CC BY
30
I
Орипнальы досл1дження
Original Researches
Травма
УДК 612.085.2:57.086.83:611.018.46:546.185:546.41:53.086 DOI: 10.22141/1608-1706.4.17.2016.77488
ТОВСТОНОГГ.Б.1, ПАНЧЕНКОЛ.М.2, СИЧ О.€.1
11нститут проблем матер'юлознавства iм. 1.М. Францевича НАН Украни, м. Ки/в, Укра/на 2ДУ «1нститут травматологи та ортопедИ НАМН Укра/ни», м. Кит, Укра/на
ЕФЕКТИВНЮТЬ КЛОНУВАННЯ СТОВБУРОВИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛ1ТИН ЮСТКОВОГО МОЗКУ ЛЮДИНИ В ПРИСУТНОСП ПДРОКаАПАТИТНОТ КЕРАМкИ,
ОТРИМАНО1 методом мкрохвильового
ТА ТРАДИЦМНОГО СПкАННЯ
Резюме. Проведено пор'вняльне дослдження ефективност клонування стовбурових стромальних клтин ксткового мозку людини в присутност зразкв керамики на основi богенного адрокаапатиту, як1 отриман1 методами традицйного та мкрохвильового спикання. Для оцнки ефективност клонування було вико-ристано метод клонування остеогенних клтин-попередникв ксткового мозку за О.Я. Фрденштейном у модифкаци В.С. Астахово!. Установлене суттеве пдвищення показникв остеогенно! активност стовбурових стромальних клтин ксткового мозку клубово! кстки людини в присутност керамики, що виготовлена методом мкрохвильового спкання, порiвняно з керамикою, отриманою методом традицйного спкання, де спостергалось пригнчення остеогенно! активност.
Ключовi слова: пдрокс'юпатит, м'икрохвильове спкання, стовбуровi стромальн клтини ксткового мозку, ефективнсть клонування.
Публжащя мктить результати до^джень, про-ведених за грантом Президента Украши за конкурс-ним проектом F63-3761 Державного фонду фунда-ментальних до^джень, а також за договором про наукову ствпрацю мiж 1нститутом проблем мате-рiалознавства м. 1.М. Францевича НАН Украши та ДУ «1нститут травматологи та ортопеди НАМН Украши».
На сьогодш актуальним в ортопедй' й травматологй' залишаеться пошук матерiалiв для замщення дефекпв ыстково! тканини, що утворились у результата травм та ix ускладнень, шфекцшних i онколопчних захворю-вань исток. Серед рiзноманiття iмплантацiйниx мате-рiалiв особливе мюце займають композици на основi пдрокшапатиту (ГА) як синтетичного, так i бюгенного (бюлопчного) походження завдяки його бюсумюносл та xiмiчнiй близькост до мiнеральноi складовоi при-родноi ыстки. Для отримання ГА керамши викорис-товують рiзнi методи, таы як традицiйне та мшрохви-льове сткання, гаряче пресування, iскрове плазмове спiкання, метод дублювання структури полiмерноi ма-трицi та iншi [3, 7, 11].
Одним iз перспективних способiв отримання ке-рамiки рiзного функцiонального призначення, у тому чи^ й медичного, з пiдвищеними мехашчними та
бiологiчними властивостями е сткання в середовищi мiкрохвиль. Застосування останшх не лише дозволяе покращити властивост керамiки, але й суттево знизи-ти енергозатрати на виробництво завдяки зменшенню тривалостi термообробки матерiалу [5, 8, 10].
У нашш попереднш роботi [12], присвяченiй по-рiвняльному дослiдженню структури та властивос-тей зразшв керамiки на основi бюгенного пдроксь апатиту (БГА), отриманих методом мкрохвильового та традицiйного спiкання, було встановлено, що мь крохвильове сткання БГА в iнтервалi температур 800-1100 °С значно знижуе (у 2 рази) розмiр зерна в керамщ порiвняно з традицiйним спiканням, збшь-шуе мiцнiсть на стискання керамши та ii розчиннiсть у фiзiологiчному розчинi зi збереженням при цьому фазового складу.
