CC BY
23УДК 615.9:322
ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ И АЛЛЕРГИЗИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ (POTENTILLA ALBA L.) ЭКСТРАКТА СУХОГО
В.В. Бортникова1, Л.В. Крепкова1, П.Г. Мизина1,Т.А. Гуськова2
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (ФГБНУ ВИЛАР), 117216, г. Москва, Российская Федерация 2Центр трансфера фармацевтических технологий имени М.В Дорогова Ярославского государственного педагогического университета им. К.Д. Ушинского, 150010, г. Ярославль, Российская Федерация
В результате комплексного изучения аллергенности и иммунотоксичности лапчатки белой экстракта сухого показано, что в тестах общей системной анафилаксии (анафилактический шок) и активной кожной анафилаксии, проведенных на морских свинках альбиносах, а также в реакции гиперчувствительности замедленного типа на мышах экстракт не обладает сенсибилизирующим действием. При изучении иммунотоксических свойств установлено, что исследуемый экстракт проявляет стимулирующее действие на первичный гуморальный иммунный ответ в терапевтической дозе 3 мг/кг и не оказывает влияния на эффекторы клеточного звена иммунитета экспериментальных животных.
Ключевые слова: Potentilla alba L., экстракт сухой, аллергенность, иммунотоксичность.
Введение. В последние годы лекарственные средства растительного происхождения, в частности, созданные на основе лапчатки белой (Potentilla alba L) семейства розоцветных (Rosaceae), входящие в состав БАДов, используют в комплексной терапии гипотиреоза наряду с гормонами щитовидной железы [1]. Позитивный опыт применения экстракта лапчатки белой в качестве БАДа, определил перспективу разработки на его основе нового лекарственного средства терапии гипотиреоза. В качестве лекарственного сырья у этого растения используют корни и корневища. По литературным данным, подземная часть этого растения содержит углеводы (крахмал), иридоиды, сапонины, фе-нолкарбоновые кислоты, флавоноиды (кверце-тин), дубильные вещества (галлотанин), а также элементарный йод и анионы йодистой кислоты, микроэлементы - марганец, медь, цинк, селен [2]. Получение сухого экстракта из высушенных корней и корневищ культивируемого растения лапчатки белой (Potentilla alba L.), изучение его химического состава, методов стандартизации, привело к созданию на его основе нового лекар-
ственного средства в виде готовых лекарственных форм - капсул и таблеток для приема внутрь [3].
Одним из обязательных этапов доклинических токсикологических исследований новых фармакологических веществ является оценка их безопасности, в частности, иммунотоксичности и ал-лергенности.
Целью исследования явилась доклиническая оценка иммунотоксичности и аллергенности лапчатки белой экстракта сухого, впервые полученного во ВНИИ лекарственных и ароматических растений.
Материалы и методы исследования. Выбор методов при изучении аллергенности и имму-нотоксичности лапчатки белой экстракта сухого определялся требованиями, изложенными в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств», 2012 г [4] и международной практикой изучения иммуно-токсичности.
Эксперименты выполнены на морских свинках альбиносах (самцы, масса тела 350-400 г), мышах линии СБА и ВАЬВ/е (самцы, масса тела 18-20 г),
Бортникова Валентина Васильевна (Bortnikova Valentina Vasilevna), кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела токсикологии ФГБНУ ВИЛАР, г. Москва, bortnikova.v@yandex.ru
Крепкова Любовь Вениаминовна (Krepkova Lyubov Veniaminovna), кандидат биологических наук, зав. отделом токсикологии ФГБНУ ВИЛАР, г. Москва, krepkowa2011@yandex.ru
Гуськова Татьяна Анатольевна (Guskova Тatyana Änatolievna). заслуженный деятель науки РФ, чл.-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела доклинических исследований Центра трансфера фармацевтических технологий имени М.В. Дорогова Ярославского государственного педагогического университета имени К.Д. Ушинского, г.Ярославль, tagus@rambler.ru
Мизина Прасковья Георгиевна (Mizina Praskovia Georgievna), доктор фармацевтических наук, профессор, заместитель директора ФГБНУ ВИЛАР, г. Москва, mizina-pg@yandex.ru
полученных из питомника филиал «Андреев-ка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА, Московской области и ФГБНУ ВИЛАР. Содержание, кормление и уход за животными проводили в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Европейская конвенция, Стасбург,1986) [5]. Протокол эксперимента был одобрен биоэтической комиссией ФГБНУ ВИЛАР. Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела.
