Исследование влияния протеолитических ферментов на сбраживание осветленного сусла из экструдированной пшеницы Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ТЕХНОЛОГИЯ

УДК 663.1

Исследование влияния протеолитических ферментов на сбраживание осветленного сусла из экструдированной пшеницы

М. В. Амелякина; Л. В. Римарева,

д-р техн. наук, академик РАН; В. И. Степанов, канд. техн. наук;

В. В. Иванов,

канд. техн. наук;

А. Ю. Шариков,

канд. техн. наук;

Н. И. Игнатова

ВНИИ пищевой биотехнологии филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи

Введение. Белок, входящий в состав всех живых клеток — один из главных компонентов в питании человека и животных. Существующий дефицит белка не может быть восполнен только традиционными сельскохозяйственными методами. Перспективное направление исследований заключается в разработке и применении белковых добавок, полученных из растительного сырья, для обогащения ими пищи и кормов. В последнее время, за рубежом, а также в нашей стране значительное число научных и практических разработок посвящено биотехнологическим способам получения белковых добавок кормового и пищевого назначения из зернового сырья и вторичных продуктов его переработки [1, 2]. Применение белковых добавок способствует расширению ассортимента биологически полноценных социально значимых продуктов, востребованность которых постоянно возрастает [3].

Спиртовая промышленность России ежегодно перерабатывает значительное количество зернового сырья для получения этилового спирта, где используется только его крахмалистая часть, а белковая составляющая как правило не в полной мере задействована в производстве пищевой и кормовой продукции [4]. Созданная во ВНИИПБТ комплексная технология глубокой переработки зерна на спирт и кормовые добавки позволяет снизить потери сырьевых ресурсов и

заменить длительные и многостадийные процессы на одностадийные [5]. Основу данной технологии составляют экструзионно-гидролитические и биокаталитические процессы переработки крахмалосодержащего сырья в одной установке. В традиционных технологиях производства спирта при получении высоких концентраций зернового сусла (свыше 24 %) ухудшаются его реологические свойства: повышается вязкость, снижается текучесть, возрастает вероятность неполной переработки сырья. В результате требуются дополнительные расходы на ферменты, энергозатраты, и при этом повышается продолжительность водно-тепловой обработки. Одностадийная экструзионно-гидролитическая технология позволяет получать зерновое сусло с концентрациями растворимых сухих веществ (РСВ) выше 25 % без дополнительных затрат на технологические процессы [5].

Поэтому разработка усовершенствованной 2-продуктовой комплексной технологии глубокой переработки зернового сырья на основе экструзионно-гидролитических и ферментативных процессов с получением дополнительного кормового белкового продукта — актуальное направление для спиртового производства.

Цель данной работы — исследование влияния ферментов про-теолитического действия на процессы генерации дрожжей и сбра-

ПИВО и НАПИТКИ

4•2018

'ТЕХНОЛОГИЯ

Помол зерна

Альфа Геми-

ами- целлю- Глюко

5 Бактери- 14

12

На брага-

ректификационную установку

Сконцентрированная белково-углеводная фракция 13 ,.

Обогащенная белком барда для животноводства

3

7

Рис. 1. Аппаратурно-технологическая схема комбинированной линии глубокой переработки зернового сырья для получения белкового концентрата и этанола:

1 - экструдер-гидролизер; 2, 10 - насос центробежный; 3, 5,14,16 - сборник ферментных препаратов; 4 - насос-дозатор; 6 - ферментер-осахариватель; 7 - декантер; 8 - емкость промывки кека; 9 - сборник осветленного сусла; 11 - дрожжанка; 12 - бродильный чан; 13 - смеситель

живания осветленного зернового сусла, полученного по комплексной экструзионно-гидролитической технологии переработки зерна на спирт и белоксодержащий продукт.

Объекты и методы исследований. В качестве объектов использовали: зерно пшеницы; зерновое сусло; осветленное зерновое сусло; осмо-фильные дрожжи Saccharomyces cere-visiae расы 1039, селекции ВНИИПБТ

[6]. В качестве гидролитических ферментов использовали ФП — источники термостабильной а-амилазы, глюкоамилазы, бактериальной и грибной протеазы, гемицеллюлаз

[7]. Переработку зернового сырья осуществляли на пилотной установке, разработанной на базе экс-трудера Werner&Pfleiderer Continua 37. Разделение сусла на фракции осуществляли в осадительной лабораторной центрифуге с фактором разделения — 3100 g. Определение побочных метаболитов спиртового брожения осуществляли газох-роматографическим методом на хроматографе НР «Agilent» 6850 [8].

