CC BY
12
ГЕНЕТИКА
УДК 577.218
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА НР1 С НЕТРАНСЛИРУЕМЫМИ РЕГУЛЯТОРНЫМИ ОБЛАСТЯМИ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ ГРУППЫ GYPSY У DROSOPHILA MELANOGASTER
А.Р. Лавренов, Л.Н. Нефедова, А.И. Ким*
Кафедра генетики, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 *e-mail: aikim57@mail.ru
В работе исследовано in vitro взаимодействие рекомбинантных белков-паралогов семейства НР1 (HP1a, HP1b и HP1c) с 5'-нетранслируемыми регуляторными областями ре-тротранспозонов группы gypsy у Drosophila melanogaster: gypsy, Springer, Tirant, ZAM, Rover и 17.6. С использованием конкурентной ДНК подобраны условия, позволяющие добиться специфичного связывания с матрицей. Показано, что белки семейства HP1 эффективно связываются с 5'-нетранслируемой областью ретротранспозонов, имеющих в ее составе тандемные повторы. Обнаружено, что повторы абсолютно необходимы для связывания белка HP1a с 5'-нетранслируемой областью мобильных генетических элементов Tirant и ZAM. Отсутствие повторов в случае элемента ZAM или их число менее двух — в случае Tirant делает невозможным такое взаимодействие. Таким образом, наличие тандемных повторов в 5'-нетранслируемой области ретротранспозонов группы gypsy является важным инструментом регуляции их транспозиции гетерохроматиновыми белками.
Ключевые слова: гетерохроматиновые белки, дрозофила, gypsy, мобильные элементы, ретротранспозоны, нетранслируемые участки
Гетерохроматиновый белок НР1 (Heterochro-matin Protein 1), кодируемый геном Su(var)2-5, принимает активное участие в формировании ге-терохроматина и ассоциированном подавлении активности генов и мобильных генетических элементов (МГЭ). В геномах большинства эукарио-тических организмов имеется, по меньшей мере, один паралог гена Su(var)2-5, в то время как в геноме Drosophila melanogaster обнаружено пять па-ралогов гена hpl: hpla (Su(var)2-5), hplb, hplc, hpld (rhino), hple [1]. Белки, кодируемые этими генами, имеют высококонсервативную сходную структуру, содержащую два ключевых домена: N-терминаль-ный хромодомен (chromo), участвующий в связывании НР1 с N-концевым доменом гистона H3K9, и С-терминальный домен (chromoshadow), отвечающий за гомо- и гетеромеризацию НР1 [2].
Анализ экспрессии паралогов hpl у D. melanogaster выявил, что hpla, hplb и hplc экспрессиру-ются во всех тканях взрослой мухи, а hpld и hple — только в герминальных тканях самок и самцов соответственно [3]. Исследование хромосомной локализации белков семейства НР1 у дрозофилы показало, что паралоги HP1 имеют различное положение в хроматине: белок НР1а ассоциирован с гетерохроматином, белок НР1с обнаруживается исключительно в районах транскрипционно активного хроматина, а НР1Ь встречается как в гетеро-так и в эухроматине [4, 5]. Белок HP1d локализован в гетерохроматине, в областях, содержащих кластеры
малых РНК. Он является важным компонентом процессинга piPHK [1, 6]. Белок НР1е изучен мало. Известно, что он экспрессируется в терминальных тканях самцов. Предполагается, что каждый из паралогов выполняет специфичную функцию, а не дублирует уже имеющуюся. В то время как НР1а и HPlb подавляют транскрипцию генов, НР1с вызывает прямо противоположный эффект, активируя транскрипцию [4, 5]. Показано, что выключение гена Su(var)-2-5 (НР1а) является летальным [7], а инактивация гена rhino (HP1d) приводит к стерильности у самок [8].
Считается, что белок HP1 способен напрямую связываться с двух- и одноцепочечными молекулами ДНК, но точно установить участки взаимодействия пока не удалось. В некоторых работах утверждается, что белки HP1 связываются в основном с промо-торной областью генов [9]. Отмечается, что при пониженном содержании белка HP 1а у мутантов линии D. melanogaster Su(var)2-505 наблюдается снижение уровней метилирования H3K27me3 в областях промоторов ряда генов, в то же время не наблюдается изменений в З'-нетранслируемых областях тех же генов [10].