В работе использовали лапчатки белой экстракт сухой, полученный в отделе фитохимии ФГБНУ ВИЛАР и представляющий собой аморфный порошок светло-коричневого цвета с розоватым оттенком. Полученный экстракт лапчатки белой стандартизован по сумме фе-нольных соединений в пересчете на (+)-катехин, содержание которых в образце составило 48% [6].
На основании ранее проведенного изучения фармакологической активности лапчатки белой экстракта сухого рекомендована суточная терапевтическая доза составляла « 3 мг/кг. В данном исследовании морским свинкам альбиносам, мышам линии СВА и БЛЬБ/е исследуемый экстракт вводили в дозах 3 и 30 мг/кг (соответственно суточная и 10-ти кратная суточная терапевтическая) в виде 0,03% и 0,3% водных растворов, приготовленных ех 1ешроте. Контрольные животные получали эквивалентные объемы изотонического раствора №С1.
Потенциальные аллергизирующие свойства лапчатки белой экстракта сухого были оценены с помощью следующих тестов: реакции общей системной, активной кожной анафилаксии и реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Для воспроизведения реакции общей системной анафилаксии (анафилактический шок) животных контрольной (п=8) и двух опытных групп (п=16) иммунизировали согласно схеме: 1-ая инъекция - подкожно, 2-я и 3-я - внутримышечно, через день в область бедра. На 21-й день после начала сенсибилизации опытным животным внутривенно вводили разрешающую дозу экстракта, равную суммарной сенсибилизирующей, а контрольным - 0,9% раствор №С1, после чего регистрировали развитие анафилактической реакции. Учет интенсивности проявления анафилактического шока проводили в индексах по Weig1e.
В тесте активной кожной анафилаксии, проведенной на морских свинках-альбиносах (п=24), сенсибилизированным животным (согласно выше указанной схеме) на 21 день от начала сенсибилизации внутривенно вводили 0,5 мл 1% раствора красителя синего Эванса. Через 20 минут
после этого в предварительно выстриженный участок кожи вводили внутрикожно исследуемый экстракт в двукратном разведении в объеме 50 мкл. Для контроля реакции тому же животному на другой выстриженный участок кожи вводили 50 мкл 0,9% NaCl. Через 30 минут всех животных подвергали эвтаназии в СО2-камере и на внутренней стороне кожи, в месте введения тест-препарата и 0,9% NaCl (контроль n=8), определяли размер синих пятен.
В тесте реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на мышах линии BALB/c было создано две экспериментальные группы по 10 животных в каждой: I группа - контроль (ПАФ с раствором Хенкса) в соотношении 1:1; II группа - лапчатки белой экстракт сухой, доза эквивалентная 10 мМ раствору в полном адъю-ванте Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1. Оценку реакции ГЗТ проводили через 24 часа после разрешающей инъекции экстракта путем измерения величины отека лапок при взвешивании «контрольной» и «опытной» лапок с последующим расчетом индекса реакции (ИР) по формуле:
ИР = Р- Р / Р 100, где Р - масса опытной лап-
о к к ■ ' ^ о
ки, Рк - масса контрольной лапки.
Влияние изучаемого препарата на гуморальный иммунитет оценивали по тесту генерации антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титру гемагглютининов в сыворотке крови у мышей, иммунизированных внутрибрюшин-ным введением эритроцитов барана (ЭБ) в оптимальной иммуногенной дозе (5х107) клеток на мышь. На 5-е сутки после иммунизации животных декапитировали и в суспензии клеток селезенки определяли число АОК методом локального гемолиза в модификации Cunningham, а в сыворотке крови - титр гемагглютининов в реакции гемагглютинации, поставленной в микро-титраторе Такачи. Реакция основана на способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, агглютинировать эритроциты барана, используемые в качестве антигена. Титр антител (наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается отчетливая агглютинация ЭБ) выражали величиной log2T.