Адреса для листування з авторами: Товстоног Ганна Богдашвна
1нститут проблем матер1алознавства 1м. 1.М. Францевича НАН Украши, вул. Кржижановського, 3, м. Кигв E-mail: Ademida@i.ua
© Товстоног Г.Б., Панченко Л.М., Сич О.6., 2016 © «Травма», 2016 © Заславський О.Ю., 2016
Вщомо, що культура стовбурових стромальних клгтин (ССК) юсткового мозку людини е класичною моделлю для вивчення безпосереднього впливу ф1зичних та xi-м1чних (у тому числi фармакологiчниx та юстковозамш-них) чинникгв ex vivo [4, 9]. У купыyрi колонгеутворю-ючих одиниць фiбробластiв (КУОф) юсткового мозку людини протягом 14 дiб вiдбуваеться повний цикл ди-ференщаци вiд раннix попередникгв до остеобласт [6]. Для оцгнки ефективностi клонування ССК кiсткового мозку людини в присутносп зразкгв керамiки на основi БГА, якг отриманi методами традицшного та мгкрохви-льового спiкання, було використано метод клонування остеогенних клгтин-попередниюв кiсткового мозку за А.Я. Фрщенштейном у модифiкацii В.С. Астахово! [1, 2].
Мета роботи — дослгдити ефективнiсть клонування стовбурових стромальних клгтин кiсткового мозку людини в присутносп зразкiв керамiки на основi бгоген-ного гiдроксiапатиту, що виготовленг методами тради-цiйного та мгкрохвильового спiкання.
Матер1али i методи
Вихгдним мaтерiaлом для отримання зразкiв кера-мiки був бiогенний гiдроксiaпaтит «Остеоапатит ке-рамгчний» (Укра!на) з розмiром частинок до 160 мкм. Зразки цилгндрично! форми отримували методом дво-стороннього пресування при тиску 200 МПа. Спгкан-ня проводили у високотемпературнгй мiкроxвильовiй муфельнiй печi (1,5 кВт, 2,45 ГГц) та в муфельнгй печi СНОЛ при темперaтурi 900 °С з витримкою при максимально темперaтурi протягом 30 хв.
Для дослщження ефекгивностi клонування ССК юсткового мозку людини в присутносп керамжи на основi БГА використовували суспензiю ядровмiсниx клгган кiсгкового мозку зi спонгiози крила клубово! кiсгки пaцiентiв орто-педичного профтю поза осередками локального запален-ня та дегенерaтивно-дисгрофiчного ураження. Клнини кiсгкового мозку вимивали зi спонпози в середовищi 199 на магнинт мiшaлцi протягом 30 хв. Клонування КУОф проводили з використанням фщеру — летально опромгне-них клгган кiсгкового мозку кролика. Культивування проводили в чашках Петрг у живильному середовищг 199 з 20% умгстом сироватки кровг людини, при 37 °С протягом 14 дгб без змгни живильного середовища. Культури, якг виросли, фгксували 96% етанолом, забарвлювали за Романовським — Ггмзою. Результати оцгнювали за показником ефективносп клонування стромальних фгбробласпв юсткового мозку серед 105 ядерних клгтин — сшввщношення юлькосп колонгй, якг виросли, до юлькосп клгтин, якг було посаджено в чашку Петрг. За колонгю приймали скупчення клгтин, що мгстить не менше 50 фгбробласпв. Ефекгивнiсгь клонування КУОф юсткового мозку (ЕКУОф) розраховували за формулою:
Кшьккть колотй, hkí виросли, •105 ЕКУОф =_.
Кльксть клтин, посаджених у чашку Петр1
Контролем служили культури таких самих клгтин, якг були вирощенг в аналоггчних (стандартних) умовах без додавання зразкгв керамгки.