Белки семейства НР1 принимают участие не только в регуляции активности генов, но и в сай-ленсинге МГЭ. Подавление экспрессии МГЭ у D. melanogaster может осуществляться путем непосредственной компактизации участков хромосом, содержащих МГЭ, или путем РНК-интерференции.
Известно, что эти два пути тесно связаны между собой: РНК-интерференция играет важную роль в формировании гетерохроматина и, по-видимому, направляет его формирование [11]. Методом DamID было показано, что у D. melanogaster белки НР1 взаимодействуют с ДКП-ретротранспозонами, т.е. ретротранспозонами, содержащими длинные концевые повторы (ДКП), — 17.6, Springer, McClintock и др. [12], однако экспериментов, доказывающих непосредственное взаимодействие, довольно мало. В другой работе показали взаимодействие HP 1a c ретротранспозонами, не имеющими ДКП, — HeT-A и TART [13]. Обнаружено, что HP1a ассоциирован с РНК, транскрибируемой с повторяющихся последовательностей ДКП gypsy, ДКП mpia и других ДКП-ретротранспозонов [6]. Продемонстрировано прямое взаимодействие белка НР1а с 5'-нетранс-лируемой областью (5'-UTR, 5' untranslated region) ДКП-ретротранспозона ZAM в эксперименте in vitro [14]. Предполагается, что взаимодействие осуществляется благодаря имеющимся в повторах ретро-транспозона инициаторным АТ-богатым участкам. Хромодомен НР1а напрямую узнает эти участки, образуя ДНК-белковый комплекс, от которого в обоих направлениях распространяются НР1а-ДНК-филаменты.
Показано, что ДКП-ретротранспозоны группы gypsy с тремя открытыми рамками считывания (эррантивирусы) обладают специфичностью интеграции в определенные последовательности ДНК. Группа gypsy подразделяется на три подгруппы в зависимости от специфичности интеграции: ZAM, Idefix и gypsy [15]. Кроме того, некоторые ДКП-ре-тротранспозоны ассоциированы с гетерохромати-ном. В частности, инсерции ретротранспозона ZAM у D. melanogaster обнаруживаются преимущественно в районах гетерохроматина [16].
Известно, что 5'-UTR ДКП-ретротранспозо-нов содержат тандемные повторы разного нуклео-тидного состава, роль которых в регуляции активности этих МГЭ слабо изучена. Целью данной работы стало исследование роли тандемных повторов в 5'-UTR ДКП-ретротранспозонов подгрупп ZAM, Idefix и gypsy группы gypsy D. melano-gaster во взаимодействии с ключевыми белками семейства НР1 - HP1a, HP1b и HP1c.
Материалы и методы
Получение рекомбинантньх белков HP1a, HP1b
и HP1c. Для амплификации полноразмерных копий генов семейства hp1 использовали пары прай-меров: HP 1a (5'-TATATACATATGATGGGCAAGA AAA-3' и 5'-TTAATTCTCGAGATCTTCATTATCA-3'), HP1b (5'-TATATACATATGGCCGAATTCTCAG-3' и 5'-TTAATTCTCGAGGTCATCCGCATCC-3'), HP1c (5'-TATATACATATGGTTAAAAACGAGC-3' и 5'-TTAATTCTCGAGTTGATTTTCCGCC-3'). Клонирование генов проводили в плазмиде для экспрессии и очистки белков pET30 (Novagen, Германия)
по сайтам рестрикции NdeI и Notl. Рестрикцию проводили с применением рестриктаз NdeI и NotI фирмы (Thermo Fisher Scientific, США) по протоколам производителя. Для лигирования с вектором использовали ДНK-лигазу фага T4 (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу фирмы.
Для получения рекомбинантных белков штамм Escherichia coli BL21 трансформировали рекомби-нантными плазмидами pET30::hp1a, pET30::hp1b и pET30::hp1c, содержащими полноразмерные копии генов hp1a, hp1b и hp1c соответственно. Выделение и очистка белков проводилась по методике, описанной нашей лабораторией ранее в статье Kузьмина и др. [17].
Диализ растворов белков проводили в диализных трубках SERVAPOR (Serva, Германия). 1 мл раствора белка в буфере для элюции с колонки HisTrap FF диализовали против 200 мл раствора (10 мМ Tris-HCl, S0 мМ KCl, pH 7,4) при 4°С в трех сменах буфера: по З ч в двух первых сменах и ночь в последней смене. Выпавший осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин на охлаждаемой центрифуге S41SR (Eppendorf, Германия) при 12000 g, супернатант собирали и использовали в дальнейшей работе.
