через стадию образования а-бром-Р-(изотиуронийбро-мид)пропионовой кислоты [28]. При проведении реакции в спиртовой среде, уксусной кислоте или без растворителя в качестве основных продуктов реакции, кроме а-бром-Р-(изотиуронийбромид)проп:ионовой кислоты, образуются а,Р-ди(изотиуронийбромид)про-пионовая кислота и гидробромид 2-имино-4-оксо-5-изотиуронийметилтиазолидина. Взаимодействие ди-бромпропиловых эфиров с тиомочевиной также проходит через стадию образования моноизотиурониевых производных [29].

а

ном 21 в этаноле при нагревании идет с отщеплением аминокислоты и образованием 5-этилпсевдотиоги-дантоина [30]. Использование меченой 355-тиомо-чевины 4 позволило зафиксировать в реакционной а

продукт реакции), содержание которого при всех степенях превращения 21 не превышало 2—3% (схема 8).

С целью оптимизации метода синтеза соединений, содержащих в алифатической цепи атом галогена и изотиурониевую группу изучена кинетика взаимодействия [358]-тиомочевины с а,ю-дибромалканами Вг(СН2)„Вг в спирте [18, 31]. Во всех случаях концентрация промежуточного монотиурониевого производного при всех степенях превращения незначительна (рис.).

Вг

О

Л

он

н,м ын, о

Г^ ОН

ЫН

о 21

н„ы ын„

* т *

4

ЫН

■Г

о

о 22

'Б = 35 Б

он

У

ЫН

Схема 8

Вг-(СН2)- Вг

Н2Ы ЫН2

Т

Б

п = 2 НВг

ЫН+Вг-

Вг-(СН2)п-Б

ЫН

ЫН3+Вг-

Н2Ы ЫН2

Т

Б

п = 3

НВг

ЫНз+Вг

Вг ЫН,

НЫ

Б — (СН2)п—

ЫН

п = 1

ЫН+Вг-

- ЫН4Вг

Б Б

Л..Л.

Н2Ы Ы ЫН2Вг

Схема 9

Вг'

Нм В:

Б

¿Л

Вг

Н+

Н2ЫЧ 23

-Н+

т —■

НЫ

23(основание)

Схема 10

Н2Ы

Б

ЫН Вг

-НВг

ЫН

24

Бромметилтиуроний бромид — продукт замещения одного атома брома в бромистом метилене — вследствие его крайне незначительного содержания в смеси <

лить не удалось. Реакция осложнена образованием побочных продуктов. В случае 1,2-дибромэтана и 1,3-дибромпропана интермедиат циклизуется с образованием 2-амино-2-тиазолина и 2-амино-5,6-дигид-ро-4//-1,3-тиазина соответственно. В случае бромистого метилена диизотиурониевое производное также циклизуется, лишь реакции 1,4-дибромбутана и 1,5-дибромпентана протекают гладко и приводят в конеч-

ном итоге только к диизотиурониевым продуктам (схема 9).

Была изучена циклизация гидробромида 8-2-бром-этилизотиомочевины 23, меченного 35б или 14с в различных средах [18, 31]. В муравьиной кислоте циклизация соединения 23 не идет. Добавление эквивалентного количества ЫаОН в водный раствор соли 23 при комнатной температуре (или при 0 °с) быстро приводит к образованию циклического продукта. Очевидно, возможность и скорость циклизации определяется равновесием А (схема 10). В растворителях, обладающих значительной основностью, скорость образования

Таблица 2

Относительные константы скорости (&оти.) циклизации гидробромида в-бромэтилизотиомочевины 23 (Со = 0,1 моль/л) в различных растворителях при 100 °С

Растворитель к* п оти. Растворитель к* п оти.

Формамид 42 Метанол 0,6

ГМФТА 18 Этанол 0,45

дмсо 11 о2о 0,45

Этанол—вода (1 : 1) 1,2 н- Пропан ол 0,4

Н20 1 Ацетон итр ил 0,0002

^отн, ^растворитель/^ЬО

2-амино-2-тиазолина 24 оказалась максимальной (табл. 2).

