Исследование способов получения низкомолекулярного коллагена из медузы ропилемы Rhopilema asamushi Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 669.713.7

Т.Н. Пивненко, Ю.М. Позднякова, А.Н. Ковалев

Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет,

690087, г. Владивосток, ул. Луговая,52б

ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КОЛЛАГЕНА ИЗ МЕДУЗЫ РОПИЛЕМЫ RHOPILEMA ASAMUSHI

Проведено сравнительное исследование способов получения водорастворимых препаратов коллагена медузы ропилемы Rhopilema Asamushi с использованием ультразвуковой обработки и ферментативного гидролиза. Показано, что только ферментативный гидролиз позволяет перевести в растворимую форму до 74 % от исходного состава препарата. Дана оценка молекулярно-массового распределения полученных компонентов с использованием методов гель-фильтрации и электрофореза в ПААГ. Даны рекомендации по использованию полученных препаратов.

Ключевые слова: медуза ропилема, коллаген, гель-фильтрация, электрофорез, молекулярно-массовое распределение.

T.N. Pivnenko, Yu.M. Pozdnyakova, A.N. Kovalev RESEARCH OF METHODS OF PREPARATION OF LOW-MOLECULAR COLLAGEN FROM JELLY-FISH ROPILEMA RHOPILEMA ASAMUSHI

A comparative study of methods ofpreparation of water soluble compounds of collagen from jelly-fish ropilema Rhopilema Asamushi is undertaken with the use of ultrasonic treatment and enzymatic hydrolysis. It is shown, what only a enzymatic hydrolysis allows to transformate in a soluble form to 74 % from initial composition of preparation. The estimation of molecular-mass distribution of the got components is given with the use of methods of gel-filtration and electrophoresis in PAAG. Recommendations are given on the use of the got preparations.

Key words: jelly-fish ropilema, collagen, gel-filtration, electrophoresis, molecular-mass distribution.

Введение

В настоящее время интенсивное развитие получило направление, связанное с исследованием, производством и применением природных биополимеров в медицине, биотехнологии, биоинженерии, сельском хозяйстве, пищевой и косметической промышленности. Одно из важнейших свойств таких биоматериалов - биоадекватность - сродство по структуре тканям и органам, способность легко метаболизироваться и утилизироваться организмом [1].

Наиболее значимым из подобных биоадекватных полимеров считается коллаген, наиболее распространенный и доступный белок животных тканей. Коллаген и его производные имеют широкий спектр применения в качестве косметических и биомедицинских материалов благодаря своей способности ускорять заживление ран, усиливать адгезию тромбоцитов и вызывать гемостаз при отсутствии антигенности. В фармацевтической промышленности коллаген может быть использован для производства инновационных перевязочных средств, имплантатов стекловидного тела и носителей для доставки лекарств. Физико-химические свойства коллагена и его производных, зависящие от источника сырья, содержания белка, влаги, рН среды, наличия сшивающих агентов, электролитов, температуры обеспечивают многофункциональные свойства получаемых препаратов [2].

Традиционный источник коллагена - кожа сельскохозяйственных животных. Из-за вспышек коровьего бешенства и ящура использование тканей наземных животных для получения коллагеновых продуктов в ряде стран законодательно ограничено. В настоящее время предложено большое количество разработок по получению коллагена из кожи рыб [3-4]. У коллагена рыб имеются свои преимущества (меньшая температура денатурации) и недостатки (возможность аллергических реакций). Технология коллагена из кожи животных и рыб

включает ряд стадий с использованием кислот и щелочей для удаления жиров, пигментов. Альтернативными источниками коллагена могут служить такие морские организмы, как медузы. Медузы содержат следовые количества жиров и углеводов, а количество коллагена в составе их белков превышает 60 % [5]. Технология получения коллагена является составной частью комплексной переработки медуз, в результате может быть получен ряд продуктов с высокой добавленной стоимостью. Основное преимущество - структура коллагена, имеющая у примитивных организмов высокую степень гидрофильности и совместимости с кожей человека, отсутствие побочных реакций. У коллагена медуз эти показатели самые низкие, благодаря чему он легче проникает вглубь кожи [6].

Ранее была показана возможность получения полифункционального препарата из компонентов соединительно-тканного матрикса медуз, содержащего в основном фибриллярные нерастворимые в воде структурные белкои - коллаген и эластин, образующие комплексы с муциноподобными гликозаминогликанами [5]. Молекулярная структура муцинов медуз сходна со структурой муцина вырабатываемого слизистой оболочкой желудка человека [7]. Биологическая активность муцина медуз может быть реализована в медицине, фармакологии и косметологии [8].