Измерение концентрации белка проводили с помощью набора реактивов "Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination" (Sigma, США) по протоколу фирмы.
Фрагменты ДНK ретротранспозонов получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Матрицей для ПЦР служила хромосомная ДН^ выделенная из особей D. melanogaster лабораторной линии SS из коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Для амплификации использованы пары праймеров, подобранные в программе UGENE (ugene.net) к области, охватывающей ДKП и не-транслируемую область МГЭ: Springer (S'-TTAACTAAGTTAACCG-З' и S'-ATGACTCGCTCATGG-3'); 17.6 (S'-GTTCTTGAGCCATTT-З' и S'-TGACATATTCACAT-3'); gypsy (S'-AACAACTAACAATG-3' и S'-CCCAACTCATTGGTT-3'); Rover (S'-TAACATAATATGCT-3' и S'-GACCATATTTGAGT-3'); ZAM (S'-TTACCGACCCATC-3' и S'-GATCGTGTAACTCT-3'); Tirant (S'-CGGACACTCAACC-3' и
S'-AATTCATTTGAGGTTACTTA-3' - для полноразмерного фрагмента регуляторной области); (S'-GTCGACTGAAAGTGACTAGGA-3' и
S'-CGGTACAGTACGTGGTGTATT-3' - для амплификации участков, содержащих разное количество тандемных повторов (6 полиморфных вариантов)). Для поиска тандемных повторов использовали компьютерную программу Tandem Repeats Finder (tandem.bu.edu). Для амплификции конкурентной ДНK использовали праймеры Œ4680
(5'-GAACTTCGATGGCAGTGATC-3' и 5'-GGTTGCCAATGCTCTTGAAC-3'; 5'-ATGGATCCCGAGTTCGTG-3' и 5'-CTACTTCTTCCAAGCACTAGC-3').
ПЦР проводили с использованием Taq-поли-меразы (Евроген, Россия) (2,5 ед/мкл), концентрация MgCl2 — 2,5 мМ, каждого праймера — 0,4 мкМ. ПЦР проводили в амплификаторе ТП4-ПЦР-01 "Терцик" (ДНК-Технология, Россия). Схема этапов ПЦР: предварительный этап плавления ДНК — 2 мин при 95°С; 30 циклов — плавление 30 сек при 95°С, отжиг праймеров 1 мин при 55—60°С (в зависимости от температуры плавления праймеров) и синтез 1—2 мин (в зависимости от длины фрагмента) при 72°С; заключительная инкубация 10 мин при 72°С.
Фрагменты ДНК, которые планировали использовать для связывания, выделяли из агарозного геля с помощью набора Cleanup Mini (Евроген, Россия), в соответствии с протоколом, приложенным к набору.
Связывание белков HP1 с 5-UTR ретротран-спозонов методом гель-шифт. Связывание белка с ДНК проводили в пробирке объемом 0,5 мл в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, 0,5 M KCl pH 7,4 в течение 30—60 мин при 0°С. Очищенные фрагменты (100 нг) смешивали с 8 мкг белка. В некоторых экспериментах, проведенных на нетранс-лируемой области элементов ZAM и Tirant, использовали концентрацию белка 0,125 мкг/мкл. В смеси присутствовала конкурентная проба ДНК — амплификат гена CG4680. Связывание анализировали в 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ). Оценка эффективности связывания проводилась визуально, после окрашивания ПААГ в растворе бромистого этидия. Об образовании ДНК-белковых комплексов можно было судить по снижению количества целевых фрагментов и появлению ДНК-белковых комплексов, обладающих низкой элек-трофоретической подвижностью в геле.
В качестве контроля использовался бычий сывороточный альбумин (Sigma-Aldrich, США). Белок добавлялся в реакционную смесь вместо HP1 до конечной концентрации 0,5 мкг/мкл.