При изучении скорости циклизации гидробромидов 8-(2-замещенных-3-аминопропил)изотиомочевин в соответствующие 5-замещенные 2-амино-5,6-ди-гидро-4//-1,3-тиазины установлено, что скорости реакций описываются уравнением для односторонней реакции первого порядка и увеличиваются в ряду заместителей Н < ОН < С1 < Вг. Скорость циклизации [358 ]8-(3-аминопроп:ил)изотиомочевины (АПТ) значительно меньше скорости циклизации [358]8-(2-ами-ноэтил)изотиомочевины [32]. Введение метальных групп в молекулу АПТ в Р-положение к аминогруппе или остатку изотиомочевины увеличивает скорость циклизации очевидно за счет создания более жестко закрепленных конформаций, способствующих благоприятному расположению реакционных центров до-норной аминогруппы и электрофильного центра тиу-рониевой группы.

С использованием 358-гуанидиноалкантиолов различного строения установлено [33], что эти соединения при нагревании в воде без доступа кислорода необратимо превращаются в производные дигидротиа-зина или тиазолина (схема 11).

(СН2)п

НЫ. БН

-ЫН,

(СН2)п

Н№

ЫН

^/(СН^ &

- 8-

H2N + ЫН2 Я = Н, Ме, 1л: я = 0, 1 Схема 11

Скорости циклизации описываются кинетическими уравнениями для односторонних реакций первого порядка. Увеличение расстояния между функциональными группами в молекуле приводит к существенному замедлению скорости реакции. Скорость реакции зависит от рН среды. Концентрация буфера, добавки Г)20 и Д£-аланина практически не влияют на скорость реакции.

Исследованы превращения гетероциклов тиазоли-нового 25 и дигидротиазинового 26 рядов в уреидоал-кантиолы 27 в щелочных водных растворах [34] (схема 12).

Эффективные константы скорости реакции рассчитывали по уравнению для односторонней реакции первого порядка. Оказалось, что шестичленные гете-роциклы 26 в этих условиях менее устойчивы, чем пятичленные. На прочность связи 8—С(2) тиазолино-вого кольца в условиях гидролиза оказывают влияние алкильные заместители. Так, наличие метального заместителя у атома С(5) дестабилизирует соединение. В то же время алкильные заместители у атома С(4) практически не влияют на скорость гидролиза гетеро-цикла.

(СН2)п

ЫН2 25, 26

+ Н2О

ОН"

1 (СН2)п 2

т т*

* _ хттт

/С

Н^ О

27

Я1 = Н, Ме, 1л: Я2 = Н, Ме, Е1; я = 0 (25), 1 (26)

•8 = 358

Схема 12

Изучен сольволиз 2-амино-4-этил-2-тиазолина 28 и 2-амино-4-метил-5,6-дигидро-4Я-1,3-тиазина 29 в водных растворах в присутствии избытка аммиака [34]. Основными продуктами реакции в этих условиях являются соответствующие 2(3)-гуанидиноалкантио-лы, которые были выделены в виде дисульфидов 30, а также гуанидиноалкантритиокарбонатов 31 (схема 13).

Среди побочных продуктов реакции аммонолиза гетероциклов обнаружены в незначительных количествах соответствующие аминоалкантиолы и гуанидин. Продукты щелочного гидролитического расщепления производных гетероциклов — соответствующие уреи-доалкантиолы — не обнаружены. Наибольший выход 2(3)-гуанидиноалкантиолов 30 наблюдали при 2—2,5-кратном избытке гидроксида аммония.

(СН2)п

ГУ

я

+ ЫН4ОН

ЫН2 28, 29

СБ,

(СН2)п

X

н2Ы о

[О]

я

(СН2)п

Г

я

СБ,-V

/С

' (СН2)п (СН2)п к

кт п с г

Н2Ы ЫН 31

V /с

НЫ ЫН2 Н2Ы 30

ЫН

Я = Н, Ме, Е1; я = 0 (28), 1 (29); *8 = 358

Схема 13

Перегруппировка циклических изотиомочевин

Дигидробромид 8-(2-бром-3-аминопропил)изотио-мочевины 31 при нагревании в водном растворе цик-лизуется с образованием гидробромида 2-амино-5-бром-5,6-дигидро-1,3-тиазина 32 [35]. Это соединение, в свою очередь, претерпевает перегруппировку с сужением цикла, превращаясь в гидробромид 2-амино-5-бромметил-2-тиазолина 33 и гидробромид 2-амино-5-гидроксиметил-2-тиазолина 34 [36]. Синтезированы различные соли [358]2-амино-5-бром- и [358]2-амино-5-хлор-5,6,-дигидро-1,3-тиазинов и ра-диохроматографически изучена кинетика тиазин-тиазолиновой перегруппировки в зависимости от природы уходящей группы, кислотности среды и добавок нуклеофильных реагентов [37] (схема 14).

