CC BY
19
I
Орипнальы досл1дження
Original Researches
' равма
УДК 616.314-089.843:611.018.4+615.464:666.597.001.365+546.28
МАЛАНЧУКВ.О.1, ПАНЧЕНКО Л.М.2, ЖУКОВЦЕВА О.1.1, КИСЕЛЬОВ В.С.3, ЧЕПУРНИЙ Ю.В.1
1Нац1ональний медичний университет ÍMeHÍ О.О. Богомольця, м. Ки'/в
2ДУ «1нститут травматологи та ортопедИ НАМН Укра1ни», м. Ки'/в
31нститут фiзики напiвпровiдникiв 'мен'! В.£. Лашкарьова НАН Украни, м. Ки1в
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ВПЛИВУ БЮМОРФНОТ KEPAMÍKM НА OCHOBÍ КАРБ1ДУ КРЕМЛЮ НА КУЛЬТУРУ ОСТЕОГЕННИХ КЛ1ТИН-ПОПЕРЕДНИЮВ KÍCTKOBOrO
МОЗКУ
Резюме. У роботi досл1д>кено взаемодю боморфно¡ керамки на основ1 карбду кремню з культурою ос-теогенних клтин-попередниюв ксткового мозку людини. Установлено, що остеогеннi стромальн клтини-попередники ксткового мозку людини при взаемодП з боморфною керамкою на основi карбду кремню виявили здатнсть до пролiферацfi та диферен^аци з формуванням колонiй, причому прирст багатошаро-вих у середньому становив 43,0 ± 8,5 %, що свдчить про вдсутнють цитотоксичност досл^куваного мате-рiалу Ефективнсть клонування колонiеутворюючих одиниць фiбробластiв у присутност бо-БЮ становила 22,6 ± 5,9коло^й, що вказуе навдсутнють негативноговпливудосядккуваного матерiалунаструктуроутво-рюючий потен^ал стромальних фiбробластiв.
Ключом слова: боморфна керамка, карбд кремню, стромальн фiбробласти, iмплантацiйний матерiал.
Вступ
Одним i3 актуальних питань сучасного медичного MaTepiai03HaBCTBa е пошук i розробка нових iмпланта-цшних матерiалiв для розширення арсеналу лкуваль-них 3HTO6iB при усуненш посттравматичних ысткових дефектав та деформацш. Проведення хiрургiчних утру-чань часто вимагае застосування штучних матер1ал1в як фiксаторiв ысткових фрагменпв, опор для утримання форми чи каркасу при замщенш ысткового дефекту тощо.
Потенцшно перспективний вид бюморфно! керамь ки для усунення посттравматичних дефектав та деформацш, створений вщповщно до принцитв бiомiмети-ки, розроблено в 1нститул фiзики напiвпровiдникiв iменi В.6. Лашкарьова НАН Укра!ни шляхом просо-чування кремнiем канальних вуглецевих матриць, що отримують внаслiдок пiролiзу (обвуглювання) рiзних сортiв деревини. Використання вуглецево! матри-цi бiологiчного об'екту дозволяе отримати матерiал, псевдоморфний цьому об'екту, який мае аналогiчну бюлопчному зразку структуру на мiкро-, мезо- та ма-крорiвнях. Такi природш iерархiчнi пористi структури мають високий рiвень складностi, який недоступний при шших сучасних технологiях !х виготовлення [2, 7].
Першочерговим завданням дослщження бюсушс-ностi будь-якого матерiалу е вивчення ступеня його токсичностi щодо живих клiтин органiзму. Вiдсутнiсть руйнуючо! дй' на клiтини та токсичного впливу на ма-кроорганiзм е одшею з головних вимог до матерiалiв,
що планують використовувати для виготовлення iMn-лантатiв рiзного призначення. Важливою ознакою бюлопчно'1 сумiсностi iмплантацiйного матерiалу слiд вважати здатнiсть живих клггин розмножуватись та функцiонувати в його присутноста, оскiльки дана влас-тивiсть живих клiтин залежить вщ впливу оточуючого середовища.
Однieю з ефективних моделей дослщження цито-токсичностi та бюсумюносп iмплантацiйного матерiа-лу, наближеною до умов in vivo, e методика клонування колошеутворюючих одиниць фiбробластiв (КУОф). Даний метод дозволяе вивчити взаемодш iмпланта-цiйних матерiалiв та остеогенних клгтин-попередниыв кiсткового мозку in vitro, íx вплив на переб^ клп,инно'1 пролiферацií та диференцiацií, зробити висновок про наявнють чи вщсутнють цитотоксичного впливу досль джуваного матер1алу на клiтини [4].
