CC BY
9
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ФЕРМЕНТИРОВАНИЯ НА РАСЩЕПЛЕНИЕ ГЛИКОЗИДНОЙ СВЯЗИ БЕТАНИНА В ВОДНОМ РАСТВОРЕ
В.Р. Степанянц1, студент
М.А. Тимошенко2, студент
Ю.Д. Соколова2, канд. хим. наук, доцент
Российский технологический университет
2Обнинский институт атомной энергетики НИЯУ МИФИ
1(Россия, г. Москва)
2(Россия, г. Обнинск)
DOI:10.24412/2500-1000-2021-11-2-131-135
Аннотация. Данное исследование направлено на изменение структуры красителя свекольного красного с целью влияния на его стабильность в водных растворах. Для этой цели использовались ферменты гидролазы, расщепляющие гликозидную связь. Было доказано активное действие ферментов в отщеплении от красителя гликозидного остатка. Подобран более активный фермент.
Ключевые слова: ферменты, бетанин, краситель свекольный красный, стабилизация, гидролиз.
Ферменты являются частью биологических систем и имеют очень специфическое действие, поэтому их можно использовать для изучения конкретных превращений или механизмов реакций, не боясь образования побочных продуктов [1]. В особенности, интересно влияние глюкозидаз на стабильность бетанина в водных вытяжках. Данный класс ферментов действует непосредственно на пигмент, изменяя его структуру. Анализ устойчивости результирующих систем поможет пролить свет на принципы стабилизации красителя свекольного красного.
В работе использовались сухие пластины свеклы столовой толщиной 1 мм, из которых готовились водные вытяжки при комнатной температуре. Содержание сухого продукта составляла 0,5 г/50 мл.
Для приготовления ферментированных растворов бетанина содержимое колб с водными вытяжками бетанина количественно переносили в конические колбы объёмом 50 мл, затем на аналитических весах отбирали навеску 0,0100 г одного из
трёх ферментных препаратов: «Амилосуб-тилин», «Глюкаваморин» и «Глюкоамила-за». Растворы оставляли на открытом воздухе при комнатной температуре до изменения окраски или обесцвечивания.
Редуцирующие сахара в растворах бе-танина определяли фотометрическим способом методом градиуировочного графика с использованием щелочного раствора Кз[Бе(СК)б] [2]. Исследования проводили на фотоколориметре «КФК-3М», длина волны X = 440 нм в кюветах с шириной светопоглощающего слоя I = 0,3065 см.
Углеводы способны образовывать гли-козидные связи между гидроксильной группой, сформировавшейся в результате циклизации углевода и заместителем. В водной среде данные связи легко гидроли-зуются в кислой среде, либо в присутствии ферментов. Кислотный гидролиз протекает преимущественно из циклической формы по достаточно простому механизму (рис. 1).
Рис. 1. Механизм кислотного гидролиза гликозидной связи
В общем виде ферментативный гидролиз протекает следующим образом: при взаимодействии субстрата с ферментом происходит образование фермент-субстратного комплекса, затем молекула воды нуклеофильно атакует соседний атом
углерода и происходит расщепление гликозидной связи. В случае амилаз (ферментов, расщепляющих а-1,4-глюкозидные связи [3]) механизм гидролиза можно представить следующим образом (рис. 2):
ОН <р ^__он ~С1Н
н он
Рис. 2. Механизм ферментативного гидролиза гликозидной связи
Молекула бетанина содержит гликозид-ную связь в положении 5, при этом углеводной частью является глюкоза [5], которая подавляет электронодонорную способность гликозидного атома кислорода,
связанного с индольным ядром [6]. Такой эффект наблюдается из-за наличия в глюкозе ещё пяти атомов кислорода, проявляющих отрицательный индуктивный эффект (рис. 3).
Рис. 3. Электронные эффекты в молекуле глюкозы. Прямоугольником выделена глико-
зидная гидроксильная группа
В результате совместного действия этих групп электронная плотность оказывается смещена с гликозидного атома кислорода в сторону глюкопиранозного ядра, в результате чего положительный мезомерный
эффект данного атома в сопряжённую п-электронную систему бетанина оказывается сниженным. Это приводит к тому, что на атоме углерода альдиминовой связи в бетанине наблюдается ещё больший дефи-
цит электронной плотности, чем в молекуле бетанидина, где нет гликозидной связи. Таким образом, нуклеофильная атака по данному месту ещё более облегчается. Этим фактом может быть обусловлена нестабильность бетанина в кислых и ферментативных амилазных средах.
Влияние присутствия гидролаз на кинетику образования редуцирующих сахаров
Было исследовано влияние гидролаз на кинетику образования редуцирующих сахаров. Гидролазы - это ферменты, катализирующие реакции гидролиза [4]. В частности, реакцией гидролиза является реакция расщепления гликозидной связи, присутствующей в молекулах бетанина и сахарозы, входящих в состав свеклы [7]. Отмечалось, что растворы, содержащие ферменты, намного сильнее ебесцвечива-лись при хранении, чем ристворь^в кото-
рые ферменты не добавлялись. Это свидетельствует о гораздо большем содержании сахаров, способных восстанавливаться, чем может образоваться при полном расщеплении сахарозы без добавления фермента, входящей в состав корнеплода .
Подтверждает данное утверждение и кинетические кривые, полученные при выдерживании ферментированных вытяжек на воздухе в течении 6 дней, представленных на рисунке 4 для различных марок ферментов типа гидролаз.