Br

Br

NH

S'

Л,

H2N NH

2 HBr 31

H2O 100 oC

Br

H2O

^^N 100oC

NH2 «HBr 32

OH

S^N

NH2 «HBr

33

Схема 14

syN

NH2«HBr 34

В апротонных полярных растворителях (ацетон, ДМФА, ДМСО) перегруппировка практически не наблюдается. В полярных протонных растворителях, таких как метанол, этанол, пропанол-2 перегруппировка также не идет. Подходящий растворитель, в котором наблюдается перегруппировка солей 2-ами-но-5-галогензамещенных-1,3-тиазинов с заметной скоростью, — это вода.

Анализ кинетических данных для перегруппировки солей дигидротиазинов в водных растворах показал, что скорости реакции описываются уравнением для односторонней реакции первого порядка (по дигидро-тиазину) и зависят от температуры и характера добавок, присутствующих в реакционной смеси [37]. Так, гидробромид 2-амино-5-бром-5,6-дигидро-1,3-тиазина 32 при повышении температуры реакционной среды с 80 до 100 °С перегруппировывается примерно в 5 раз быстрее, а в присутствии 1 экв. бромида аммония — в три раза медленнее. В 4 раза быстрее при перегруппировке реагирует гидробромид 5-бромпроизводного 32 по сравнению с гидробромидом 2-амино-5-хлор-5,6-дигидро-1,3-тиазина. Это объясняется большей легкостью гетеролиза связи С—Hal в случае, когда Hal = Вг.

Экспериментами с двойной радиоактивной меткой (35S и 36С1) показано [38], что в сольволитической изомеризации [358]2-амино-5-хлор-5,6-дигидро-4//-1,3-тиазина 35 в 50% водном этаноле в присутствии 10-кратного избытка хлористого натрия, меченного

хлором 36С1, наблюдается эффект «внутреннего возврата» анионов хлора (то есть содержание перегруппированного и меченного только серой 35Б 2-амино-5-хлорметил-2-тиазолина в реакционной смеси существенно превосходит количество этого же, но дважды меченного гетероцикла) (схема 15).

С1

СГ

Na36Cl ^ Et0H/H,0

\ 11, \ 11, 35

~I

sYn

NH, 18a

*S = 35 S Схема 15

Полученные экспериментальные данные позволили сделать выводы относительно механизма дигидро-тиазин-тиазолиновой перегруппировки.

Перегруппировка шестичленного цикла в пяти-членный происходит с участием атома серы, причем скорость реакции существенно зависит от степени депротонирования амидиновой группировки гетероцикла, в рассредоточении положительного заряда в которой также должен участвовать атом серы. Атака атома серы на реакционный центр происходит по внутримолекулярному б'^-механизму с образованием контактной ионной пары. Это позволяет объяснить значительную степень возврата анионов хлора в исходный тиазин. По-видимому, ионизация связи С—Hal протекает с синхронным взаимодействием 3р-электронов атома серы с возникающим положительным зарядом на атоме углерода. Такое взаимодействие приводит к сульфониевой структуре, которая атакуется нуклеофилами, присутствующими в реакционной смеси.

При изучении сольволиза гидробромида 2-амино-5-бромметил-2-тиазолина 33, меченного 35S, в воде и 50%-м водном этаноле при 100 °С удалось обнаружить в реакционной смеси продукт перегруппировки с расширением цикла — соответствующий 5-бромди-гидротиазин (максимальное содержание 10—12%) [39], что свидетельствует об обратимости данной перегруппировки.