Мета дослщження. У данiй роботi ми ставили за мету дослщити вплив нового iмплантацiйного матерь алу, бiоморфноí' керамши на основi карбiду кремнiю (бю-SiC), на диференцiацiю та пролiферацiю культури
Адреса для листування з авторами: Чепурний Юрiй Володимирович E-mail: [email protected]
© Маланчук В.О., Панченко Л.М., Жуковцева О.1., Кисельов В.С., Чепурний Ю.В., 2015 © «Травма», 2015 © Заславський О.Ю., 2015
клiтин стромальних фiбробластiв, на 0CH0Bi чого ощ-нити CTyniHb '11 цитотоксичностi.
Об'ект i методи досл1дження
Для досягнення поставлено'1 мети нами використа-но методику клонування in vitro за А.Я. Фрщенштей-ном (1973) [3, 5] у модифшаци В.С. Астахово'1 (1982) [1].
Забiр спонгiози для дослiдження проводився з кри-ла клубово'1 кiстки пащентав ортопедичного профiлю поза вогнищем запалення чи дегенеративно-дистро-фiчних процесiв тстково! тканини згiдно з Гельсш-ською декларацiею. Клiтини кiсткового мозку зi спон-гюзно'1 истки вимивали в середовищi 199 на магнiтнiй мшалщ, потiм за допомогою камери Горяева проводили шдрахунок вимитих ядровмюних клiтин з об'ему зразка спонпози, що вивчався. Об'ем останнього ви-значався за об'емом рiдини, що була витаснена. Шдсад-ку истковомозкових клiтин проводили в чашках Петрi (дiаметр дна 10 см) з розрахунку 5 х 103 на 1 см2 дна чашки. Як фщер використовували летально опромше-ш (50—60 Гр) клiтини исткового мозку кроля. У чашку додавали культуральне середовище 199 з 20% вмютом сироватки кровi людини. У дослщш чашки помiщали зразки ксеногенного пдрокшапатиту (ксеноГАП), син-тетичний гiдроксiапатит (синтГАП) та бю-SiC.
Чашки Петрi розмщували в ексикатори с газовою сушшшю з 5% вмiстом СО2 в атмосферному повгщ та культивували в термостата при температурi 37 °С протягом 14 дiб без змши культурального середови-ща. Пiсля закшчення строкiв культивування (14 дгб) культури фшсували 96% етанолом та забарвлювали за Романовським — Гiмзе. Шдрахунок колонш в чашках проводили за допомогою мшроскопа Olympus. За колонш вважали накопичення 50 та бтьше стромальних фiбробластiв исткового мозку.
Результати оцшювали за показником ефективноста клонування стромальних фiбробластiв исткового мозку на 105 ядровмiсних клггин исткового мозку — сшв-вщношення кiлькостi колонiй, що виросли, до числа пщсаджених у чашку Петрi клiтин. За колонiю вважа-
ли накопичення клггин, не менше н1ж 50 фiбробластiв. Ефективнiсть клонування (ЕКУОф) стромальних стовбу-рових клiтин исткового мозку оцiнювали за формулою: ЕКУОф = N/M, де N — ильисть колонiй, що виросли, помножена на 105, M — юлькють пiдсаджених клiтин.
Контролем слугували культури цих же клггин, що були вирощеш при аналопчних умовах без внесення в чашку Петрi жодних матер1ал1в. Окремо тдрахову-вали кшьисть багатошарових колонiй серед усiх, що виросли в чашщ. Вивчення впливу бю-SiC на культуру стромальних фiбробластiв проводилося в порiвняннi з контролем i гiдроксiапатитами синтетичного та ксеногенного походження.
Вибiр матерiалiв на основi ГАП рiзного походження пов'язаний з 1х широким використанням для замщення дефектiв истково! тканини та проведення остеопластики в травматологй'. Даний вибiр також був обГрунтова-ний експериментально та клiнiчно доведеною бюсушс-нiстю та вiдсутнiстю цитотоксичноста зазначеного виду iмплантацiйних матерiалiв. В експеримента дослiджено зразки матерiалiв вщомих виробниив, що пройшли фармакологiчну реестрацш, дозволенi для використан-ня та широко застосовуються в клiнiчнiй практищ.
Оскiльки при проведеннi експерименту забiр кль тин-попередникiв кiсткового мозку проводився в одного пащента з метою забезпечення однакових умов для 1х клонування, кшьысть матерiалу для дослщження була обмеженою. Тому для статистично'1 обробки нами обрано параметричний критерш Манна — Уíтнi, який може бути використаний при малих вибiрках (n > 3) при р = 0,9-0,95.