Результаты исследований. Аппа-ратурно-технологическая схема комплексной технологии получения белкового концентрата и этанола на основе интеграции термомеханического и биокаталитического процессов глубокой переработки зернового сырья представлена на рис. 1. На 1-м этапе измельченное зерно поступало в термомеханическую камеру экструдера-гидролизатора, где осуществлялись деструктивные процессы биополимеров зернового сырья. В следующую зону камеры экструдера-гидролизатора вместе с полученной деструктированной зерновой массой подавались разжижающие ферменты: а-амилаза, ксиланаза, бактериальная протеаза и вода через специальный гидродинамический узел. При стабилизированном температурном режиме (60.. .70 °С) происходило растворение, частичный ферментативный гидролиз крахмала, гемицеллюлозы и белков с образованием разжиженной разваренной массы. Приготовленная крахмалосодержащая жидкая среда

подавалась в сборник — осахарива-тель, куда одновременно дозировали глюкоамилазу. Осахаривание проводили в термостатированном аппарате в течение 1,5 ч при температуре 58 °С. Концентрация растворимых сухих веществ в цельном зерновом сусле составила 33 % при гидромодуле 1 : 1,3.

На 2-м этапе полученное по экс-трузионно-гидролитической технологии цельное зерновое сусло с концентрацией сухих веществ 33 % разделяли на две фракции в осади-тельной центрифуге: осветленное сусло и твердый осадок. Полученный твердый осадок двухкратно промывали водой в соотношении 1 : 1 и после каждой промывки разделяли на фракции. Из твердого осадка получали белковый продукт, которым возможно обогащение барды для животноводства и использование в пищевых продуктах с целью повышения их пищевой ценности.

Для оценки качества сбраживания осветленного сусла концентрацией растворимых сухих веществ (РСВ)

4•2018 ПИВО и НАПИТКИ 37

ТЕХНОЛОГИЯ'

Таблица 1

Концентрация Количество Показатели брожения

Среда растворимых дрожжевых РВ, г/100 см3 ОРВ, г/100 см3 Остаточный Конечная Концентрация Примеси

сухих веществ, % клеток на 48 ч, млн/см3 48 ч 72 ч 72 ч крахмал, г/100г кислотность, °д спирта, %об. основные/общие, мг/дм3

Цельное сусло 33 262 / 16* 6,5 1,2 1,4 0,18 0,62 15,0 2014,0 / 4673,1

Осветленное сусло 21 128 / 25* 1,7 0,83 0,9 0,063 0,44 12,3 1650,2 / 3760,2

* Количество почкующихся дрожжей, % от общего количества

21 %, полученного при разделении зернового сусла на две фракции, использовали метод постановки бродильных проб. При этом контролем служило неразделенное зерновое сусло. Брожение осуществляли при температуре 34...35 °С в течение 72 ч.

Результаты исследований показали, что процесс сбраживания осветленного сусла, обработанного подобранным ферментным комплексом, проходил эффективнее, чем в контрольном варианте, где использовалось цельное сусло из экструзионного зерна (табл. 1). При этом установлено,

2500 -г-----------------------------------------------------------

2000 -

1500 -

2 1000 -

что спирт из осветленного сусла был высокого качества и содержал более низкое количество побочных метаболитов по сравнению со спиртом, полученным из цельного зернового сусла. Наряду с высоким уровнем синтеза этанола наблюдали снижение образования побочных продуктов брожения, при этом в основном за счет высших спиртов, альдегидов, сложных эфиров и ароматических спиртов (см. табл. 1).

В результате исследований влияния ферментов с различной субстратной специфичностью на процесс образования продуктов брожения вы-

500 -

0

Комплекс

АС + ГлС АС + ГлС + ПС АС + ГлС + КС

Ферментные комплексы

И Высшие спирты Альдегиды Сложные эфиры Органические кислоты Ароматические спирты

Рис. 2. Влияние ферментов с различной субстратной специфичностью на образование побочных продуктов

явлено, что использование полного комплекса ферментов, включающего а-амилазу (АС), глюкоамилазу (ГлС), протеазы (ПС) и ксиланазу (КС), позволило максимально снизить уровень образования сопутствующих синтезу этанола побочных метаболитов (высших спиртов, альдегидов, сложных эфиров, ароматических спиртов) (рис. 2).