Перегруппировка циклических дитиокарбаматов

При исследовании реакции сероуглерода с основаниями 2,3-дигалогенпроп:иламинов 36 в эфире было обнаружено, что в ходе этой реакции образуется смесь изомерных циклических дитиокарбаматов: 5-галоген-3,4,5,6-тетрагидро-1,3-тиазин-2-тионов 37 и 5-гало-генметилтиазолидин-2-тионов 38 [40] (схема 16). Ско-

+

рость реакции существенно зависит от природы галогена в исходном соединении 36.

Ш,

1)№0Н , Н20

2) СБ,, Е^О

X

X

+

ын

¥

Б

37а, Ь

I

38а, Ь

X = С1 (а), Вг (Ь) Схема 16

При изучении свойств полученных соединений было установлено, что 5-галогентетрагидротиазины 37 при нагревании в спиртах (метанол, этанол, пропа-нол-2) перегруппировываются в изомерные тиазоли-дины, при этом изомеризация 5-бромзамещенных 37Ъ протекает намного быстрее, чем 5-хлорзамещенных 37а (схема 17).

X

X

Г

Б

КН

-X-

яон, г

Б

ын яон, г

х:

т

Б

Б

37а, Ъ

X

т

Б

38а, Ъ

X = С1 (а), Вг (Ь) Схема 17

Подобная перегруппировка не наблюдается при замене галогена в исходном тиазине на водород. Исключительное образование 5-галогенметилтиазоли-дин-2-тионов и отсутствие среди продуктов перегруппировки 4-галогенметилпроизводных свидетельствует

о взаимодеиствии реакционного центра только с находящимся в Р-положении атомом серы. Таким образом движущая сила реакции связана с участием атома серы, которое приводит к образованию промежуточной бициклической эписульфониевой структуры.

Для более детального выяснения особенностей нуклеофильного участия атома серы в рассматриваемой системе была исследована кинетика тетрагидро-тиазин-тиазолидиновой перегруппировки с помощью метода радионуклидной диагностики. Для этого были получены 5-галоген-3,4,5,6-тетрагидро-1,3-тиазин-2-тионы и 5 - галоген метилтиазол и дин - 2-тион ы, меченные 35Б из дигалогенпропиламинов и [358]серо-углерода по методикам, разработанным для нерадиоактивных соединений.

Изучена зависимость скорости перегруппировки от растворителя, температуры и исходной концентрации реагента. Анализ кинетических данных показал, что скорость реакции достаточно хорошо описывается уравнением первого порядка для односторонних реакций (табл. 3). На это указывает и независимость константы скорости перегруппировки от исходной концентрации реагента на примере 5-бромтетрагидро-1,3-тиазин-2-тиона 37ь (табл. 4).

Таблица 4

Константы скорости перегруппировки (к) соединения 37Ь в этаноле при 80 °С и разных исходных концентрациях реагента

Со • 103, моль/л Л-10«, с^1

1,76 78,1 ±4,6

0,88 75,6 ±6,1

0,44 76,2 ± 7,3

Таблица 3

Константы (к) скорости перегруппировки 5-галогентетрагидро-1,3-тиазин-2-тионов (Со = 0,001 моль/л), протекающей в различных условиях

Соединение Растворитель к-10«, с 1

60 °С 65 °С 70 °С 80 °С

37а Этанол 0,42 ± 0,05 ± ± 2,13 ± 0,15

37а Метанол ± ± - -

37Ь Этанол ± ± ± ±

37Ь Метанол 15,3 ± 1,4 ± - -

Как видно из приведенных данных, скорость перегруппировки 5-галогентетрагидро-1,3-тиазин-2-тионов 37а,Ь зависит от полярности растворителя, температуры, а также от природы галогена в исходном соединении. Такая зависимость может быть объяснена не только большей легкостью ионизации связи углерод-галоген в случае связи С—Вг, чем в случае С—С1, но еще и тем, что движущей силой перегруппировки тиазин-2-тионов 37а,Ь, вероятно, является эффект участия соседнего атома серы. Такое участие атома серы возможно, если атом галогена находится в экваториальном положении относительно плоскости кольца тиазина. Положение конформационного равновесия кресло—кресло для этих соединений было определено на основании спектра ЯМР 1I I методом усреднения ширины сигнала (и> = Е/нн) протона Нх. Содержание экваториального конфор-мера в 5-хлортетрагидро-1,3-тиазин-2-тионе было оценено в 30%, а в 5-бромтетрагидро-1,3-тиазин-2-тионе в 40% [41]. Перегруппировка 5-бромтиазин-2-тио-на 37Ь, меченного 358, в присутствии десятикратного избытка ЫаС1, меченного 36С1, при нагревании в этаноле, не привела к изменению скорости реакции. Появления атомов 36С1 у атома С(5) 5-бромтетрагидро-1,3-тиазин-