Из рисунка 4 видно, что ферменты имеют разную активность в одинаковых условиях. В литературных источниках указывается, что концентрация продукта ферментативной реакции в условии избытка фермента описывается кинетиче-cквмypетнeаием первого порядка [8,9].
0,02000
od 0,01500 о
5 0,01000
0,00500 0,00000
3 T
I_____ j ^^ 4 —I—
;; ____' T___ " 1 1
i 1 •-
2 i i
--1—1—1—1—I—1—1—1—1— —1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1— —1—I—1—H
20
40
60
80
100
120
т, ч
Рис.4. Кинетические кривые содержания редуцирующих сахаров в растворах бетанина 1 - Без ферментов, 2 - с «Амилосубтилином», 3 - с «Глюкаваморином», 4 - с «Глюкоами-
лазой»
С помощью программы «OrigmPш» была произведена аппроксимация снятых зависимостей и получены значения для эффективных констант скорости реакций кэ. Эти константы пропорциональны константам Михаэлиса Кт, которые описывают сродство фермента к субстрату, а соответственно и эффективность действия фермента. Низкие значения констант соответствуют высокой степени сродства и наоборот. Наиболее эффективным ферментным препаратом оказался «Глюкава-морин» (кЭ = 0,03391-), наименее актив-
1
ным - «Амилосубтилин» (кэ = 0,12501-).
Замечателен тот факт, что некоторое накопление редуцирующих сахаров в растворе протекает и в отсутствии ферментов (кривая 1). По форме кривой можно предположить, что реакция так же является ферментативной, т. е. в свекле содержится фермент типа гидролаз. Данный вывод подтверждается проводимыми в этой области исследованиями [5].
Для того, чтобы убедиться в непосредственном влиянии ферментов на бетанин, был проведён эксперимент по снятию кинетической кривой содержания редуцирующих сахаров в растворе сахарозы в присутствии фермента. Для этой цели был вы-
0
бран наиболее эффективный «глюкавамо-рин». Для подавления побочных процессов раствор хранился в вакууме. Результаты представлены на рисунке 5.
Эффективная константа скорости реакции для «Глюкаваморина» иказалась равна
0,00554-, что примерно в 6 раз меньше,
чем в опыте с бетанином, соответственно сродство фермента с сахарозой больше, чем с бетанином.
0,008 0,007 § ^ 0,006 ^ 0,005 ° 0,004 § Ц 0,003 ¥ 0,002 | 0,001 I 0,000
Рис. 5. Кинетическая кривая содержания редуцирующих саьаров в растворе в присутствии
фермента в вакууме
собны отщеплять глюкозу от молекулы бетанина, тем самым переводя её в бета-нидин. Также данный эксперимент показывает, что электроноакцепторные группы способствуют более быстрой деградации молекулы бетанина и введение ацильных групп, используемые многими исследователями для стабилизации красителя, является неблагожелательным.
Приняв во внимание то, что в свекле изначальное содержание сахарозы пренебрежимо мало, а отсутствие воздуха не влияет на активность ферментов, можно сделать вывод, что выбранные для опыта ферменты действительно способны катализировать расщепление гликозидной связи в молекуле бетанина.
Таким образом, выбранные нами ферменты типа гидролаз действительно спо-
Библиографический список
1. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: Пер. с англ. - М.: Мир, 1982. - Т. 1 - 392 с.
2. Данина М.М., Сергачева Е.С., Соболева Е.В. Методы исследования свойств сырья, полуфабрикатов, готовых хлебобулочных и кондитерских изделий. Лабораторные работы: Учеб.-метод. Пособие. - СПб.: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2013. - 57 с.
3. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: Пер. с англ. - М.: Мир, 1982. - Т. 2 - 515 с.
4. Коротько Г.Ф. Гидролазы пищеварительных желез в крови: не только информационно-диагностические аспекты // Журнал фундаментальной медицины и биологии. - № 3. - Ростов-на-Дону.: типография ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России, 2017 г. - с. 1420.
5. Новиков Н.Н. Биохимия растений. - М.: Колос, 2012. - 679 с.
6. Реутов О.А., Курц А.Л., Бутин К.П. Органическая химия. - 7-е изд. - М.: Лаборатория знаний, 2017 г. - Ч. 3. - 570 с.
7. Moreno D.A., Garcia-Viguera C., Gill J.I., Gil-Izquierdo A. Betalains in the era of global agri-food science, technology and nutritional health // Phytochemistry Reviews. - Vol. 7. - The Netherlands.: Springer Netherlands, 2008. - p. 261-280.
8. Кудряшева Н.С. Физическая и коллоидная химия. - 2-е изд. - М.: изд. Юрайт, 2019 г. - 379 с.
9. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия. - 4-е изд., испр. - М.: Высш. шк., 2001. - 527 с.
т. ч
STUDY OF THE FERMENTATION EFFECT ON THE CLEAVAGE OF THE BETANIN GLYCOSIDIC BOND IN AQUEOUS SOLUTION
V.R. Stepanyants1, Student M.A. Tymoshenko2, Student
Yu.D. Sokolova2, Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor 1Russian Technological University,
2Obninsk Institute of Nuclear Power Engineering, National Research Nuclear University MEPhI
1 (Russia, Moscow)
2 (Russia, Obninsk)
Abstract. This study aimed to change the structure of beet red dye in order to influence its stability in aqueous solutions. Hydrolase enzymes that cleave the glycosidic bond were used for this purpose. The enzymes were shown to be active in stripping the glycosidic residue from the dye. A more active enzyme was selected as a result.
Keywords: enzymes, betanin, Beetroot Red, stabilization, hydrolysis.