Как известно, применение протео-литических ферментных препаратов позволяет эффективно задействовать белковые полимеры зернового сырья [9], поэтому были проведены сравнительные исследования влияния бактериальной и грибной протеазы на степень гидролиза белковых веществ осветленного зернового сусла, приготовленного по экструзионно-гидролитической технологии. Тестирование проводили по уровню образования растворимых белков и аминного азота.

Анализ данных показал, что при увеличении дозировок протеаз происходило накопление аминного азота, это указывает на расщепление высокомолекулярных белковых веществ сусла с образованием более коротких пептидов и свободных аминокислот. При этом подтвердилось, что микробиологическое происхождение про-теаз оказало существенное влияние на эффективность их действия (рис. 3, 4).

14 -г 12 -. 10 -8

6 4

4 • 2 0

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 Дозировка протеаз, ед. При внесении БПС — При внесении ГПС

45 -г

40

35

30

25

20

I15" < 10 -

5 -0

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 Дозировка протеаз, ед. При внесении БПС — При внесении ГПС

Рис. 3. Изменение концентрации растворимых белковых веществ

в зерновом осветленном сусле при различных дозировках протеаз

Рис. 4. Изменение аминного азота в зерновом

осветленном сусле при различных дозировках протеаз

38 ПИВО и НАПИТКИ

4•2018

'ТЕХНОЛОГИЯ

Таблица 2

Среда Количество дрожжевых СО,, клеток, млн/см3 г РВ, г/100 см3 ОРВ, г/100 см3 Конечная Концентрация Примеси основные/общие, мг/дм3 Выход спирта, дкл/т условного крахмала

24 ч 48 ч 48 ч 72 ч 48 ч 72 ч 72 ч кислотность, °д спирта, %об.

Зерновое сусло без ПС 140 / 10* 180 / 9* 15,0 20,2 8,2 3,4 4,2 0,56 13,8 3865 / 6043 55,8

Зерновое сусло с ПС 250 / 17* 320 / 20* 18,8 22,1 6,25 3,2 3,3 0,52 15,0 2017/4571 57,0

* Количество почкующихся дрожжей, % от общего количества

Так, при использовании бактериальной протеазы наблюдали увеличение концентрации растворимого белка в 1,6 раза, с 5,95 до 9,81 мг/мл, и повышение уровня образования аминного азота — до 27 мг%. Внесение грибной протеазы во все варианты осветленного сусла позволило повысить концентрацию растворимых белков до 12 мг/мл, а аминного азота — до 42 мг% (рис. 3, 4).

Проведен сравнительный анализ процесса сбраживания зернового сусла, обработанного грибными протеа-зами и без них (контроль). Установлено, что зерновое сусло, обогащенное усвояемыми азотистыми веществами при внесении в него протеаз, сбраживалось эффективнее, чем контроль, не обработанный протеазами. Отмечено повышение концентрации спирта в бражке до 15 %об. (в контроле 13,8 %об.), увеличение выхода спирта и одновременно снижение содержания побочных метаболитов практически в 2 раза (табл. 2).

Использование грибных проте-аз сказалось и на процессе генерации дрожжей, уровень накопления дрожжевой биомассы увеличился в 1,8 раза, при этом скорость сбраживания углеводов была выше, чем в сусле, в которое протеазы не вносили (рис. 5).

Таким образом, разработанная комплексная технология глубокой переработки зерна с использованием совмещенных экструзионно-гидролитических и ферментативных процессов позволяет получать зерновое сусло максимально высокой концентрации, что дает возможность обеспечить выпуск двух полноценных продуктов — спирта и белковых добавок.

В результате исследований экспериментально доказано, что полученное по предлагаемой технологии осветленное сусло концентрацией 21 % сбраживается эффективнее, чем неразделенное зерновое сусло. Установлено, что использование комплекса грибных протеаз способ-

18 -г

16 -

14 -

12 -

S 10 "

8 -

6 -

4 -

2 -

! 320

280

240 i

200

160

120

24 32 40 4

Продолжительность брожения, ч

56

64

-Ф

72

80

— Потребление углеводов без протеаз Потребление углеводов с протеазами — Дрожжи без протеаз Дрожжи с протеазами

Рис. 5. Динамика накопления дрожжевой биомассы и потребления углеводов при сбраживании осветленного сусла (по оси ординат «Потребление углеводов, г/100 мл»)

ствовало повышению концентрации спирта в бражке и одновременно снижению содержания побочных метаболитов практически в 2 раза, в основном за счет высших спиртов, альдегидов, сложных эфиров и ароматических спиртов. Применение грибных протеаз позволило повысить в зерновом сусле концентрацию аминного азота и растворимого белка в 1,5 раза, обеспечив дрожжи легкоусвояемым азотистым питанием, и увеличить уровень накопления дрожжевой биомассы в 1,8 раза.

