CC BY
35
X Ü в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. Na 10(126)
УДК 579.087.9+543.95
*
E.H. Россинец, A.A. Белов, Н.С. Марквичев, A.B. Васильева, Н.П. Мышенков
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия Государственное унитарное предприятие «Тепличный», Владимир, Россия
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАСТВОРОВ НЕКОТОРЫХ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА СПОРЫ ГРИБА РОДА PYTHIUM
Influence of solutions of trypsin, chemtrypsin, lipases, lysozyme, lizoamidazy, and proteolytic complex from hepatopancreas of a crab and their mixes on disputes and a mushroom of sort Pythium is investigated. Concentration dependence of action of lysozyme, lizoamidazy and a proteolytic complex from hepatopancrea of a crab is established. Obtained given objasne the presence chitinolytic activities in the given preparations of enzymes.
Исследовано воздействие растворов трипсина, химотрипсина, липазы, лизоцима, лизоамидазы, протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба и их смесей на споры и гриб рода Pythium. Установлена концентрационная зависимость действия лизоцима, лизоамидазы и протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба. Полученные данные объяснены наличием хитинолитических активностей в данных препаратах ферментов.
Из числа возбудителей болезней растений грибы стоят на первом месте, далеко оставляя за собой вирусы и особенно бактерии. Эта исключительная роль грибов объясняется их высокой биологической активностью, наличием экзоферментов, которые способны разрушать стенку растительных клеток. По существу, соответствующие ферменты можно рассматривать как факторы агрессии и патогенности грибов. С их помощью грибы вторгаются в растения, получают от них питательные вещества и размножаются на их тканях или на поверхности растений. У некоторых грибов во время прорастания спор образуются особые структуры, с помощью которых гриб проникает в растение, т.е. фактически инфицирует его. Этим грибы отличаются от бактерий и вирусов, лишенных способности проникать в неповрежденные растения по тому же механизму. Ущерб, наносимый культурным растениям грибами, ежегодно исчисляется миллиардами рублей. Даже самые осторожные оценки свидетельствуют об уничтожении грибными болезнями 10-20% потенциального урожая [1].
Мучнистая роса - широко распространенная и вредоносная болезнь многих культур. Заболевание поражает растения, как в открытом, так и в защищенном грунте во все фазы развития. Возбудители мучнистой росы -грибы Erysiphe achoracearum D С. f cucurbitacearum Pot. и Sphaerotheca fu-ligenea Poll f Cucurbitae Jaez. - развиваются только на живых растениях. Мучнистый налет на пораженных участках растений состоит из поверхностной грибницы, на которой образуются органы спороношения патогенна -конидиеносцы с цепочками конидий. Последние распространяются в период вегетации растений, и гриб формирует более десяти генераций [2].
Применение химических препаратов для борьбы с с/х вредителями не всегда оказывается эффективным, так как у объектов воздействия быстро
С й 6 X и в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. № 10 (126)
вырабатывается резистентность к таким препаратам, а это требует увеличение дозы препарата и постоянной ротации препарата. Кроме того, не обладая избирательным действием, химические инсектициды вызывают гибель полезных микроорганизмов, а накопление инсектицида в природных экосистемах (воде, почве) определяет их экологическую опасность. Разработка биологических препаратов избирательного и длительного действия является актуальной задачей, решение которой позволит снизить экологическую нагрузку и экономические затраты [3].
Как известно из литературы [1,4-12] клеточная стенка грибов и их спор состоит из глюкана, количество которого у мицелиальных форм может составлять 70-90 % массы стенки. В стенках грибов глюканы существуют как самостоятельные структурные полимеры, а также в виде комплексов с хитином. Исходя из представлений, что глюкан-хитиновый слой клеточной стенки прикрыт от воздействия глюканаз комбинированным слоем протеина и липидов, многие исследователи считают протеазу необходимым ферментом для осуществления лизиса клетки. В составе комплекса глюканаза может выполнять функцию фермента, гидролизующего ригидный глюкановый слой клеточной стенки, а протеаза - роль фермента, воздействующего на матриксный маннопротеиновый компонент, который препятствует проникновению глюканазы внутрь клеточной стенки и контакту с субстратом. Несмотря на противоречивые сведения о роли протеазы в лизисе клеточной стенки, анализ литературных данных позволяет с определенной уверенностью считать, что протеолитические ферменты являются важной составной частью литического комплекса. Изучение каталитических свойств глюканаз, протеаз, хитиназ и иных гидролаз, позволяет говорить об их синергидном действии при лизисе клеточных стенок микроорганизмов [4-11].
Род РуМит /Уш^з/г.-один из крупных родов среди оомицетов. По образу жизни и морфологии представители этого рода имеют сходные черты с грибами порядков $арго1е&па1е$, Ьер1отНа1е8, Lagenidiales и Регопо$рога1е$ (ложная мучнистая роса) [12].
Нами было изучено действие растворов гидролитических ферментов: лизоцима (Лз), трипсина (Тр), протеолитического комплекса из гепатопан-креаса краба (ПК) и комплекса ферментов лизоамидаза (Ла) в различной концентрации и при различных температурах на споры грибов рода РуМпт.