Результаты и обсуждение
Ранее было установлено, что у D. melanogaster ретровирусы (эррантивирусы) с тремя открытыми рамками считывания (ОРС) и производные от них ДКП-ретротранспозоны группы gypsy с двумя ОРС проявляют специфичность в отношении выбора ДНК-мишени [15], в связи с чем ДКП-ретро-транспозоны группы gypsy можно разделить на три подгруппы: gypsy, ZAM и Idefix. ДКП-ретротранс-позоны подгруппы Idefix встраиваются в ТА-повторы (от 3 до 20 динуклеотидов), ДКП-ретротранспо-зоны подгруппы gypsy — преимущественно встраиваются в последовательность 5'-ATАТAT-3', а ДКП-ретротранспозоны подгруппы ZAM предпочитают для встраивания мишень 5'-GCGCGC-3'.
Известно, что инсерции ДКП-ретротранспо-зонов обнаруживаются преимущественно в гетеро-хроматине [18]. Мы решили выяснить, различаются ли представители трех подгрупп ретротранспозонов группы gypsy по способности связываться с гетерохроматиновыми белками семейства НР1. Проанализировав последовательности ДКП-ретротранспо-зонов Springer, gypsy, Rover, 17.6, Tirant и ZAM в секвенированном геноме D. melanogaster, мы обнаружили, что пять из них имеют тандемные повторы в 5'-UTR (таблица). По биоинформатическим данным, у элемента Springer в нетранслируемой области тандемные повторы отсутствуют, а элемент gypsy содержит наименьшее число повторов среди представленных элементов и наименьшую их протяженность. МГЭ Tirant — единственный МГЭ с варьирующим числом повторов (до шести). Примечательно, что и у ZAM, и у Tirant повторы характеризуются меньшим содержанием нуклеотидов А/Т, чем у других ДКП-ретротранспозонов.
Для исследования взаимодействия 5'-UTR ДКП-ретротранспозонов с гетерохроматиновыми белками нами были выделены и очищены белки HP1a, HP1b и HP1c (рис. 1А). Далее были поставлены эксперименты по связыванию этих белков с ДНК ДКП-ретротранспозонов in vitro. В качестве контроля использовали бычий сывороточный аль-
Таблица
Содержание и нуклеотидный состав тандемных повторов в нетранслируемых областях ДКП-ретротранспозонов группы gypsy
МГЭ Длина тандемного повтора Число повторяющихся модулей в нетранслируемой области Длина области, занимаемой тандемными повторами (п.н.) Содержание A/T в тандемных повторах
Springer — 0 — —
gypsy 109 2 229 73,36%
Rover 151 3 462 76,84%
17.6 6 39 251 96,85%
Tirant 102 1—6 102—610 54,10%
ZAM 307 2,3 699 65,76%
А HPla HPlb HPlc
¡¡¡а . *
«■g» тример
jpii димер димер
мономер мономер
ZAM
HPla - НИаБСА белок — + + + ДНК
В CG4680
KCl
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 M
Рис. 1. А - электорофореграмма белков HP1a, HP1b и HP1c. Белок HP 1a представлен в виде тримера и димера, HP 1b -в трех вариантах макромолекулярных комплексов (моно-, ди-и тример); HP1c представлен в виде мономера и димера. Б - контрольная электрофореграмма. Связывание белка HP1a с амплификатами элемента ZAM. Знаком "+" обозначено присутствие в пробе ДНК; "-" - отсутствие. Во всех пробах использовался 0,5 М KCl. В - электрофореграмма эффективности связывания белка HP 1a с амплификатами гена Œ4680 (900 и 1100 п.н.) при различной концентрации KCl (от 0,1 до 0,5 М). БСА - бычий сывороточный альбумин
бумин, который добавляли к матрице вместо белка НР1а (рис. 1Б). В качестве матрицы для связывания использовали амплификаты, содержащие 5'-UTR элементов ZAM, Tirant, 17.6, Rover, gypsy и Springer (рис. 2). Для исследования взаимодействия использовали метод анализа изменения электро-форетической подвижности ДНК в ПААГ (гель-шифт). Помимо целевых фрагментов в общую смесь
для связывания добавляли конкурирующую ДНК, с которой ДНК-белковые комплексы образовываться не должны. Конкурирующая ДНК выступает контролем, подтверждающим, что исследуемый белок связывается специфически, игнорируя конкурента. В качестве конкурирующей ДНК использовали амплификат гена D. melanogaster Œ4680, полученный с двух пар праймеров таким образом, чтобы образовывались фрагменты двух близких размеров - 900 и 1100 п.н. (рис. 1В). Этим мы проверяли возможность избирательного связывания белка НР1а с фрагментами разной длины. В ходе проведения экспериментов было обнаружено, что при низкой ионной силе раствора (0,1-0,2 М KCl) белок HP 1a эффективно (неспецифично) связывается с конкурирующей ДНК (рис. 1В). Однако при концентрации KCl 0,4-0,5 М связывание конкурирующей ДНК с белком HP1a не происходит. При этом никакой избирательности белка НР1а в отношении длины ДНК мы не обнаружили. В дальнейших экспериментах по связыванию использовали 0,5 М KCl. В работе [19] исследовали стабильность комплексов ДНК-HP! в различных составах солей. При высоких концентрациях KCl стабильность снижалась. Однако в наших экспериментах высокая концентрация KCl не влияла на стабильность ДНК-белковых комплексов, образованных белком НР1 и регуляторными областями ретротранспозонов, в отличие от ситуации с комплексами, образованными при участии контрольных фрагментов ДНК.