Действие лапчатки белой экстракта сухого на состояние Т-клеточного иммунитета исследовали по тесту индукции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на мышах линии СВА. Для постановки реакции ГЗТ мышей I - V групп (n=50) иммунизировали подкожным введением в межлопаточную область эритроцитов барана в дозе (2x108 ) клеток на мышь. Мышам II и III групп за сутки до иммунизации ЭБ (день «-1») внутрибрюшинно вводили лапчатки белой экстракт сухой в дозах 3 и 30 мг/кг. Мышам IV и V групп исследуемый экстракт в тех же дозах вво-
дили внутрибрюшинно через 24 часа после инъекции антигена (ЭБ, день «+1»). Контрольные мыши (I группа) получали внутрибрюшинно соответствующие количества 0,9% раствора NaCl по схеме (ЭБ, день «+1»). На 5-е сутки после иммунизации все животные получали субплантарно в левую заднюю лапу разрешающую инъекцию ЭБ в дозе (7 х108) клеток на мышь в объеме 50 мкл (опытная лапа). В подушечку контрольной лапы вводили 50 мкл 0,9% раствора NaCl.
Полученные результаты подвергали статистической обработке методом вариационной статистики с применением «t» - критерия Стьюдента. Достоверность различий с контролем считали при Р<0,05. Статистические данные обрабатывали с помощью программы Office Excel.
Результаты и обсуждение. Иммунизация морских свинок альбиносов экстрактом лапчатки белой в дозах 3 и 30 мг/кг с последующим внутривенным введением разрешающей дозы исследуемого экстракта на 21-й день после начала сенсибилизации не вызывала у животных реакции общей системной анафилаксии. Анафилактический индекс у животных контрольной и опытных групп составил менее единицы (табл. 1).
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что введение лапчатки белой экстракта сухого морским свинкам альбиносам в дозах 3 и 30 мг/кг не вызывало реакции общей системной анафилаксии.
В тесте реакции активной кожной анафилаксии, после внутрикожного введения разрешающей инъекции раствора лапчатки белой экстракта сухого, у животных подопытных и контрольной групп, диаметр окрашенного пятна статистически значимо не отличался, реакция гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) была отрицательная (табл. 2).
Интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к химическим соединениям и их длительность зависят от сроков формирования и сочетанного действия различных субпопуляций Т-супрессоров, подавляющих реакцию ГЗТ. Если при индукции реакции ГЗТ мышам вводить химическое вещество в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), при котором не происходит формирования Т-супрессоров, то появляется возможность выявить даже слабые химические аллергены. В связи с этим в данном исследовании использовали модификацию реакции ГЗТ с применением ПАФ.
Результаты эксперимента показали, что индекс реакции у мышей, сенсибилизированных лапчатки белой экстрактом сухим, не имел статистически достоверных различий по сравнению с соответствующим показателем в контроле (табл. 3).
На основании полученных данных можно сделать вывод, что лапчатки белой экстракт сухой не потенцировал реакцию ГЗТ у мышей.