2-тиона и у атома С(6) образующегося при этом 5-бромметилтиазолидин-2-тиона обнаружено не было. Вероятно, раскрытие эписульфониевого цикла нук-леофилами в данной реакции не осуществляется меж-молекулярно.

Следует отметить, что рассматриваемая перегруппировка не сопровождается образованием продуктов сольволиза. Это свидетельствует о невысокой полярности бициклического катионоидного интермедиата, по-видимому представляющего собой тесную ионную пару. Скорее всего, перегруппировка протекает согласовано через переходное состояние без полного разделения зарядов на каком-либо из атомов, и медленная стадия образования интермедиата является лимитирующей.

Введение заместителя с положительным индуктивным эффектом к атому С(3) тиазинового цикла должно способствовать более быстрому образованию эписульфониевого иона за счет делокализации положительного заряда и привести к увеличению скорости перегруппировки. Для подтверждения этого предположения из гидробромида Ы-метил-2,3-дибромпро-пиламина 39 были синтезированы 5-бром-З-метил-3,4,5,6-тетрагидротиазин-2-тион 40 и 5-бромметил-З-метилтиазол и дин - 2-тион 41 (схема 18).

н2о

Вг 39

4NH»HX

I

Ме

1)NaOH

2)CS2 , Et20

40

41

Схема 18

Установлено, что 3-метилтиазинтион 40 претерпевает перегруппировку при нагревании в спиртах (метаноле, этаноле) в изомерный тиазолидин с большей скоростью, чем незамещенный 5-бромтетрагидро-1,3-тиазин-2-тион 37Ь (табл. 5).

Таблица 5

Константы (к) скорости перегруппировки замешенных 5-бромтиазинов, протекающей в различных условиях

Соединение

Условия реакции

Л-10«, с^

Растворитель Температура, °С

а Перегруппировка в спирте не проходит

Из данных спектра ЯМР 'Н 5-бром-З-метил-3,4,5,6-тетрагидротиазин-2-тиона 40 методом усредненной ширины сигнала (и> = Е/нн) протона Нх. определено наличие 60% экваториального конформера в смеси. Следовательно, в данной структуре преобладает конформация, способствующая образованию эписульфониевого иона. Таким образом, введение алкильного заместителя оказало существенное влияние на соотношение конформеров.

Полученные экспериментальные константы скорости перегруппировки 5-бром-3,4,5,6-тетрагидро-1,3-тиазин-2-тиона 37Ь и 5-бром-3-метил-3,4,5,6-тет-рагидро-1,3-тиазин-2-тиона 40 сопоставлены с описанными ранее [36] данными для основания 2-амино-5-бром-5,6-дигидро-4//-1,3-тиазина 32 и гидробромида 2-амино-5-бромдигидротиазина 32, полученными в сходных условиях за исключением соли тиазина, и имеющими относительно близкие по своим значениям константы (табл. 5).

На основании данных, представленных в таблице 5, тиазины можно расположить в следующий ряд:

Br

Вг Br Br

л<л<л

<< I I < 1 1 <

S^N S^NH

Y i Y Me

11 NH2 -

Y

NE 32

NH2«HBr S

37b 32

(основание)

S

40

32 Вода 80 66,7 ± 2,8"

37Ь Этанол 80 77,2 ± 6,3

32(основание) Этанол 50 ±

40 Этанол 50 ±

Результаты этих исследований хорошо согласуются с электронными эффектами гетероатомов и заместителей гетероциклов.

Изучение данной реакции с использованием соединений, меченных 35S, позволили сделать следующие выводы: в полярных протонных растворителях перегруппировка проходит по механизму, сходному с перегруппировкой 5-галоген-2-аминотиазинов — через образование эписульфониевого иона. Скорость перегруппировки зависит от строения тиазина, температуры реакции, полярности растворителя, и, вероятно, от преобладающей конформации, в которой существуют исходные тиазиновые циклы.

