CC BY
24УДК 615.099-616.2
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ
аллергизирующих свойств и иммунотоксичности
ПРЕПАРАТА ОцИЛЛОКОКцИНУМ
Л.П. Коваленко, А.В. Таллерова, О.С. Кузнецова, А.С. Лапицкая
фГБу «НИИ фармакологии имени В.В. закусова» РАМН 125315, г. Москва, Российская федерация
Проведено экспериментальное изучение аллергенности и иммунотоксичности препарата оциллококцинум. Иммунизация морских свинок оциллококцинумом в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг по стандартной схеме или в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) не вызывала у животных системной реакции анафилаксии или аллергических реакций замедленного типа. Однократное введение оциллококцинума в/ж в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг мышам линии CBA не вызывало значимых изменений по сравнению с контролем в реакции воспаления на кон-канавалин А (Кон А).
При оценке иммунотоксических свойств оциллококцинума препарат вводили мышам внутрижелу-дочно 14 дней в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг. Введение оциллококцинума мышам F1 (СВА x C57BL/6) в дозе 500 мг/кг приводило к достоверному увеличению индекса массы тимуса на 25,1 %. У мышей гибридов Fj (CBA x C57BL/6) курсовое введение оциллококцинума в дозах 100 и 500 мг/кг вызывало выраженное увеличение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов, у мышей линии C57BL/6 значимо стимулировало гуморальный иммунный ответ.
Таким образом, оциллококцинум в исследованном диапазоне доз не оказывает аллергизирующего и иммунотоксического действия, стимулирует фагоцитарную активность макрофагов и гуморальный иммунный ответ, что можно рассматривать как один из важных механизмов действия препарата, применяемого при гриппе и других ОРВИ.
Ключевые слова: препарат оциллококцинум, реакция системной анафилаксии, гиперчувствительность замедленного типа, реакция воспаления на Кон А, фагоцитоз, хемилюминесценция, гуморальный иммунный ответ, клеточный иммунный ответ, иммунотоксичность.
Введение. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется 1,5 миллиарда случаев острых респираторных заболеваний, причем наиболее высокий уровень заболеваемости отмечен у детей дошкольного и младшего школьного возраста, посещающих организованные коллективы.
Эффективность применения препарата оциллококцинум, сокращающего продолжительность заболевания при гриппе и других
ОРВИ, была показана в клинических исследованиях, проведенных во Франции и Германии [1]. При проведении клинических испытаний среди часто болеющих детей в России был отмечен положительный эффект препарата у детей, относящихся к группам риска и сделано заключение о целесообразности использования оциллококцинума для профилактики в детских садах и для семейной профилактики
Коваленко Лариса Петровна (Kovalenko Larisa Petrovna), доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории лекарственной токсикологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук, kovalenko.larisa@mail.ru
Таллерова Анна Вадимовна (Tallerova Anna Vadimovna), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории лекарственной токсикологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук, annatall@rambler.ru
Кузнецова Ольга Сергеевна (Kuznetsova Olga Sergeevna), младший научный сотрудник, сотрудник лаборатории лекарственной токсикологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук, olgapharm@inbox.ru
Лапицкая Анастасия Сергеевна (Lapitskaya Anastasya Sergeevna), кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории фармакологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук, lapitskaia.n@mail.ru
в период острого сезонного подъема заболеваемости ОРВИ [2].
Было показано, что у детей оциллококцинум усиливал выработку интерферона-а и индуцированного интерферона-у, стимулирующего макрофаги и натуральные киллеры и обладающего способностью индуцировать противовирусный иммунитет [3].
В связи с перспективами широкого использования препарата в настоящей работе была проведена оценка аллергизирующих свойств и им-мунотоксичности оциллококцинума.
Материалы и методы исследования. Выбор методов, использованных при изучении аллергизи-рующих свойств и иммунотоксичности препарата оциллококцинум, определялся требованиями, изложенными в сборнике «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012) и международной практикой изучения иммунотоксичности. Все методы верифицированы и используются в экспертных и научных исследованиях иммунотоксичности синтетических и природных соединений [4-6].