О воздействии на споры гриба растворов ферментов судили по модифицированной нами методике [13].
В необходимом объеме раствора предварительно автоклавированной, охлажденной жидкой картофельной среды готовили раствор фермента заданной концентрации. Как было установлено ранее, питательная среда не оказывает влияние на ферментативные активности исследованных фермен-
С косяка 5-ю мл раствора фермента заданной концентрации смывали в пробирку споры гриба. Для каждой концентрации фермента используя свой косяк. В качестве контроля использовали раствор питательной среды без фермента.
Затем петлей отбирали пробу и помещали на предметное стекло в
X и в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. № 10 (126)
чашку Петри (должно быть не менее 10-15 спор).
Пробы помещали в суховоздушный термостат типа ТС 1/80 СПУ при требуемой температуре. Через 18-24 часа под микроскопом смотрели проросшие и не проросшие споры. (В контроле проросших спор должно быть не менее 80%) [13].
Полученные данные представлены на рисунке 1.
-^(N/N0)
/
• ЯА /
*
/ / / /
С, мг/мл
Рис. 1. Влияние некоторых гидролитических ферментов на выживаемости (за 100% принято количество спор до обработки) спор гриба рода РУТНШМ
Как видно из представленных и полученных нами ранее данных [14,15], наблюдается концентрационная зависимость действия исследованных (Ла, ПК, Лз) растворов ферментов, как на сам гриб, так и на его споры. Наличие протеолитической и специфических хитиназной и хитозаназной активностей в препаратах Ла и ПК способствует угнетению развития, как самого гриба, так и его спор. Действие растворов Лз обладающего неспецифической хитиназной активностью усиливается добавками протеиназы. Растворы трипсина (5мг/мл), химотрипсина (10мг/мл) или липазы (100мг/мл) не оказывают влияние на растущий гриб.
Как было установлено в специально проведенных опытах, растворы исследованных (Ла, ПК, Лз) ферментов в использованных концентрациях, не оказывают угнетающего действия на листья растущего огурца.
В дальнейшем планируется изучить влияние органических растворителей и полисахаридных добавок на процесс разрушения растворами фер-
0 ff 0 X tt в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. № 10 (126)
ментов клеточных стенок, как самого гриба, так и его спор.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (Гос. контракт № 16.М04.11.0015 от 29.04.2011).
Библиографические ссылки
1. Домарадский И.В., Градова Н.Б. Очерки микологии для микологов. М.: Истоки, 2007. С. 58-62.
2. Текст сайта // [Электронный ресурс] // URL: // htpp://www.uaseed.com/ bolezni/132.htm ^ (Дата обращения 13.03.2011).
3. Лысак В.В., Максимова Н.П. Теоретические прикладные аспекты создания биопрепаратов для защиты растений. // 80 лет БГУ. Биология, 2001. С. 56-64.
4. Петрова Н.Т. Разработка технологии получения препарата литических ферментов, расщепляющих клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов, с использованием мутантного штамма Streptomyces giiseinus 11-84: Дис. ... канд. техн. Наук. М., 2005. 212 с.
5. Получение и характеристика литических ферментов препарата лизофун-гин. / Н.Т. Петрова, Е.А. Нестеренко, Н.М. Павлова [и др.]; //Биотехнология, 2002. №1. С.78-88.
6. Журавлева Н.В., Лукьянова П.А. Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии //Вестн ДВО РАН, 2004. №3. С.76-86.
7. Хитин-глюкановые комплексы, Уч. Пособие. / Л.А. Нудьга, И.И. Оси-повская, Д.Л. Будилина, Е.Б. Тарабукина. СПб, 2010. 53 с.
8. Пептодогликанлизирующие ферменты бактериофагов - перспективные противобактериальные агенты. / К.А. Мирошников, О.В. Чертков, П.А. Назаров, В.В. Месянжинов // Успехи биол. хим., 2006. Т. 46. С. 65-98.
9. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. М., 1988. 230 с.
10. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука, 1983, 315 с.
11. Феофилова Е.П. Хитин грибов: распространение, биосинтез, физико-химические свойства и перспективы использования// Хитин и хитозан. М.: Наука, 2002. С. 91-99.
12. Пыстина К.А. Род Pythium Pringsh.. СПб.: Наука, 1998. С.5.
13. Методы экспериментальной микологии: Справочник. Киев: Наукова Думка, 1982. С. 116.
14. Белов A.A., Россинец Е.А., Марквичев Н.С. Антигрибковые пролонгированные ферментативные препараты. // Биотехнология: экология крупн. городов: Мат. Московск. межд. научно-практ. конф., 15-17 март, 2010. М., 2010. С. 130-131.
15. Белов A.A., Россинец Е.А., Марквичев Н.С. Исследование свойств не-модифицированной и иммобилизованной в хитозановый гель лизоамидазы (ХТ-ЛА) // Наука-производство-технология-экология: Мат. Всерос. научно-технич. конф. Киров: Изд-во ВятГУ, 2010. Т.2. С. 60-63.