Использование радионуклида серы 35S в физической химии и для биохимических исследований

Существуют и другие направления использования органических соединений, меченных 35S.

Для изучения активности катализаторов также применяют радиоизотопные методы [42]. Катализаторы на основе молибдена, используемые для дегидро-сульфирования, одни из наиболее важных среди промышленных катализаторов. Новый подход для изучения структуры таких катализаторов и влияния серы на действие катализатора связан с использованием изотопа 35S. Исследование поведения серы в реакциях дегидросульфирования и обмена с сульфированными катализаторами Мо/А1203 и Со-Мо/А1203 позволяет выяснить в условиях реакций процесс образования активных центров и влияние различных добавок на каталитическую активность [43]. Так, например, изучена реакция дегидросульфирования дибензотиофена,

меченного 358, с помощью серии Мо/А1203 катализаторов, содержащих 6—20% молибдена, при температуре 280—380 °С [44]. Установлено, что механизм дегид-росульфирования и природа активных центров не зависит от количества молибдена. В то же время применение Со в качестве активатора Мо/А1203 катализаторов для данной реакции при 200—400 °С приводит к увеличению каталитической активности, что может быть объяснено образованием большего количества активных центров [45]. Оказалось, что количество аккумулированной серы для всех катализаторов увеличивается с ростом температуры; при 400 °С атомы Со и Мо присутствуют как Со958 и Мо82 [46]. Для той же реакции были применены катализаторы Яи3(СО)12-ЗС80Н/А1203 (содержание Ли 0-20%) [47]. Наилучшие результаты получены для катализатора с 16%-м содержанием Ян. Применение катализаторов на основе благородных металлов [48], например Р1/А1203 дало те же результаты, что и в случае обычных Со-Мо катализаторов. Однако платиновый катализатор почти не содержит серы, что свидетельствует о разных механизмах действия катализаторов.

Следует отметить вновь возросший в последние годы интерес к использованию соединений, меченных 358, в биохимии [49]. Получение соединений с фиксированной локализацией метки, характеризующихся высокой степенью чистоты, высокими и сверхвысокими удельными активностями позволило использовать эти соединения для исследований как фундаментального, так и прикладного характера. В биосинтезе глутатиона, природного трипептида, применен сульфат натрия, меченный 358, с высокой удельной радиоактивностью (> 1200 Ки/ммоль). Это позволило получить [358]глутатион с удельной активностью > 1000 Ки/ммоль [11]. Хемоферментным способом с использованием серной кислоты с удельной активностью > 1200 Ки/ммоль синтезирован [358]метионин с такой же высокой удельной активностью [50].

В 1996 г. впервые был получен 5'-дитиофосфорил-олигонуклеотид, меченный 358. Изучение его свойств показало, что он устойчив к действию щелочной фос-фатазы и не является субстратом для Т4 полинуклео-тидкиназы [51].

Применение 35Б позволило установить все стадии биосинтеза биотина, входящего в состав активного центра ферментов, катализирующих карбоксилирова-ние пируват-карбоксилазы и ацетил-КоА-карб-оксилазы [10].

Полученный с высокой удельной радиоактивностью эффективный непептидный антагонист рецептора окситоцина [358](1-(1-(2-(2.2.2-трифторэтокси)-4-(1-метил-сульфонил-4-оксип:иперидинил)фенилаце-тил)-4-пиперидинил)-3,4-дигидро-2(1//)-хинолинон был использован для изучения фармакологии рецептора окситоцина тканей человека [52]. Меченные 35Б соединения использовались для изучения взаимодействия метаболитов и рецепторов [53], устойчивости моносахаридных производных ¿-цистеина в присутствии гепатотоксина (ацетаминофенона) [54], для исследования механизма действия нерибосомной пептид-синтазы [55], как радиолиганды в нейрохимии и ней-рофармакологии [56—59].

Работа выполнена при финансовой поддержке

Российского фонда фундаментальных исследований

(проекты: N° 05-04-48794, N° 05-03-08140-офи-а).

ЛИТЕРАТУРА

1. Chechev V.P., Egorov A.G. Applied Radiation and Isotopes, 2000, v. 52, p. 601-608.

2. Химия органических соединений серы. Общие вопросы. Под ред. Л.И. Беленького. М.: Химия, 1988, 319 с.