Результати досл1джень i ix обговорення
У результата проведеного дослщження виявлено рiст та розмноження остеогенних клгган-попереднитв кiсткового мозку людини в ушх серiях експерименту з формуванням колонш. У присутноста дослщжувано! бюморфно'1 керамiки виявлено рют як одношарових (рис. 1), так i багатошарових колонiй (рис. 2), причому
Рисунок 1. М1крофотограф1я колон!й остеогенних стромальних клтин юсткового мозку, що виросли в присутност бо-SiC
Рисунок 2. М1крофотограф1я багатошаровоi колони, що виросла в присутност бю-SiC
48
Травма, ISSN 1608-1706
Том 16, №4 • 2015
Таблиця 1. Вплив дослджуваних матер1ал1в на клоногенну активнсть стромальних стовбурових клтин ^сткового мозку людини in vitro
Назва К-сть унесе-них кл^ин К-сть кл^ин фщера К-сть колонш Багатошаровi колони Прирют, % Ефектившсть клонування
Контроль 8,26 х 105 2 х 107 195,3 ± 31,2 93,7 ± 59,5 46,3 ± 27,2 23,6 ± 3,8
Бю-SiC 8,26 х 105 2 х 107 186,6 ± 48,6 83,0 ± 36,5 43,0 ± 8,5 22,6 ± 5,9
КсеноГАП 8,26 х 105 2 х 107 205,0 ± 40,7 118,3 ± 17,9 60,0 ± 18,5 24,8 ± 4,9
СинтГАП 8,26 х 105 2 х 107 165,3 ± 24,4 70 ± 30 41,2 ± 12,1 20 ± 3
середнш прирют колонш становив 43,0 ± 8,5 %. Ви-явлено, що ефективнiсть клонування при додаванш в культуру клiтин бю-SiC становила 22,6 ± 5,9 КУОф серед 105 ядровмiсних клiтин, що дозволяе оцiнити рь вень пролiферащl та диференцiацii клiтин у культурi як високий.
Даний показник характеризуе потенщал дифе-ренцiацii культури клiтин у присутност даного iMn-лантацiйного матер1алу. Вiдповiдно, здатнiсть клiтин розмножуватися та диференцшватися з утворенням колонiй в присутност бiо-SiC свiдчить про вщсутнють негативного впливу на культуру стромальних фiбро-бластiв та цитотоксичностi дослщжуваного матерiалу.
При порiвняннi отриманих даних у рiзних серiях дослiдження мiж собою було виявлено, що серед ушх вивчених зразкiв матерiалiв найвищi результати вза-емоди з культурою клггин виявив ксеноГАП, причому результати були кращими, нiж у контролi (табл. 1). На другому мюп опинився бiо-SiC, на третьому — синт-ГАП. Результати 1х виявились нижними, нiж у конт-рольнш групi (рис. 3).
Разом iз тим статистично вiрогiдноi' рiзницi в про-аналiзованиx показниках не виявлено; це дозволяе стверджувати, що вш дослiджуванi зразки виявили вщ-сутнють цитотоксичностi щодо культури клiтин, а та-кож не вплинули негативно на структуроутворюючий потенщал остеогенних клгган-попередниыв.
Але, незважаючи на вiдсутнiсть статистично вь рогiдноi' рiзницi в результатах дослщжень, фактичнi рiвномiрнi й послщовш ix вiдмiнностi дозволяють ви-словити припущення, що з пiдвищенням рiвня мь кроструктурно! подiбностi iмплантацiйного матерiалу
30 25
■е-
i >20
0 ^
1 сс тх15
со
£ _ 10
■е- "
ш
о
§ 5
0
Контроль Бiо-SiC Ксено-ГАП Синт-ГАП
Рисунок 3. Ефективнсть клонування стромальних стовбурових клтин ксткового мозку в контрол! та в досл!д!
кютковш тканини зростае його позитивний вплив на пролiферацiю, диференщащю та структуроутворюючий потенщал КУОф.
Висновки
На основi проведеного дослщження встановлено, що остеогенш стромальш клiтини-попередники кют-кового мозку людини в культурi тканин при взаемодц з бiоморфною керамiкою на основi карбiду кремнiю виявили здатнють до пролiферацii та диференцiацii з формуванням колонш, причому прирют багатошаро-вих у середньому становив 43 ± 8,5 %, що свщчить про вiдсутнiсть цитотоксичностi дослiджуваного матер1алу. Ефективнiсть клонування КУОф у присутност бiо-SiC становила 22,6 ± 5,9, що свщчить про вiдсутнiсть негативного впливу дослщжуваного матерiалу на структуроутворюючий потенщал стромальних фiбробластiв.