Кроме этого, было исследовано влияние различных концентраций белка НРЫ на силу связывания. В результате проведенных экспериментов выявлено, что белок HP 1a в концентрации 0,5 мкг/мкл способен связываться с 5'-UTR всех исследуемых МГЭ. Однако предпочтительнее HP1a связывается с нетранслируемыми областями элементов, содержащими тандемные повторы, богатые A/T-после-довательностями (Tirant, ZAM, rover и 17.6). Хуже всего прошло связывание белка HP 1a с 5'-UTR МГЭ Springer, не содержащей повторов (рис. 2). На электрофореграмме можно заметить неполное истощение его целевого продукта. Отметим, что используемая нами конкурирующая ДНК не содержит в своем составе повторяющихся последовательностей.
Анализ связывания белков HP1b и HP1c показал, что оба белка способны образовывать ДНК-белковые комплексы с регуляторными областями МГЭ gypsy, Springer, Rover и 17.6 (рис. 2). Однако в случае белка HP1c связывание с фрагментами происходит слабее в сравнении с опытами, проведенными с белками HP1a и HP1b. Примечательно, что только в случае элементов ZAM и Tirant сила связывания белков НР1а, HP1b и HP1c с матрицей была одинаковой: белок HP 1c образовывал ДНК-белковые комплексы с той же эффективностью, что и HP1b и HP1a.
Рис. 2. Анализ гель-шифт связывания белков семейства HP1 с регуляторными участками ДКП-ретротранспозонов группы gypsy. Связывание белков HP1a, HP1b и HP1c с регуляторными участками элементов группы gypsy (gypsy, Springer, Tirant, ZAM, Rover и 17.6). Концентрация белка во всех пробах — 0,5 мкг/мкл. Во всех пробах использовался 0,5 М KCl
Таким образом, 5'-UTR всех исследованных элементов, кроме Springer, хорошо связываются в белком НР1а, и это, очевидно, обусловлено наличием повторов в 5'-UTR. Два из шести исследованных МГЭ (ZAM и Tirant) одинаково эффективно связываются как с белком-маркером гетерохрома-тина (HP1a), так и с белком-маркером эухроматина (HP1c).
Для того чтобы определить концентрацию белка в пробе, достаточную для эффективного связывания с матрицей, мы провели эксперименты по связыванию 5'-UTR ZAM (содержит три повторяющихся модуля) и Springer (не содержит повторов) с разведениями белка НР1а (рис. 3). Обнаружено, что ПЦР-фрагмент ДНК, содержащий 5'-UTR элемента ZAM с тремя повторяющимися модуля-
ми, образует комплексы с HP1a уже при концентрации белка 0,125 мкг/мкл. В то же время полное связывание амплификата 5'-UTR элемента Springer обнаруживается только при концентрации белка 0,25 мкг/мкл. Таким образом, мы установили, что элемент Springer обладает наименьшим сродством к белкам семейства HP1 среди элементов его группы, поскольку для образования ДНК-белковых комплексов со всеми специфичными молекулами ДНК (амплификаты элемента Springer) требуется большее количество белка.
Мы предположили, что в случае с ZAM и Tirant важную роль при связывании с белками НР1 играет наличие крупных и множественных тандемных повторов в регуляторных областях элементов соответственно. Для подтверждения нашего предпо-
Рис. 3. Связывание белка HP1a в различных разведениях (0,5 мкг/мкл, 0,25 мкг/мкл, 0,125 мкг/мкл и 0,0625 мкг/мкл белка) с элементами ZAM и Springer. Три амплификата элемента ZAM на электрофореграмме представляют собой фрагменты, содержащие разное количество тандемных повторов (от 1 до 3).