3. Tarver Н., Schmidt C.L.A. J. Biol. Chem., 1939, v. 130, p. 67-80.

4. Tarver //., Schmidt C.L.A. Ibid., 1942, v. 146, p. 69-84.

5. Doerge D.R. J. Labell. Compounds and Radiopharm., 1989, v. 25, № 9, p. 985-990.

6. Slama J.Т., Simmons A.M., Hernandes T.M., Keenan R.W. Anal. Biochem., 1993, v. 209, № 1, p. 143-149.

7. Ткаченко C.E., Трофимова Т.П., Федосеев В.М. Химия гете-роцикл. соедин., 1999, т. 34, № 8, с. 1107—1111.

8. Миклухин Т.П. Изотопы в органической химии. Киев: АН УССР, 1961, 731 с.

9. Asselin J., Phaneuf S., Watterson D., Haiech J. Anal. Biochem., 1989, v. 178, № 1, p. 141-147.

10. Marquet A., Frappier F., Guillerm G. e. a. J. Am. Chem. Soc., 1993, v. 115, № 6, p. 2139-2145.

11. Jayachandran N., Asokan K.P., Unny V.K.P. J. Labell. Compounds and Radiopharm., 2000, v. 43, p. 971—975.

12. Филатов Э.С., Симонов Е.Ф. Физико-химические и ядерно-химические способы получения меченых соединений и их идентификация. М.: Энергоиздат, 1987, 142 с.

13. Ramires F. de М., Jimenez-Reyes M., Bulbulian S. J. Radioanal, and Nucí. Chem., 1999, v. 241, № 1, p. 225-226.

14. Squires R.F., Casida J.E., Saederup E. Mol. Pharmacol., 1983, № 23, p. 326-336.

15. Korpi E.R., Lüddens H. Ibid., 1993, № 44, p. 87-92.

16. Korpi E.R., Lüddens H., Seeburg P.H. Eur. J. Pharmacol., 1992, v. 211, p. 427-428.

17. Ткаченко C.E., Толстой Д.Д., Чурилин B.C., Федосеев В.М. Ж. орган, химии, 1982, т. 18, № 7, с. 1551-1553.

18. Ткачежо С.Е. Дисс. ...канд. хим. наук. М., 1998, 120 с.

19. Ткачежо С.Е., Карпов H.A., Федосеев В.М. Радиохимия, 2000, т. 42, № 3, с. 193-209.

20. Федосеев В.М., Мандругин A.A., Семененко М.Н. Химия гетероцикл. соедин., 1984, № 1, с. 44—47.

21. Федосеев В.М., Чурилин B.C., Малько В.И. и др. Докл. АН СССР, 1974, т. 218, с. 1381-1384.

22. Федосеев В.М., Голубев A.A., Мандругин A.A. и др. Органические соединения, меченные радиоактивными изотопами. В 2 ч. 4.1. М.: ЦНИИ Атоминформ, 1982, с. 65-75.

23. Ткаченко С.Е., Трофимова Т.П., Карпов H.A., Федосеев В.М. Радиохимия, 1997, т. 40, № 2. с. 146-149.

24. Василевский В.Л., Федосеев В.М., Силаев А.Б. Ж. общей химии, 1962, т. 32, с. 2269-2273.

25. Василевский В.Л., Свердлов Е.Д., Федосеев В.М., Силаев А.Б. Там же, 1963, т. 33, с. 2397-2401.

26. Рязанцев Г.Б., Лыс Я.П., Федосеев В.М. Ж. орган, химии, 1991, т. 27, вып. 5, с. 900-904.

27. Рязанцев Г.Б., Сухов Л.Л., Лыс Я.П., Федосеев В.М. Вестн. МРУ, Сер. 2. Химия, 1994, т. 35, № 6, с. 502-511.

28. Федосеев В.М., Завода М., Силаев А.Б. Ж. общей химии, 1962, т. 32, с. 3425-3432.

29. Федосеев В.М., Сулима А. В., Силаев А.Б. Там же, 1962, т. 32, с. 3432-3439.