Таким образом, при изучении потенциальных
Таблица1
Индекс реакции анафилактического шока у морских свинок альбиносов, сенсибилизированных
лапчатки белой экстрактом сухим
Группа животных Число животных в группе Индекс реакции по Weigle
I. Контроль, 0,9% NaCl 8 0,5±0,02
II. Лапчатки белой экстракт сухой, доза 3 мг/кг 8 0,6±0,03
III. Лапчатки белой экстракт сухой, доза 30 мг/кг 8 0,5±0,04
Таблица 2
Выраженность реакции активной кожной анафилаксии у морских свинок, получавших лапчатки
белой экстракт сухой
Группа животных Размер окрашенного пятна, мм
I. Контроль, 0,9% NaCl 4,2 ±0,4
II. Лапчатки белой экстракт сухой, 3 мг/кг 4,8±0,3
III. Лапчатки белой экстракт сухой, 30 мг/кг 5,0 ±0,5
Таблица 3
Индекс реакции ГЗТ у мышей, получавших лапчатки белой экстракт сухой
Группа животных Индекс ГЗТ, M±m / 24 часа
I. Контроль 0,37 ± 0,05
II. Лапчатки белой экстракт сухой 0,25 ± 0,04
Таблица 4
Показатели гуморального иммунного ответа мышей линии СВА при 5-дневном внутрижелудочном
введении лапчатки белой экстракта сухого
Группа Показатели иммунного ответа
животных Абсолютное число АОК на Количество АОК на 106 Титр гемагглюти-
одну селезенку спленоцитов нинов (log2T)
1.Контроль, NaCl 0,9% 258000±17000 1952±127 32,0±5,2
И.Лапчатки белой экстракт сухой, 3 мг/кг 360000±22000** 3079±139** 76,8±15,0*
III. Лапчатки белой экстракт сухой, 30 мг/кг 305000±27000 2586±129* 54,2±8,5
Примечание: * - достоверность различий с контролем (*Р<0,05; **Р<0,01)
Таблица 5
Индекс реакции ГЗТ мышей линии СВА, получавших лапчатки белой экстракт сухой
Группа животных Индекс реакции
I. Контроль, 0,9% NaCl, день «+1» 40,5±4,4
II. Лапчатки белой экстракт сухой, 3 мг/кг, день «-1» 59,2±5,6
III. Лапчатки белой экстракт сухой, 30 мг/кг день «-1» 44,5±4,5
IV. Лапчатки белой экстракт сухой, 3 мг/кг день «+1» 53,9±5,5
V. Лапчатки белой экстракт сухой, 30 мг/кг день «+1» 48,5±4,6
аллергизирующих свойств лапчатки белой экстракта сухого в экспериментах на разных видах лабораторных животных не выявлены статистически значимые различия в результатах между контрольными и подопытными группами. Исследуемый экстракт в диапазоне испытанных доз и схем сенсибилизации не вызывал реакции общей анафилаксии (анафилактический шок) и активной кожной анафилаксии, проведенных на морских свинках альбиносах. Лапчатки белой экстракт, введенный с ПАФ, не потенцировал воспалительную реакцию в тесте гиперчувстви-
тельности замедленного типа у мышей линии ВАLВ/с.
При исследовании влияния лапчатки белой экстракта сухого на процессы антителообразования установлено, что исследуемый экстракт повышал показатели гуморального иммунного ответа у мышей. Количество АОК, как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов в группе животных, получавших экстракт в дозе 3 мг/кг, был значительно выше, чем в контроле. Дополнительно для оценки влияния экстракта на В-клеточное звено иммунитета использовали
реакцию выработки гемагглютининов В-лимфо-цитами иммунокомпетентных органов мышей при их иммунизации ЭБ. Результаты исследований свидетельствуют, что титр гемагглютининов (1с^2Т) возрастал, особенно при введении дозы 3 мг/кг. При увеличении дозы экстракта до 30 мг/кг исследуемый показатель у мышей так же увеличивался, но не имел статистически достоверных различий с контролем (табл. 4).
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии лапчатка белой экстракта сухого на гуморальный иммунный ответ мышей линии СВА.
При исследовании влияния лапчатки белой экстракта сухого на клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ установлено, что исследуемый экстракт не потенцировал индекс реакции ГЗТ у мышей лини CБЛ при однократном введении в дозах 3 и 30 мг/кг при различных схемах введения (табл. 5).
Лапчатки белой экстракт сухой не влиял на эф-
фекторы клеточного иммунитета мышей.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований показали, что 5-кратное внутрижелудочное введение лапчатки белой экстракта сухого в дозах 3 и 30 мг/кг вызывало значительную стимуляцию первичного иммунного ответа у мышей линии СВА, причем более выраженный эффект наблюдался в терапевтической дозе 3 мг/кг. При различных схемах введения исследуемый экстракт не влиял на клеточный иммунитет.
Выводы. 1. Лапчатки белой экстракт сухой не индуцирует аллергические реакции и по своей природе не является потенциальным аллергеном.