Эксперименты выполнены на самцах морских свинок альбиносов массой 250-300 г и самцах мышей линии СВА, С57БЬ/6 и гибридов (СВА х С57БЬ/6) массой 18-20 г, полученных из питомников РАМН, после двухнедельного карантина. Животных содержали в условиях вивария ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН в соответствии с санитарными нормами, предусмотренными «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравосоцразвития РФ от 23 августа 2010 г №708 н) при свободном доступе к воде и сбалансированному по питательности брикетированному гранулированному комбикорму фирмы «МЭСТ». Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела.
В работе использовали оциллококцинум (производитель - лаборатория Буарон, Франция, серия 113504). Согласно инструкции по применению, препарат оциллококцинум принимают перорально 2-3 раза в день раз в день по 1000 мг (суточная доза 2000-4000 мг). В связи с этим дозы препарата при введении морским свинкам альбиносам и мышам линий СВА, С57БЬ/6 и гибридам (СВА х С57БЬ/6) были определены равными 100 мг/кг и 500 мг/кг. Препарат разводили в дистиллированной воде. В предварительной серии экспериментов на 6 морских свинках альбиносах массой 250-300 г изучали кожно-раздра-жающее действие от внутрикожного (в/к) введения 0,05 мл оциллококцинума в концентрациях 1 мг/мл, 10 мг/мл и 100 мг/мл. На выстриженных правом и левом боках спины животным вводили в/к оциллококцинум и 0,05 мл стерильного физиологического раствора в качестве контро-
ля. Внутрикожное введение оциллококцину-ма в концентрации 100 мг/мл вызывало у 2-х из 6-ти свинок кожно-раздражающее действие, в концентрациях 1 мг/мл и 10 мг/мл кожно-раз-дражающего действия не выявлено, поэтому в качестве разрешающей дозы для реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) было выбрано в/к введение препарата в концентрации 10 мг/мл.
При постановке анафилактического шока морским свинкам альбиносам вводили оциллокок-цинум по стандартной схеме в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг [4], контрольным животным вводили соответствующий объем дистиллированной воды. Учет интенсивности анафилактического шока проводили в индексах по Weigle [4]. Реакцию воспаления на Кон А проводили на мышах самцах линии СВА. Оциллококцинум вводили однократно в/ж в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг. Животным контрольной группы аналогичным способом вводили стерильный физиологический раствор.
При оценке иммунотоксических свойств оцил-лококцинума препарат вводили мышам в/ж 14 дней в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг. Контрольным животным вводили соответствующий объём растворителя. Для изучения фагоцитоза пе-ритонеальных макрофагов были использованы частицы коллоидной туши. Через 24 часа после окончания введения оциллококцинума фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов оценивали по интенсивности захвата ими частиц туши, введенной животным внутрибрюшинно в виде 0,05% суспензии в объеме 2 мл. Определение антител в реакции гемагглютинации (РПГА) к эритроцитам барана (ЭБ) выполнено на мышах двух оппозитно реагирующих на ЭБ линий СВА и C57BL/6.
Подготовка к работе первичных данных и расчеты проводились в среде пакета статистических программ (PSP) STATISTICA (версия 6.0) для WINDOWS. Статистический анализ данных проводился с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Иммунизация морских свинок 1-й и 2-й опытных групп оцилло-кокцинумом в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг при внутрисердечном введении разрешающей дозы препарата на 16 день опыта не вызывала у животных симптомов системной реакции анафилаксии. Иммунизация морских свинок 3-й и 4-й опытных групп оциллококцинумом в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) не приводила к аллергическим реакциям замедленного типа при внутрикожном введении разрешающей дозы препарата на 21-й день опыта.
Однократное в/ж введение препарата оцилло-кокцинум в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг не вызывало у мышей линии СВА значимых изменений
реакции воспаления на Кон А по сравнению с контрольной группой (табл. 1).