30. Силаев А.Б., Федосеев В.М., Василевский B.JI. Там же, 1960, т. 30, с. 3464-3468.

31. Ткаченко С.Е., Сальников Д.И., Лыс Я.И. и др. Ж. орган, химии, 1983, т. 19, № 5, с. 988-995.

32. Мандругин A.A., Федосеев В.М. Там же, 1976, т. 12, № 5, с. 1018-1021.

33. Мандругин A.A., Федосеев В.М., Хомутов С.М. и др. Химия гетероцикл. соедин., 1987, № 11, с. 1572—1575.

34. Мандругин A.A., Федосеев В.М., Семененко М.Н., Хомутов С.М. Там же, 2000, № 11, с. 1550-1556.

35. Федосеев В.М., Филиппович И.В. Ж. общей химии, 1964, т. 34, с. 1556-1561.

36. Федосеев В.М., Чурилин B.C., Лыс Я.И. Вестн. МГУ. Сер. 2. Химия, 1971, № 5, с. 611-614.

37. Федосеев В.М., Чурилин B.C., Ткаченко С.Е. Докл. АН СССР, 1971, т. 197, с. 1351-1352.

38. Федосеев В.М., Чурилин B.C., Ткаченко С.Е. и др. Там же, 1977, т. 235, с. 1327-1330.

39. Федосеев В.М., Чурилин B.C., Ткаченко С.Е., Камаев A.B. Химия гетероцикл. соедин., 1978, № 7, с. 997—999.

40. Трофимова Т.П., Федосеев В.М., Ткаченко С.Е. Там же, 2002, № 12, с. 1733-1734.

41. Самошин В.В., Пушин А.Н., Трофимова Т.П. и др. Ж. орган, химии, 1987, т.23, вып. 4, с. 900-901.

42. Godo М., Ishihara A., Kabe Т. Energy & Fuels., 1997, № 11, p.724—729.

43. Kabe Т., Qian W., Ishihara A. Catalysis Today, 1997, v. 39, p. 3-12.

44. Qian W., Zhang Q., Okoshi Y. e. a. J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1997, v. 93, № 9, p. 1821-1826.

45. Kabe Т., Ishihara A., Qian W., Godo M. Catalysis Today, 1998, v. 45, p. 285-291.

46. Qian IV., Ishihara A., Aoyama Y, Kabe T. Applied Catalysis A: General., 2000, v. 196, № 1, p. 103-110.

47. Ishihara A., Godo H., Kanamori R. e. a. Ibid., 1999, v. 182, № 1, p. 345-355.

48. Qian W., Yoda Y, Hirai Y. e. a. Ibid., 1999, v. 184, № 1, p. 81-88.

49. Бланке M.A. Меченые атомы в биохимии. Под ред. А.Н. Шамина. М.: Наука, 1988, 120 с.

50. Boullais С., Riva М., Noel J.-P. J. Labell. Compounds and Radiopharm., 1997, v. 39, № 7, p. 621-624.

51. Seeberger P.H., Jorgensen P.N., Bankaitis-Davis D.M. e. a. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, № 40, p. 9562-9566.

52. Lemaire W., O'Brien J.A., Burno M. e. a. Eur. J. Pharmacol., 2002, v. 450, p. 19-28.

53. Kwiatkowski S., Crocer P.J., Chavan A.J. e. a. Tetrahedron Lett., 1990, v. 31, № 15, p. 2093-2096.

54. Roberts J.C., Phaneuf H.L., Dominick P.K. e. a. J. Labell. Compounds and Radiopharm., 1999, v. 42, p. 485—495.

55. Gehring A.M., Могу I., Perry R.D. Walsh C.T. Biochemistry, 1998, v. 37, p. 11637-11650.

56. Canney D.J., Holland K.D., Levine J.A. e. a. J. Med. Chem., 1991, v. 34, № 4, p. 1460-1467.

51. Dean D.C., Nargund R.P., Pong S.-S. e. a. Ibid., 1996, v. 39, № 9, p. 1767-1770.

58. Korpi E.R., Seeburg P.H., Luddens H. J. Neurochem., 1996, v. 66, p. 2179-2187.

59. Rabe II., Picard R., Uusi-Oukari M. e. a. Eur. J. Pharmacol., 2000, v. 409, p. 233-242.