Во всех пробах использовался 0,5 М KCl
ложения мы провели серию экспериментов по связыванию различного числа тандемных повторов 5'-UTR Tirant и ZAM с белком HP1a.
Ранее было показано, что у D. melanogaster лабораторной линии SS из коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова присутствуют все возможные полиморфные варианты МГЭ Tirant, различающиеся количеством повторов в 5'-UTR [20]. С использованием праймеров, локализованных вблизи области тандемных повторов, мы провели амплификацию фрагментов Tirant, включающих 5'-UTR, используя в качестве матрицы геномную ДНК дрозофил линии SS. В результате амплификации мы получили набор фрагментов 5'-UTR, содержащих от одного до шести повторяющихся модулей по 102 п.н. Далее мы выделяли и очищали каждый из ПЦР-фрагментов и составляли их смеси. Всего было составлено четыре смеси. Первая смесь содержала все шесть возможных вариантов 5'-UTR (от самого длинного до самого короткого). Каждая последующая смесь отличалась от предыдущей отсутствием самого длинного фрагмента (рис. 4А).
При связывании белка HP 1a с набором всех возможных полиморфных вариантов 5'-UTR МГЭ Tirant ДНК-белковые комплексы образовывались с ДНК-фрагментами, содержащими шесть тан-демно повторяющихся модулей (рис. 4А1). Если мы убирали из общей смеси фрагмент, содержащий шесть повторяющихся модулей, связывание и образование ДНК-белковых комплексов происходило с амплификатами, имеющими четыре и пять повторяющихся модулей, а связывания с оставшимися амплификатами (1—3 повторяющихся модуля) не происходило (рис. 4А2). Похожая картина наблюдалась при удалении из смеси фрагмента с пятью повторяющимися последовательностями: несвязав-шимися оставались амплификаты с 1—3 повторами, а связывание происходило с фрагментом, имеющим четыре повторяющихся модуля (рис. 4А3). Наконец, при тех же концентрациях HP1a и отсутствии амплификатов с четырьмя, пятью и шестью повторяющимися модулями связывания с оставшимися амплификатами (1—3 повторяющихся модуля) не происходило (рис. 4А4). Результат эксперимента говорит о том, что трех повторов недостаточно для эффективного связывания с белком HP1. Отметим, что избирательность связывания не зависит от длины фрагмента, это мы доказали с использованием фрагментов конкурирующей ДНК разной длины (рис. 1В).
Рис. 4. Связывание белка HP1a с амплификатами, содержащими различное число тандемных повторов в 5' UTR мобильных генетических элементов Tirant и ZAM. А1 — шесть амплификатов, содержащих от 1 до 6 тандемнах повторов в 5' UTR Tirant; А2 — от 1 до 5 повторов в 5' UTR Tirant; А3 — от 1 до 4 повторов в 5' UTR Tirant; А4 — от 1 до 3 повторов в 5' UTR Tirant; Б1 — связывание белка HP1a с двумя вариантами амплификатов 5' UTR ZAM, содержащими три повторяющихся модуля и один повторяющийся модуль соответственно, Б2 — с двумя вариантами амплификатов 5' UTR ZAM, содержащими два повторяющихся модуля и один повторяющийся модуль соответственно, Б3 — с двумя вариантами амплификатов 5'UTR ZAM, содержащими три повторяющихся модуля и два повторяющихся модуля соответственно. Цифры рядом со стрелками соответствуют количеству тандемно повторяющихся модулей в 5' UTR. "+" — присутствие в пробе белка; "—" — отсутствие
Подобная картина наблюдалась и с элементом ZAM. Мы составляли разные комбинации ампли-фикатов, содержащих от одного до трех повторяющихся модулей (тандемных повторов) длиной 307 п.н. в нетранслируемой области ZAM. Во всех трех экспериментах HP 1a связывался полностью с фрагментами, имеющими два и три повторяющихся модуля (рис. 4Б). Амплификат с одним повторяющимся модулем связывался слабее, что наблюдали на электрофореграмме как небольшое смещение ПЦР-продукта (рис. 4Б1, Б2).
