CC BY
11
УДК 539.16: 663.12
Пхйьо Мьинт У, Панфилов В.И., Кузнецов А.Е., Антропова И.Г., Фенин А.А.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭТАНОЛА НА ЧИСЛЕННОСТЬ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAEШТ. T-985 ПРИ ДЕЙСТВИИ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Пхйьо Мьинт У, к.х.н., докторант кафедры биотехнологии; e-mail: phyomyintoo2502@gmail.com
Панфилов Виктор Иванович, д.т.н., профессор кафедры биотехнологии; Кузнецов Александр Евгеньевич, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии;
Антропова Ирина Геннадьевна, к.х.н., доцент кафедры химии высоких энергий и радиоэкологии;
Фенин Анатолий Александрович, старший преподаватель кафедры химии высоких энергий и радиоэкологии.
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия.
В работе исследована жизнеспособность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae до и после внесения этилового спирта в систему, а также зарегистрировано изменение доли мёртвых дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae после воздействия рентгеновского излучения. Изменения жизнеспособности дрожжей наблюдали стандартным методом путем введения в систему красителя метиленового синего с последующим расчетом доли мёртвых клеток под микроскопом.
Ключевые слова: дрожжевые клетки, Saccharomyces cerevisiae, микроскопия, этанол, рентгеновское излучение.
INVESTIGATION OF THE EFFECT OF ETHANOL CONCENTRATION ON THE NUMBER OF VIABLE YEAST CELLS SACCHAROMYCES CEREVISIAE STRAIN. T-985 UNDER THE RADIATION EFFECT OF X-RAYS
Phyo Myint Oo, Panfilov Viktor I., Kuznetsov Alexander E., Antropova Irina G., Fenin Anatolii A. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
In this work, we studied the viability of Saccharomyces cerevisiae yeast cells before and after the introduction of ethyl alcohol into the system, as well as change in the proportion of dead Saccharomyces cerevisiae yeast cells by the effect of different doses of X-ray radiation was registered. Changes in the viability of yeast were observed by a standard method by introducing a methylene blue dye into the system with further calculation of the proportion of dead cells under a microscope.
Keywords: yeast cell, Saccharomyces cerevisiae, microscope, ethanol, X-ray.
Известно [1], что дрожжи Saccharomyces cerevisiae - одни из наиболее изученных модельных организмов. Все виды ионизирующих излучений приводят к широким диапазонам биологических изменений в организме. Несмотря на то, что организм проявляет различные защитные реакции и некоторую устойчивость к ионизирующему излучению, ионизирующие лучи оказывают негативное влияние на живые организмы. Во многих экспериментах с рентгеновскими лучами микроорганизмы находятся во взвешенном состоянии в водном растворе во время облучения; следовательно, концентрация клеток может быть важной переменной величиной. Исследования в этих условиях также могут быть осложнены изменениями в суспендирующей среде во время облучения в результате метаболической активности, характер и величина которой будут варьироваться в зависимости от исследуемого вида. В общем, такие изменения будут пропорциональны численности клеток.
Этиловый спирт, образующийся при брожении, в повышенных концентрациях уменьшает активность дрожжей, а также присутствие спирта снижает и останавливает усвоение азотистых веществ [2]. Это одна из причин постепенного прекращения
брожения при определенном значении содержания спирта. Концентрация спирта, которая может блокировать ферментацию, зависит, в частности, от типа дрожжей. Влияние этанола на различные функции дрожжей было хорошо изучено. Добавление спирта в питательную среду приводит к удлинению латентной фазы, которая напрямую зависит от количества присутствующего спирта; экспоненциальная фаза роста удлиняется, а общий рост уменьшается. Цель настоящей работы -исследование жизнеспособности клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae [3] в зависимости от дозы облучения в присутствии кислорода воздуха, а также исследование влияния добавок этанола на рост и жизнеспособность дрожжевых клеток в пострадиационный период на фоне освещения клеток видимым светом.
Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae Т-985 [4] проводили в аэробных условиях при перемешивании среды в колбах на термостатируемой качалке при 28°С, 150 оборотов/мин. Объем колб составлял 100 мл, объем простерилизованной среды в колбах - 50 мл. В зависимости от условий постановки эксперимента посевной материал составлял от 2 до 10% (объем.) Для сравнительной оценки использовали варианты
культивирования с дрожжами, последовательно адаптируемыми к внесению этилового спирта (EtOH) с освещением содержимого колб с уровнем световой освещенности на поверхности колб 750 Лк. Состав среды для культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae, г/л: (N^^04 - 5,0; KH2PO4 - 1,0; KCl -0,15; MgSO4^7H2O - 0,2; дрожжевой экстракт - 0,5; сахароза -30; вода отфильтрованная, pH 5,8. Облучение растворов проведено с использованием рентгеновской установки Model-КАЛАН 4 в ИМСЭН-ИФХ РХТУ им. Д.И. Менделеева, мощность поглощенной дозы по дозиметру Фрикке равна 3 Гр/с [5].
В процессе пассирования и адаптации к этанолу проводили два параллельных варианта по 2 колбы в каждом варианте: вариант 1 - контроль без внесения EtOH и вариант 2 - с внесением EtOH на 18-19 час культивирования в количестве 15 г/л. В конце процесса культивирования отбирались аликвоты дрожжевой суспензии, переносились в стеклянные пробирки объемом по 1,5 мл и добавлялось по 1,5 мл воды в пробирку, затем через 30 минут их облучали в дозах до 1.6 кГр. После облучения все образцы хранили в условиях освещения пробирок видимым светом.
За изменением жизнеспособности дрожжей наблюдали стандартным методом [6] путем введения в систему красителя метиленового синего с дальнейшим подсчетом доли мертвых клеток под микроскопом.
При облучении дрожжевых клеток в дозах 30 Гр, 75 Гр и 150 Гр наблюдалась высокая жизнеспособность дрожжевых клеток к действию рентгеновского облучения сразу после облучения и при последующем выдерживании дрожжевой суспензии на свету с уровнем освещенности 750 Лк.
ai
g 35 I 30
125
I 10
0 400 800 1200 1600
Изменение дозы, Гр
Рис. Изменения доли мёртвых дрожжевых клеток в
зависимости от дозы и времени после облучения (измерения непосредственно после облучения и через сутки). 1- контроль, 2 - с этанолом, 3 - контроль через 24 часа после облучения, 4 - с этанолом через 24 часа после облучения
Следовательно, воздействие ионизирующего излучения до дозы 150 Гр не влияет на жизнеспоспособность дрожжевых клеток при наших условиях эксперимента. При дозах выше 150 Гр зарегистрировано инактивирование дрожжевых клеток с постепенным увеличением доли мертвых клеток при дальнейшем воздействии ионизирующего излучения на системы. В этих условиях доля мёртвых клеток в варианте с внесением этанола по сравнению с вариантом без его внесения выше и растет с увеличением дозы облучения. Доля мёртвых клеток в пострадиационный период (при облучении c 400 Гр до 800 Гр) мало отличались (в пределах нескольких %) от доли клеток, измеренной непосредственно после облучения как для варианта с внесением этанола, так и без его внесения. Полученные результаты свидетельствуют, что дрожжевые клетки с внесением EtOH в использованных концентрациях менее устойчивы к облучению по сравнению с контролем; существенных изменений в доле живых клеток не наблюдается в пост-радиационный период по сравнению с измерением, проведенным непосредственно после облучения, т.е. фактор времени измерения, прошедшего после облучения, менее существенен по сравнению с другими факторами. Клетки, пережившие облучение в условиях эксперимента (с освещением среды с дрожжевыми клетками видимым светом), остаются жизнеспособными в течение достаточно длительного периода.
Список литературы
1. Молекулярная генетика дрожжей сахаромицетов [электронный ресурс], режим доступа: https://docplayer.ru/54118081 -S-v-buryachenko-molekulyarnaya-genetika-drozhzhey-saharomicetov.html (дата обращения 28.4.2020)
2. Влияние спирта на активность дрожжей [электронный ресурс], режим доступа: http://filimonov.vladimir.rU/samogon/stat/7 1.php (дата обращения 27.4.2020).
3. Gunter S.E., Kohn H.I. Effect of X-rays on the survival of bacteria and yeast // Journal of bacteriology, 1956. Vol. 72, P. 422-428.
4. Патент РФ № 2394098. Способ культивирования дрожжей для спиртового производства.
5. Пхйьо Мьинт У. Реакционная способность донника, багульника, муррайи и некоторых кумаринов в их составе. Дисс. на соис. учен. степени к.хим.н. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2018. - 145 с.
6. Калёнов С. В. Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса. Дисс. на соис. учен. степени к.т.н. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. - 197 с.