2. Лапчатки белой экстракт сухой оказывал стимулирующее действие на первичный иммунный ответа у мышей в дозе 3 мг/кг; в более высокой дозе данный эффект снижался.
3. Изученный экстракт не влиял на клеточный иммунитет.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ефремов А.П. Лапчатка белая-уникальное природное средство для лечения заболеваний щитовидной железы. http://www. endonorm.ru/index.php?id=22
2. Осипов В.И., Поляков Н.А., Сидельников А.Н., Хазиева Ф.М. Проантоцианидины корней и корневищ Potentilla alba ^saceae). Растительные ресурсы.2017; 53(1):114-25.
3. Поляков Н.А., Хазиева Ф.М., Мешков А.И., Коротких И.Н., Осипов В.И. Состав и содержание проантоци-
REFERENCES:
1. EfremovA.P. Potentilla alba is a unique natural product for the treatment of diseases of the thyroid gland. http://www. endonorm.ru/index.php?id=22 (in Russian).
2. Osipov V.I., PolakovN.A., Sidel'nikov A.N., Hazieva F.M. Proanthocyanidins of roots and rhizomes of Potentilla alba (Rosaceae). Rastitel'nye resursy.2017; 53(1):114-25 (in Russian).
3. PolakovN.A., Hazieva F.M., MeskovA.I., Korotkih I.N., Osipov V.I. The composition and content of
анидинов в корнях и корневищах лапчатки белой (Potentilla alba L.). В кн.: Материалы Международного симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты».14-19 мая 2018 г. Москва; М.:ИФР РАН; 2018;347-
4. Миронов А.Н. ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.:Гриф и К.; 2012;51-79.
5. Европейская конвенция о защите позвоночных жи-
proanthocyanldlns In the roots and rhizomes of white Potentilla alba (L.). In the book: Materials Of the international Symposium "Phenolic compounds: fundamental and applied aspects".14 to 19 may 2018 Moscow; M.:IFR RAN; 2018;347-53 (in Russian).
4. 4.Mironov A.N. red. Guidelines for pre-clinical trials of drugs. Part one.M.:Grif i K.; 2012;51-79 (in Russian).
5. European Convention for the protection of vertebrates used for experimental or other scientific purposes
вотных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г). 6. Бурова А.Е., Мешков А.И., Сайбель О.Л. Разработка методик качественного и количественного определения фенольных соединений в сухом экстракте лапчатки белой (Potentilla alba Ь).Мат. V науч.-практ. конф. «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине», М.; 2017; С.59-2.
(Strasbourg, 18 March 1986) (In Russian). 6. 6.Burova A.E., Meskov A.I., Sajbel O.L. Development of methods for qualitative and quantitative determination of phenolic compounds in the dry extract of the white cinquefoil (Potentilla alba L.).Mat. V nauch.- prakt. Conf. "Modern aspects of the use of plant and natural raw materials in medicine», M.; 2017; S.59-2 (in Russian).
V.V. Bortnikova1, L.V. Krepkova1, P.G. Mizina1, T.A. Guskova2
INVESTIGATION OF IMMUNOTOXICITY AND ALLERGENIC PROPERTIES OF DRY
EXTRACT OF POTENTILLA ALBA L.
1All-Russian Research Institute of Medicinal and Aromatic Plants, 117216, Moscow, Russian Federation 2 M.V. Dorogov Center for Transfer of Pharmaceutical Technologies, K.D. Ushinsky Yaroslavl State Pedagogical University, 150010, Yaroslavl, Russian Federation.
The comprehensive study of allergenicity and immunotoxicity of dry extract of Potentilla alba L. has shown that the extract has no sensitizing effect in tests of the general systemic anaphylaxis (anaphylactic shock) and active skin anaphylaxis conducted on Guinea pigs albinos, as well as in the reaction of delayed hypersensitivity in mice. In the study of immunotoxic properties, it has been found that the extract has a stimulating effect on the primary humoral immune response at a therapeutic dose of 3 mg / kg and has no influence on the effectors of the cellular immunity of experimental animals.
Keywords: Potentilla alba L., dry extract, allergenicity, immunotoxicity
Материал поступил в редакцию 18.06.2018 г.