Таким образом, повторы абсолютно необходимы для связывания белка HP1a с 5'-UTR МГЭ Tirant и ZAM. Отсутствие повторов в случае элемента ZAM или их число менее двух — в случае Tirant делает невозможным такое взаимодействие.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Klattenhoff C., Xi H., Li C., Lee S, Xu J., Khurana J.S., Zhang F., Schultz N., Koppetsch B.S., Nowosielska A., Seitz H., Zamore P.D., Weng Z., Theurkauf W.E. The Drosophila HP1 homolog Rhino is required for transposon silencing and piRNA production by dual-strand clusters // Cell. 2009. Vol. 138. N 6. P. 1137-1149.
2. Bannister A.J., Zegerman P, Partridge J.F., Miska E.A., Thomas, J.O., Allshire R.C., Kouzarides T. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain // Nature. 2001. Vol. 410. N 6824. P. 120-124.
3. Vermaak D., Henikoff S., Malik H. Positive selection drives the evolution of rhino, a member of the heterochro-matin protein 1 family in Drosophila // PLoS Genet. 2005. Vol. 1. N 1. P. 96-108.
4. Abel J., Eskeland R., Raffa G.D., Kremmer E, Imhof A. Drosophila HP1C is regulated by an autoregulatory feedback loop through its binding partner Woc // PLoS One. 2009. Vol. 4. N 4. e5089.
5. Font-Burgada J., Rossell D., Auer H., Azorin F. Drosophila HP1c isoform interacts with the zinc-finger proteins WOC and relative-of-WOC to regulate gene expression // Gene Dev. 2008. Vol. 22. N 21. P. 3007-3023.
6. Mohn F., Sienski G., Handler D., Brennecke J. The rhino-deadlock-cutoff complex licenses noncanonical transcription of dual-strand piRNA clusters in Drosophila // Cell. 2014. Vol. 157. N 6. P. 1364-1379.
7. Eissenberg J., Hartnett T. A heat shock-activated cDNA rescues the recessive lethality of mutations in the het-erochromatin-associated protein HP1 of Drosophila melano-gaster // Mol. Gen. Genet. 1993. Vol. 240. N 3. P. 333-338.
8. Volpe A.M., Horowitz H., Grafer C.M., Jackson S.M., Berg C.A. Drosophila rhino encodes a female-specific chromo-domain protein that affects chromosome structure and egg polarity // Genetics. 2001. Vol. 159. N 3. P. 1117-1134.
9. Cabrera J.R., Olcese U., Horabin J.I. A balancing act: heterochromatin protein 1a and the Polycomb group coordinate their levels to silence chromatin in Drosophila // Epi-genet. Chromatin. 2015. Vol. 8:17.
10. Alekseyenko A.A., Gorchakov A.A., Zee B.M., Fuchs S.M., Kharchenko P.V., Kuroda M.I. Heterochromatin-associated
Полученные данные свидетельствуют о том, что тандемные повторы служат затравкой для первичного связывания белков НР1. От точки связывания может происходить дальнейшее распространение молекул гетерохроматиновых белков по всей ДНК. По-видимому, большее число повторов привлекает большее количество белковых молекул НР1, обеспечивая кооперативное связывание. То же касается и длины повторов: чем длиннее тандемный повтор, тем эффективнее связывание. Можно заключить, что наличие тандемных повторов в 5'~иТ^ мобильных элементов является важным инструментом регуляции их транспозиции гетерохроматиновыми белками.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 16-34-00729).
interactions of Drosophila HP1a with dADDl, HIPP1, and repetitive RNAs // Genes Dev. 2014. Vol. 28. N 13. P 1445-1460.
11. Lippman Z., Martienssen R. The role of RNA interference in heterochromatic silencing // Nature. 2004. Vol. 431. N 7006. P. 364-370.
12. Greil F., van der Kraan I., Delrow J., Smothers J.F., de Wit E., Bussemaker H.J., van Driel R., Henikoff S., van Steensel B. Distinct HP1 and Su(var)3-9 complexes bind to sets of developmentally coexpressed genes depending on chromosomal location // Genes Dev. 2003. Vol. 17. N 22. P. 2825-2838.
13. Perrini B., Piacentini L., Fanti L., Altieri F., Chichia-relli S., Berloco M. Turano C., Ferraro A., Pimpinelli S. HP1 controls telomere capping, telomere elongation, and telomere silencing by two different mechanisms in Drosophila // Mol. Cell. 2004. Vol. 15. N 3. P. 467-476.