Результати i обговорення
На рис. 1 наведено структури зламiв зразюв БГА-керамши, отриманих методом скануючо! елек-тронно! мшроскопн (мiкроскоп РЭМ-106И (ВАТ «SELMI», Украша)), залежно вiд методу !х термо-обробки. Як видно з наведених мшрофотографш, для зразкiв, отриманих методом мшрохвильового спiкання, характерною е бiльш однорiдна структура з рiвномiрним розподiлом зерен та пор. У нашш роботi [12] було показано, що методом традицшного сшкання отримати зразки з рiвномiрною структурою вдаеться лише при 1100 °С. Це може свщчити про те, що мiкрохвилi спричиняють руйнування нестшких агломератiв часток та утворення дрiбнозернистоl однородно! структури при низьких температурах сшкання, тодi як при традицшному спiканнi однорiдна структура утворюеться бiльшою мiрою за рахунок ди-фузiйних процесiв, для перебiгу яких необхщш вищi температури. Таким чином, мшрохвильове спiкання дозволяе отримати зразки з рiвномiрною структурою при значно нижчих температурах, шж традицiйне сшкання, що може дати значний економiчний ефект при виготовленш керамiчних виробiв iз БГА.
Крiм того, у нашш попереднш роботi [12] було вста-новлено, що зразки БГА-керамжи, отриманi методом мiкрохвильового спiкання, мають пористiсть 40 % та мщшсть на стискання 37 МПа, що в 1,6—2 рази вище, шж при традицiйному спiканнi. Дослiдження in vitro показали, що при 36,5 ± 0,5 °С швидюсть розчинен-ня у фiзiологiчному розчинi (0,9% NaCl) зразкiв, спе-чених у середовищi мiкрохвиль, в 1,8 раза перевищуе цей показник у зразюв, отриманих методом традицш-ного сшкання (рис. 2). Це, на нашу думку, може бути пов'язане з особливостями структуроутворення при мшрохвильовому сшканш
На рис. 3 зображено колони ССК юсткового мозку, вирощених протягом 14 дiб у присутносп зразюв БГА-керамiки, що отриманi методами мшрохвильового та традицiйного спiкання, а також у контрольних чашках. Результатами клонування стромальних фiброблас-пв юсткового мозку були рiзнi за величиною одно- та багатошаровi колони. Слд вiдзначити, що утворення найбшьшо! кiлькостi колонiй, переважно багатошаро-вих, вщбуваеться в присутностi зразюв БГА-керамiки, спечено! з використанням мiкрохвиль, порiвняно з контролем, а також зi зразками керамiки, виготовле-ними традицшним спiканням, для яких характерним виявився найменший рiст колонiй, здебiльшого одно-шарових.
Величини ефективносп клонування ССК юсткового мозку серед 105 ядерних клггин у контролi та в присутносп БГА-керамши наведено на рис. 4. Як показали результати проведених дослщжень, най-вища ефективнiсть клонування остеогенних клгган-попередникiв кiсткового мозку людини спостерь гаеться у присутносп керамши, отримано! методом мiкрохвильового сшкання при температурi 900 °С. При цьому ефектившсть клонування майже в 2 рази вища за контрольш величини. У присутностi зраз-
46
Травма, p-ISSN 1608-1706, e-ISSN 2307-1397
Том 17, №4 • 2016
Рисунок 1. Мкроструктура зразюв БГА-керамжи, отримано/ методом мкрохвильового (а) та традиц!йного (б) сп!кання
Рисунок 2. Швидюсть розчинення зразюв БГА-керам1ки, отриманих методом мкрохвильового (НВЧ) та тради^йного (ТС) сп!кання, у фЫолопчному розчин! при 36,5 ± 0,5 °С
ыв керамши, спечених традицшно, спостертаеться пригшчення росту та диференшацп остеогенних кль тин-попередниыв ысткового мозку. Вщмшносп в ылькосп колонiй стромальних фiбробластiв статис-тично вiрогiднi.