При оценке действия оциллококцинума на массу и клеточность лимфоидных органов мышей гибридов установлено, что введение препарата в течение 14 дней в дозе 500 мг/кг приводит к достоверному увеличению массы тимуса на 25,1 % и не влияет на массу селезёнки и подколенных лимфоузлов (табл. 2).
Двухнедельное введение оциллококцинума в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг вызывало выражен-
ное увеличение фагоцитарной активности пери-тонеальных макрофагов в 4,1 и 3,9 раза, соответственно (табл. 3).
Внутрижелудочное 14-ти дневное введение оциллококцинума в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг не оказывало достоверного влияния на параметры хемилюминесценции полиморфоядерных гранулоцитов, активированных опсонизирован-ным зимозаном (табл. 4).
Введение оциллококцинума в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг мышам линии С57ВЬ/6, слабореагиру-
Таблица1
влияние оциллококцинума на реакцию воспаления на Кон А
Доза препарата Число животных в группе индекс реакции
Контроль дистиллированная вода 10 13,0 ± 2,0
Оциллококцинум 100 мг/кг 10 12,6 ± 2,2
Оциллококцинум 500 мг/кг 10 8,6 ± 2,0
Таблица 2
индекс масса и клеточность лимфоидных органов (% от массы тела) мышей-самцов Р1 (CBA'C57BL/6) при пероральном введении оциллококцинума в течение 14-ти дней
органы лимфоидной системы п=10 Контроль оциллококцинум (100 мг/кг) оциллококцинум (500 мг/кг)
Индекс массы (%) клеточность п* 10® клеток мл*торгат Индекс массы (%) клеточность п * Ю6 клеток ш * г органа Индекс массы (%) клеточность п * Ю6 клеток * горгана
Селезенка 0,416 ± 0,015 70,1±5,2 0,408 ± 0,007 69,5±4,1 0,402 ± 0,010 72,5±4,9
Тимус 0,183 ± 0,010 23,0±3,3 0,203 ± 0,011 25,1±4,3 0,229 ± 0,010** 28,6±3,9
Подколенные лимфоузлы 0,048 ± 0,007 4,9±0,5 0,052 ± 0,003 5,2±0,3 0,044 ± 0,005 4,8±0,7
Примечание: п - количество животных; ** - р<0,01 по сравнению с контрольной группой по критерию Стьюдента
Таблица 3
влияние оциллококцинума на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов при пероральном введении препарата в течение 14 дней
Доза оциллококцинума Фагоцитарный индекс (усл.ед.) Уровень значимости
Контроль (п=10) 5,7 ± 1,2
14-дневное введение в/ж 100 мг/кг(п=10) 23,1 ± 3,3 р<0,01
14-дневное в/ж введение 500 мг/кг (п=10) 22,7 ± 6,7 р<0,05
Примечание: п - количество животных в группе р - достоверность различий по сравнению с контрольной группой по I - критерию Стьюдента
ющей на тимусзависимый антиген (ЭБ), вызывало значимую стимуляцию гуморального иммунного ответа, введение оциллококцинума мышам линии СВА не оказывало достоверных изменений антителообразования по сравнению с контролем (табл. 5).
Влияние оциллококцинума на клеточный иммунный ответ изучали по реакции ГЗТ в опытах на мышах гибридах F1(CBAxC57BL/6). Результаты опытов представлены в таблице 6. После пе-рорального введения оциллококцинума в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг в течение 14 дней не обнару-
Таблица4
Влияние оциллококцинума на показатели хемилюминесцентного ответа нейтрофилов на зимозан
Доза оциллококцинума AI, (mv) Уровень значимости S, (ед.) Уровень значимости
Контроль (п=10) 29,5 ± 6,6 23726,9 ± 5186,1
14-дневное введение в/ж 100 мг/кг (n=10) 24,0 ± 5,9 p>0,05 19173,1 ± 4553,1 p>0,05
14-дневное в/ж введение 500 мг/кг (n=10) 18,1 ± 5,8 p>0,05 13489,9 ± 3553,1 p>0,05
Примечание: п - количество животных; А! - показатель уровня активированной хемилюминесценции; Б - интегральный показатель хемилюминесценции.