Исследования проведены за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы Фундаментальных научных исследований государственных академий наук (темы № 0529-2016-0044; № 0529-2015-0108).

ЛИТЕРАТУРА

1. Серба, Е. М. Биотехнологические основы комплексной переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов в этанол и белково-аминокислотные добавки: монография /Е. М. Серба, В. А. Поля-

ков. - М.: ВНИИПБТ, 2015. - 133 с. (ISBN 978-5-906592-49-1)

2. Волкова, Г. С. Стратегия внедрения биотехнологического производства обогащенных кормопродуктов на основе переработки зерна / Г. С. Волкова, Е. В. Куксова, Л. В. Римарева // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2015. — № 9. — С. 44-48.

3. Нечаев, А. П. Пищевая химия / А. П. Нечаев [и др.], под ред. А. П. Нечаева. — СПб.: ГИОРД, 2007. — 640 с.

4. Серба, Е.М. Создание натуральных биокорректоров пищи для функциональных продуктов. / Е. М. Серба [и др.] // Пищевая промышленность. — 2013. — № 9. — С. 18-20.

5. Патент 2542389 РФ, МПК С12Р 7/06 (2006.01). Способ получения этилового спирта и белкового продукта из зернового сырья / В. И. Степанов, В. А. Поляков, М. В. Амелякина, Л. В. Римарева, В. В. Иванов, А. Ю. Шариков, В. В. Пономарев, Т. М. Бикбов; заявитель и патентообладатель ФГБНУ ВНИИПБТ. — № 2013103989; за-явл. 30.01.2013; опубл. 20.02.2015, Бюл. № 5.

6. Серба, Е. М. Создание осмофильного штамма спиртовых дрожжей Saccharo-

0

0

4•2018

ПИВО и НАПИТКИ 39

ТЕХНОЛОГИЯ'

шусе$ сегеукше и исследование условии его поддержания в активном состоянии / Е. М. Серба, М. Б. Оверченко, Л. В. Рима-рева, К. Л. Агашичева, Н. И. Игнатова // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2011. - № 4. - С. 4-8.

7. Римарева, Л.В. Ферментные препараты и биокаталитические процессы в пище-

вой промышленности / Л. В. Римарева [и др.]// Вопросы питания. — 2017. — Т. 86. — № 5. — С. 63-74.

8. Серба, Е. М. Исследование метаболитов, сопутствующих синтезу этанола при сбраживании концентрированного зернового сусла осмофильным штаммом дрожжей 8ассЬаюшусе$ cerevisiae /

Е. М. Серба [и др.]// Производство спирта и ликероводочных изделий. — 2013. — № 2. — С. 16-19.

9. Серба, Е. М. Влияние ферментных препаратов на технологические показатели зернового сусла и качество спирта / Е. М. Серба [и др.]// Пиво и напитки. — 2018. — № 1. — С. 50-54. &

Исследование влияния протеолитических ферментов на сбраживание осветленного сусла из экструдированной пшеницы

Ключевые слова

экструзия; белок; этанол; протеолитические ферменты; осветленное сусло; брожение; гидролиз.