Отже, зразки БГА-керамiки, отриманi методом мь крохвильового сшкання, не лише не пригшчують, але i сприяють активiзацii процесiв пролiферацif та дифе-ренцiювання остеогенних клиин-попередниыв ыст-кового мозку, що експериментально доводить мож-ливiсть та доцтьшсть клiнiчного застосування такого матерiалу для замщення кiсткових дефектiв рiзного походження.
Висновки
Порiвняльним дослiдженням ефективностi клонування стовбурових стромальних клгган ысткового мозку людини в присутносп зразыв БГА керамши, якi отриманi рiзними методами сшкання, встановле-но, що в присутносп зразыв, виготовлених методом мшрохвильового сшкання, ефектившсть клонування майже вдвiчi вища, нiж у контроль Додавання в
Рисунок 3. Колони ССК ксткового мозку людини (збльшення х 100) в контрол1 (а) та в присутност зразк!в БГА-керам1ки, отриманоi методом мiкрохвильового (б) та тради^йного (в) сп!кання. За-барвлення за Романовським — Пмзою
25
■е
Рисунок 4. Ефективнсть клонування ССК кст-кового мозку людини в контрол! та в присутнос-т зразк!в БГА-керам1ки, отриманихметодом мкрохвильового (НВЧ) та тради^йного (ТС) сткання
культуральну систему зразшв керамши, отриманих традицшним сшканням, значно пригшчуе picT i ди-ференцшвання ССК кюткового мозку, навпъ nopiB-няно з контролем.
Керамша на ocнoвi БГА, яка спечена в cеpедoвищi мкрохвиль, oптимiзуе процеси пpoлiфеpацil та дифе-ренщаци остеогенних клiтин-пoпеpедникiв исткового мозку людини, що робить цей матеpiал перспективним для медичного застосування.
Список л1тератури
1. Астахова В.С. Остеогенные клетки-предшественники
костного мозга человека / Астахова В.С. — К.: Феникс, 2000. — 176 с.
2. Коваленко В.Н. Культура стволовых стромальных кле-
ток костного мозга человека как модель для изучения прямого влияния фармакологических препаратов при остеоартрозе / В.Н. Коваленко, И.В. Лысенко, Л.М. Панченко // Украшський ревматологiчний журнал. — 2006. — № 3 (25). — C. 45-48.
3. Сафронова Т.В. Медицинское неорганическое матери-
аловедение в России: кальцийфосфатные материалы / Т.В. Сафронова, В.И. Путляев // Наносистемы: физика, химия, математика. — 2013. — 4 (1). — С. 24-47.
4. Bellucci D. A Revised replication method for bioceramic
scaffolds/ D. Bellucci, A. Sola, V. Cannillo // Bioceramics Development and Applications. — 2011. — Vol. 1. — P. 1-8.
5. Dasgupta S. Effect of grain size on mechanical, surface and
biological properties of microwave sintered hydroxyapatite/ S. Dasgupta, S. Tarafder, A. Bandyopadhyay [et al.] // Materials Science and Engineering: C. — 2013. — Vol. 33, № 5. — P. 2846-2854.
6. Gerhardt L.-C. Bioactive glass and glass-ceramic scaffolds
for bone tissue engineering / L.-C. Gerhardt, A.R. Boc-caccini // Materials. — 2010. — Vol. 3. — P. 38673910.
7. Hammel E.C. Processing and properties of advanced porous
ceramics: An application based review / E. C. Hammel, O.L.-R. Ighodaro, O.I. Okoli // Ceramics International. — 2014. — Vol. 40, Issue 10. — P. 15351-15370.
8. Kalita S.J. Nanocrystalline hydroxyapatite bioceramic us-
ing microwave radiation: Synthesis and characterization / S.J. Kalita, S. Verma // Materials Science and Engineering: C. — 2010. — Vol. 30, № 2. — P. 295-303.