р - достоверность различий по сравнению с контрольной группой по критерию Стьюдента.
Таблица 5
Влияние оциллококцинума на гуморальный иммунитет (РПГА) при в/ж введении препарата
в течение 14-ти дней
Доза оциллококцинума Величина иммунного ответа при антигенной нагрузке 5 x 107 ЭБ
СБА C57BL/6
100 мг/кг Контроль Опыт Контроль Опыт
5,9 ± 0,2 n=10 6,2 ± 0,2 n=10 4,5 ±0,2 n=10 5,7 ± 0,3 n=10, р<0,05
500 мг/кг 5,9 ± 0,2 n=10 5,7 ± 0,3 n=10 4,5 ±0,2 n=10 5,4 ± 0,3 n=10, р<0,05
Примечание: в таблице представлены средние величины титра антител в 1оё2 п - число животных в группе.
Таблица 6
Влияние оциллококцинума на клеточный иммунитет (ГЗТ) при в/ж введении препарата
в течение 14-ти дней
Доза препарата Индекс реакции: Р - P И = оп „ к х 10 0 % р P к Уровень значимости
Контроль 48,2 ± 5,2, n=10
100 мг/кг 60,8 ± 3,3, n=10 р>0,05
500 мг/кг 57,8 ± 2,9, n=10 р>0,05
жено значимого изменения реакции ГЗТ по сравнению с контролем.
Заключение. Широкому распространению бактериально-вирусных инфекций способствует ослабление иммунитета, в частности защитных многофункциональных свойств фагоцитарных клеток и угнетение лимфоцитарно-макрофа-гальной системы токсичными белками вириона гриппа. Прямая и опосредованная активность макрофагов при вирусных инфекциях определяется их функциональным состоянием, характе-
ризующим их способность поглощать и элиминировать вирусы и инфицированные ими клетки и продуцировать провоспалительные цитоки-ны и интерфероны [7,8]. Выраженное усиление фагоцитарной активности макрофагов и гуморального иммунного ответа под действием оцил-лококцинума можно рассматривать как один из важных механизмов действия препарата. В исследованном диапазоне доз оциллококцинум не обладал аллергизирующими и иммунотоксиче-скими свойствами.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Селькова Е.П., Семененко
Т.А.,Горбачев И.А. Применение Оцил-лококцинума для профилактики гриппа и ОРВИ.Инфекционные болезни.2005; 4(3):74-78.
2. Казюкова Т.В., Панкратов И.В., Самсыгина Г.А., Алев А.С., Дудина Т.А.Возможности семейной профилактики гриппа и острых респираторных вирусных инфекций. Педиатрия. 2010; 89 (65): 112-117.
REFERENCES:
1. Sel'kova E.P., volchetskiyA.L., LapitskayaA.S., Radtsig E.Yu., Ermilova N.v. Oscillococcinum influence on interferonogenesis in frequently sickly children. Pediatriya. 2009; 88 (4): 42-47 (in Russian).
2. kazyukova T.v., PankratovI.v., Samsygina G.A., AlevA.S., Dudina T.A. Possibility of family prevention of influenza and acute respiratory viral infections. Pediatriya. 2010;
3. Селькова Е.П., Волчецкий А.Л., А.С.Лапицкая, Е.Ю.Радциг, Н.В.Ермилова Влияние Оциллококцинума на интер-феронообразование у часто болеющих детей. Педиатрия. 2009; 88 (4): 42-47
4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств Методические рекомендации по оценке аллергизирующих свойств лекарственных средств Часть первая. М.: Гриф и К; 2012, 51- 63.
89 (65): 112-117 (in Russian).