Це дае нам можливють зробити висновок, що бю-SiC е бюсумюним матерiалом i закладае пiдГрунтя для про-ведення подальших експериментальних дослщжень вза-емоди бюморфно1 керамiки на основi карбщу кремнiю.
Список л1тератури
1. Астахова В.С. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга человека. — К.: Феникс, 2000. — 176с.
2. Беляев А.Е. Карбид кремния: технология, свойства, применение / Под ред. Р. В. Конакова— Х.: ИСМА, 2010. — 532 с.
3. Фриденштейн А.Я., Петракова К.В., Куралесова А.Н. и др. Клетки-предшественники для остегенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантатов костного мозга // Цитология. — 1968. — № 5. — С. 557-567.
4. Малишкта С.В., Дедух Н.В. Медико-бiологiчнi до-aaiдження штучних бiоматерiалiв для ортопеды та травматологП // Ортопедия, травматология и протезирование. — 2010. — № 2. — С. 93-100.
5. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники.— М.: Медицина, 1973. — 223 с.
6. Cordonnier T., Sohier J., Rosset P., Layrolle P. Biomimetic materials for bone tissue engineering-state of the art and future trends //Adv. Eng. Mater. — 2011. — № 13. — P. 135-150.
7. Yukhymchuk V.O., Kiselov V.S., Belyaev A.E. et al. Synthesis, morphological and structural properties of bio-SiC ceramics // Functional materials. — 2010. — Vol. 17, № 4. — P. 520-527.
Отримано 20.08.15 ■
МаланчукВ.А.1, Панченко Л.М.2, Жуковцева Е.И.1, Киселев В.С.3, Чепурной Ю.В.1 Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, г. Киев
2ГУ «Институт травматологии и ортопедии НАМН Украины», г. Киев
3Институт физики полупроводников имени В.Е. Лашкарева НАН Украины, г. Киев
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БИОМОРФНОЙ КЕРАМИКИ НА ОСНОВЕ КАРБИДА КРЕМНИЯ НА КУЛЬТУРУ ОСТЕОГЕННЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ КОСТНОГО МОЗГА
Резюме. В работе исследовано взаимодействие биоморфной керамики на основе карбида кремния с культурой остеогенных клеток-предшественников костного мозга человека. Установлено, что остеогенные стромальные клетки-предшественники костного мозга человека в культуре тканей при взаимодействии с биоморфной керамикой на основе карбида кремния проявили способность к пролиферации и дифференциации с формированием колоний, причем прирост многослойных в среднем был 43,0 ± 8,5 %, что свидетельствует об отсутствии цитотоксичности исследуемого материала. Эффективность клонирования колониеобразующих единиц фибробластов в присутствии био-SiC составила 22,6 ± 5,9, что указывает на отсутствие негативного влияния исследуемого материала на структурообразующий потенциал стромальных фибробластов.
Ключевые слова: биоморфная керамика, карбид кремния, стромальные фибробласты, имплантационный материал.
Malanchuk V.A.1, Panchenko L.M.2, Zhukovtseva A.I.1, Kiseliov V.S.3, Chepurnoi Yu.V.1
1National Medical University named after O.O. Bohomolets, Kyiv
2SI «Institute of Traumatology and Orthopedics of NAMS of Ukraine», Kyiv
3Institute of Physics of Semiconductors named after V.E. Lashkariov of NAS of Ukraine, Kyiv, Ukraine
RESEARCH OF BIOMORFIC CERAMICS BASED ON SILICON CARBIDE IN CELL CULTURE OF THE OSTEOGENIC MARROW CELLS PRECURSOR
Summary. This article presents the study's results of the interaction ofbiomorphic ceramics based on silicon carbide with tissue culture of the osteogenic stromal stem cells in the experiment. Human osteogenic stromal marrow precursor cells were found to be able to proliferate and differentiate with forming colony in tissue culture being interacting with biomorphic ceramics based on silicone carbide. At that multilayer colonies medium growth was 43.0 ± 8.5 %. That demonstrates the absence of cytotoxicity of investigating material.
The efficiency of cloning of fibroblasts colony-forming units was 22.6 ± 5.9 that demonstrates the absence of negative impact of the material on structure forming potential of stromal fibroblasts
Key words: biomorfic ceramics, silicon carbide, stromal fibroblasts, implantation material.
50
Травма, ISSN 1608-1706
TOM 16, №4 • 2015