9. Kokubo T. Bioceramics and their clinical applications /
T. Kokubo. — Boca Raton; Boston; New York; Washington, DC: CRC Press LLC, 2008. — 760р.
10. Nazira R. Rapid synthesis of thermally stable hydroxyapatite /R. Nazira, N. Iqbala, A.S. Khana [et al.] // Ceramics International. — 2012. — Vol. 38, № 1. — P. 457-462.
11. Sadat-Shojai M. Synthesis methods for nanosized hydroxyap-
atite with diverse structures/M. Sadat-Shojai, M.-T. Kho-rasani, E. Dinpanah-Khoshdargi, A. Jamshidi // Acta Bio-materialia. — 2013. — Vol. 9, Issue 8. — P. 7591-7621.
12. Tovstonog G.B. The Structure and properties of biogenic hydroxyapatite ceramics: microwave and conventional sintering / G.B. Tovstonog, O.E. Sych, V.V. Skorokhod// Powder Metallurgy and Metal Ceramics. — 2015. — Vol. 53, Issue 9. — P. 566-573.
Отримано 28.07.16 ■
48
Травма, p-ISSN 1608-1706, e-ISSN 2307-1397
TOM 17, №4 • 2016
ТовстоногА.Б.1, Панченко Л.М.2, Сыч Е.Е.1
1Институт проблем материаловедения им. И.Н. Францевича НАН Украины, г. Киев, Украина 2ГУ «Институт травматологии и ортопедии НАМН Украины», г. Киев, Украина
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КЛОНИРОВАНИЯ СТВОЛОВЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В ПРИСУТСТВИИ ГИДРОКСИАПАТИТНОЙ КЕРАМИКИ, ПОЛУЧЕННОЙ МЕТОДОМ МИКРОВОЛНОВОГО
И ТРАДИЦИОННОГО СПЕКАНИЯ
Резюме. Проведено сравнительное исследование эффективности клонирования стволовых стромальных клеток костного мозга человека в присутствии образцов керамики на основе биогенного гидроксиапатита, полученных методами традиционного и микроволнового спекания. Для оценки эффективности клонирования был использован метод клонирования остеогенных клеток-предшественников костного мозга по А.Я. Фриденштейну в модификации В.С. Астаховой. Установлено существенное увеличение показателей
остеогеннои активности стволовых стромальных клеток костного мозга подвздошной кости человека в присутствии керамики, полученной методом микроволнового спекания, по сравнению с керамикой, полученной методом традиционного спекания, где наблюдалось угнетение остеогенной активности.
Ключевые слова: гидроксиапатит, микроволновое спекание, стволовые стромальные клетки костного мозга, эффективность клонирования.
Tovstonoh H.B.1, Panchenko L.M.2, Sych O.Ye.1
1I.M. Frantsevych Institute of Materials Science of NAS of Ukraine, Kyiv, Ukraine
2SI «Institute of Traumatology and Orthopedics of NAMS of Ukraine», Kyiv, Ukraine
CLONING EFFICIENCY OF HUMAN BONE MARROW STEM CELLS IN THE PRESENCE OF HYDROXYAPATITE CERAMICS PREPARED BY MICROWAVE AND TRADITIONAL SINTERING
Summary. There was performed a comparative study of effective- hancement in osteogenous activity of human iliac stem stromal cells ness of cloning human marrow stem stromal cells in the presence in the presence of ceramics received by microwave sintering com-of ceramic patterns of biogenous hydroxyapatite received by tradi- pared to the ceramics obtained by traditional method with inhibited tional and microwave sintering. To estimate cloning effectiveness we osteogenous activity observed.
used the Fridenstein's method of cloning osteogenous precursor cells Key words: hydroxyapatite, microwave sintering, marrow stem modified by V.S. Astakhova. There was determined a significant en- stromal cells, cloning effectiveness