14. Minervini C.F., Marsano R.M., Casieri P., Fanti L., Caizzi R., Pimpinelli S., Rocchi M., Viggiano L. Heterochromatin protein 1 interacts with 5'UTR of transposable element ZAM in a sequence-specific fashion // Gene. 2007. Vol. 393. N 1-2. P. 1-10.
15. Nefedova L.N., Mannanova M.M., Kim A.I. Integration specificity of ltr -retrotransposons and retroviruses in the Drosophila melanogaster genome // Virus Genes. 2011. Vol. 42. N 2. P. 297-306.
16. Baldrich E., Dimitri P., Desset S., Leblanc P., Codi-pietro D., Vaury C. Genomic distribution of the retrovirus-like element ZAM in Drosophila // Evolution and impact of transposable elements. Contemporary issues in genetics and evolution, vol 6 / Ed. P. Capy. Dordrecht: Springer, 1997. P. 131-140.
17. Kuz'min I.V, Shnyriaeva A.A, Nefedova L.N, Kim A.I. Translational analysis of the Grp gene, a genomic homologue of the Gag gene of the gypsy retrotransposon of Drosophila melanogaster // Russ. J. Genet. 2011. Vol. 47. N 9. P. 12751277.
18. Lippman Z., Gendrel A.V., Black M., Vaughn M.W., Dedhia N., McCombie W.R., Lavine K., Mittal V., May B., Kasschau K.D., Carrington J.C., Doerge R.W., Colot V., Martienssen R. Role of transposable elements in heterochromatin
and epigenetic control // Nature. 2004. Vol. 430. N 6998. P. 471-476.
19. Tao Zhao, Heyduk T, Allis C.D., Eissenberg J.C. Heterochromatin protein 1 binds to nucleosomes and DNA in vitro // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. N 36. P 28332-28338.
20. Nefedova L.N., Urusov F.A., Romanova N.I., Shmel'kova A.O., Kim A.I. Study of the transcriptional and
transpositional activities of the Tirant retrotransposon in Dro-sophila melanogaster strains mutant for the flamenco locus // Russ. J. Genet. 2012. Vol. 48. N 11. P. 1089-1096.
Поступила в редакцию 02.02.2018
Принята к печати 19.03.2018
GENETICS
THE STUDY OF INTERACTION OF THE HP1 FAMILY PROTEINS WITH THE UNTRANSLATED REGULATORY REGIONS OF THE GYPSY RETROTRANSPOSONS OF
DROSOPHILA MELANOGASTER
A.R. Lavrenov, L.N. Nefedova, A.I. Kim*
Department of Genetics, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: aikim57@mail.ru
We have investigated the in vitro interaction of recombinant HP1 family protein paralogs (HP1a, HP1b and HP1c) and the 5' untranslated regulatory regions of gypsy retrotransposon group in Drosophila melanogaster. gypsy, Springer, Tirant, ZAM, Rover and 17.6. With the use of competitive DNA, conditions for specific binding were obtained. It is shown that HP1 family proteins effectively bind to the 5' untranslated region of retrotransposons, which have tandem repeats in their composition. It has been found that repeats are absolutely necessary for binding HP1a protein to the 5' untranslated region of Tirant and ZAM mobile genetic elements. The absence of repeats in the case of ZAM element or their number less than two—in the case of Tirant makes such interaction impossible. Thus, the presence of tandem repeats in the 5' untranslated region of retrotransposons of the gypsy group is an important tool for regulating their transposition by heterochromatin proteins.
Keywords: heterochromatin proteins, Drosophila, gypsy, mobile elements, retrotransposons, untranslated regions
Сведения об авторах
Лавренов Антон Русланович — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры генетики биологического факультета МГУ. Тел.. 8-495-939-42-53; e-mail. overtaki@mail.ru
Нефедова Лидия Николаевна — докт. биол. наук, доц. кафедры генетики биологического факультета МГУ. Тел.. 8-495-939-42-53; e-mail. lidia_nefedova@mail.ru
Ким Александр Иннокентьевич — докт. биол. наук, проф. кафедры генетики биологического факультета МГУ. Тел.. 8-495-939-42-53; e-mail. aikim57@mail.ru