Реферат

В традиционных технологиях производства спирта повышение концентрации зернового сусла свыше 24 % приводит к ухудшению его реологических свойств, снижению выхода целевой продукции и повышению потерь сырья. Новая технология двухпродуктового производства спирта и белоксодержащего продукта, основанная на интеграции термомеханических и биокаталитических процессов, позволяет получать высококонцентрированное зерновое сусло. Цель данной работы - исследование влияния ферментов протеолитического действия на процессы генерации дрожжей и сбраживания осветленного зернового сусла, полученного по комплексной экструзионно-гидролитической технологии. Работу проводили во ВНИИ пищевой биотехнологии. Объектами исследования служили: осветленное зерновое сусло; осмофильные дрожжи Saccharomyces cerevisiae расы 1039; комплексные ферментные препараты - источники термостабильной а-амилазы, глюкоамилазы, бактериальной и грибной протеазы, гемицеллюлаз. Приведена и описана аппаратурно-технологическая схема комплексной технологии получения осветленного сусла и белкового концентрата. Результаты сравнительных исследований процесса сбраживания осветленного зернового сусла и неразделенного цельного сусла показали, что осветленное сусло сбраживалось эффективнее, чем контроль. Наряду с высоким уровнем синтеза этанола наблюдали снижение образования побочных продуктов брожения, при этом в основном за счет высших спиртов, альдегидов, сложных эфиров и ароматических спиртов. Исследовано влияние ферментов с различной субстратной специфичностью на процесс образования побочных продуктов при сбраживании осветленного сусла. Установлено, что при использовании всего комплекса ферментов уровень образования побочных метаболитов снижается. Наибольший эффект оказывало каталитическое действие грибных протеаз, которое способствовало повышению в зерновом осветленном сусле концентрации аминного азота и растворимого белка в 1,5 раза, увеличению уровня накопления дрожжевой биомассы в 1,8 раза, снижению содержания побочных метаболитов практически в 2 раза и повышению выхода спирта.

Авторы

Амелякина Мария Валентиновна;

Римарева Любовь Вячеславовна, д-р техн. наук, профессор, академик РАН;

Степанов Владимир Иванович, канд. техн. наук;

Иванов Виктор Витальевич, канд. техн. наук;

Шариков Антон Юрьевич, канд. техн. наук;

Игнатова Надежда Иосифовна

ВНИИ пищевой биотехнологии -

филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи,

111033, Россия, г. Москва, ул. Самокатная, 4Б,

masha.am@mail.ru, lrimareva@mail.ru, stepanov-bio@yandex.ru,

foodbiotech@yandex.ru, ignatova59@list.ru

The Study of the Effect of Proteolytic Enzymes on the Fermentation Process of Clarified Wort from Extruded Wheat

Key words

extrusion cooking; protein; ethanol; proteolytic enzymes; clarified mash; fermentation; hydrolysis.

Abstract

Solids concentration of the grain mashes is the important factor in ethanol technology. The increase of solids concentration over 24 % using traditional water-thermal treatment leads to a deterioration of its rheological properties, reduces the yield of the ethanol and increases losses of the raw. The new two-product technology of alcohol and protein additive production based on the integration of thermomechanical and bio-catalytic processes allows to obtain very-high-gravity grain mashes. The aim of this work is a research of the effect of proteolytic enzymes action on the processes of yeast generation and fermentation of clarified grain wort prepared by extrusion-hydrolytic technology. The objects of the research were the samples of grain mashes, ethanol-tolerance strain of Saccharomyces cerevisiae, and complex enzyme preparations of thermostable a-amylase, glucoamylase, bacterial and fungal proteases, and hemicellulase. The results of the comparative fermentations showed that the clarified wort was fermented more efficiently than unclari-fied grain mash. There were observed an increase of ethanol synthesis level and a decrease of the formation of alcoholic fermentation by-products such as monohydric alcohols, aldehydes, esters and aromatic alcohols. It was studied the effect of enzymes with different substrate specificity on the fermentation of the clarified wort and on biosynthesis of alcoholic fermentation byproducts. It was established that the use of enzyme complex decreased the level of alcoholic fermentation secondary metabolites formation. The most significant effect of ethanol yield increase was shown using proteases of fungal origin. Their biocatalytic effect enhanced the concentrations of amino nitrogen and soluble protein in the clarified grain mash by 1.5 times. Also fungal proteases used promoted an increase of the yeast biomass yield by 1.8 times and a decrease of secondary metabolites content by almost 2 times. In the paper, the production line scheme of the complex technology is presented and described.

Authors

Amelyakina Mariya Valentinovna;

Rimareva Lyubov'Vyacheslavovna, Doctor of Technical Science, Professor, Academician of RAS;

Stepanov Vladimir Ivanovich, Candidate of Technical Science; Ivanov Viktor Vital'evich, Candidate of Technical Science; SharikovAnton Yur'evich, Candidate of Technical Science; Ignatova Nadezhda losifovna Russian Research Institute of Food Biotechnology -branch of Federal Research Center of Food and Biotechnology, 4b Samokatnaya Str., Moscow, 111033, Russia, masha.am@mail.ru, lrimareva@mail.ru, Stepanov-bio@yandex.ru, foodbiotech@yandex.ru, ignatova59@list.ru

40 ПИВО и НАПИТКИ 4•2018