3. Selkova E.P., volchetskiy A.L, Lapitskaya A.S. Radtsig E.Yu., Ermilova N.V.O Oscillococcinum influence on interferon formation in often sick children. Pedi-atriya.2009; 88 (4); 42-47.
4. Guidelines of pre-clinical studies of drugs, 2012 year. Assessment of allergenic properties of drugs. Part Moscow: Grif i K; 2012; 51-63 (in Russian).
5.Руководство по проведениюдокли-нических исследований лекарственных средств Методические рекомендации по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ. Часть первая. М.: Гриф и К; 2012, 64-79.
6.Руководство по проведениюдокли-нических исследований лекарственных средств Методические рекомендации по доклиническому изучению иммунотроп-ной активности фармакологических
5. Guidelines of pre-clinical studies of drugs, 2012 year. Assessment of im-munotoxicology action of pharmacological substances. Part Moscow: Grif i K; 2012; 64-79 (in Russian).
6. Guidelines of pre-clinical studies of drugs, 2012 year. Preclinical studies immu-notropic activity of pharmacological agents. Part Moscow: Grif i K; 2012; 626-656 (in Russian).
веществ. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012; 626- 6
7. Ianova E., Toshkova R., Sekedjieva j.-A plant polyphenol-rich extract restores the suppressed functions of fagocytes in influenza virus-infected mice. Microbes and Infection.2005; 7:391-3
8. Плехова Н.Г. Значение клеток моноцитарно-макрофагальной системы в патогенезе флавивирусных инфекций. Бюллетень СО РАМН: 2007; 4(126):71-77
7. Ivanova E., Toshkova R., Sekedjieva
J.A plant polyphenol-rich extract restores the suppressed functions of fagocytes in influenza virus-infected mice. Microbes and Infection: 2005; 7: 391-398.
8. Plekhova H.G. Implication of monocyte-macrophage system in the pathogenesis of flavivirus infections. Byulleten' SO RAMN: 2007; 126(4):71-77 (in Russian).
L.P. Kovalenko, A.V. Tallerova, O.S. Kuznetsova, A.S. Lapitskaya EXPERIMENTAL STuDY OF ALLERGENIC PROPERTIES AND IMMuNOTOXICITY
of the drug oscillococcinum
Federal State Budgetary Institution «V.V. Zakusov Institute of Pharmacology», Russian Academy of Medical Science,125315, Moscow, Russian Federation
Allergenicity and immunotoxicity of oscillococcinum preparation was experimentally studied. Immunization of guinea pigs with oscillococcinum in doses of 100 mg/kg and 500 mg/kg according to a standard scheme or mixed with complete Freund's adjuvant ( CFA) did not provoke a systemic anaphylactic reactions or delayed allergenic reactions in animals. A single administration of oscillococcinum per os in doses of 100 mg/kg and 500 mg/kg to CBA strain mice did not cause significant changes in comparison with the control in the inflammation response to concanavalin A (Con.A).
To assess oscillococcinum immunotoxic properties, the preparation was perorally administrated to mice in doses of 100 mg/kg and 500 mg/kg for 14 days. Delivery of oscillococcinum in the dose of 500 mg/kg to F1 mice resulted in an authentic increase by 25.1% of thymus mass index. In F1 hybrid mice (CBA x C57BL/6), a course delivery of oscillococcinum induced an expressed increase of peritoneal macrophage phagocytic activity , in C57BL/6 strain mice it significantly stimulated humoral immune response . Thus, oscillococcinum in the dose range investigated does not produce allergenic and immunotoxic action, stimulates macrophage phagocytic activity and humoral response which could be considered one of the most important mechanisms of the preparation action used to cure flu and other acute respiratory viral infections.
Keywords: oscillococcinum preparation, systemic anaphylactic reaction, delayed hypersensitivity,inflammation response to concanavalin A, phagocythosis, hemi luminescence, cellular immune response, immunotoxicity
Материал поступил в редакцию 30.01.2014 г.