Несмотря на полученные положительные результаты, остается неразрешенной проблема получения препаратов коллагена медузы с высокой степенью растворимости, обеспечивающей высокую усвояемость препаратов коллагена медузы как при наружном, так и при внутреннем его применении, а также возможность использования таких препаратов в качестве диспергирующих, эмульгирующих и гелеобразующих средств. Целью данной работы было исследование возможностей получения препаратов коллагена медуз с высокой степенью растворимости.

Объекты и методы исследований

Объектом исследований служила медуза-корнерот ропилема Асамуши (Rhopilema Asamushi), выловленная в зал. Петра Великого в 2015 г.

Коллаген получали по методу, включающему измельчение, экстракцию, сепарирование, промывку, повторное сепарирование, сушку, описанному в работе [5].

Определение водорастворимого белка проводили по методу Лоури. Растворимость определяли визуально по рекомендациям Государственной фармакопеи Российской Федерации XII издания. Для этого навеску препарата растворяли в 500-кратном количестве растворителя, непрерывно встряхивали в течение 10 мин при комнатной (23-25 ОС) температуре. Препарат считали прозрачным, если при наблюдении в проходящем свете не обнаруживали частиц вещества.

Обработку ультразвуком (УЗ) проводили с помощью ультразвукового гомогенизатора Vibra-Cell при различных условиях, при этом амплитуда 100 % соответствовала мощности излучения 130 Вт и частоте 20 кГц.

Электрофорез белков проводили в 10 % (С=3,2) полиакриламидном геле (ПААГ). В качестве буфера геля использовали 0,05 М трис-HCl (рН 8,8) с 1 мМ ЭДТА и 0,1 % SDS. Персульфат аммония вносили в концентрации 3 мМ, ТЕМЕД - до концентрации 0,017 % (1,5 мМ). Полимеризация геля в пластине 15 х 20 х 0,1 см проходила в течение 30 мин. В образцы белков добавляли 0,1 % SDS, 0,1 % ЭДТА-Na соли, 0,1 % меркаптоэтанола, 1 % глицерина и 0,025 % лидирующего красителя бромфенолового синего. Разделение вели при температуре 20 оС, напряжении 100-150 В и силе тока 5-8 А на пластину (Остерман,1981). Фиксацию и окрашивание проводили в смеси: ледяная уксусная кислота : этиловый спирт : вода в соотношении 1 : 1 : 1, содержащей 0,5 % метиленового синего в течение 10 ч. Денсито-граммы с пластинок снимали при помощи программы Image J. Молекулярную массу белков определяли по калибровочным графикам, построенным в координатах зависимости Rf от молекулярной массы по значениям, соответствующим наборам стандартных маркерных белков: 8, 12, 20, 30, 45, 60, 100, 220 кДа.

Хроматографию проводили с использованием Сефадекса G-75 при скорости элюции 0,4 мл/мин. Для пробоподготовки навеску в 25 мг/мл растворяли в воде и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин.

Для получения гидролизата коллагена использовали коллагеназу из гепатопанкреаса камчатского краба с активностью 300 ПЕ/г. Параметры процесса: температура 48 оС, рН 8,0, концентрация фермента 0,5 % от массы сырья, время 3 ч.

Результаты и обсуждение

Для обработки высокомолекулярных веществ с целью их деполимеризации в настоящее время широкое распространение получил метод с использованием ультразвука (УЗ), позволяющий, не изменяя химическую природу полимеров, снижать их молекулярную массу путем расщепления отдельных химических связей. Известно, что длительное воздействие на растворы макромолекул высокой энергией УЗ волн приводит к последовательному снижению вязкости таких растворов. УЗ-обработка, способная создавать градиент скорости, достигающий 10-5 см, может быть использована для деполимеризации полимеров, таких как полистирол, поливинил, коллаген, ДНК и бактериальные полисахариды [9].

Также метод ферментативного гидролиза белковых составляющих считается в настоящее время одним из самых эффективных, а благодаря наличию большого количества коммерческих ферментных препаратов позволяет несущественно увеличивать затраты на производство целевых продуктов. Важным условием для эффективного ферментативного гидролиза коллагеновых белков является субстратная специфичность используемых ферментов. Это связано с жесткой структурной организацией коллагена. Наиболее распространенные ферментные препараты протеолитического действия не способны расщеплять его молекулы [10]. Поэтому для обеспечения деструкции коллагена медуз был взят ферментный препарат из ге-патопанкреаса камчатского краба, сериновые протеиназы которого имеют необычную субстратную специфичность и способны к взаимодействию с коллагеном [10].

На первом этапе исследования проводили подбор параметров обработки коллагена медузы ультразвуком. Влияние параметров УЗ-обработки на накопление растворимых компонентов представлено на рис. 1.

Рис. 1. Накопление водорастворимых белков при различных параметрах УЗ-обработки. Условия: 2 : 50 - 75 - соотношение коллаген : вода, мощность - 75 %; 2 : 80 --75 - соотношение

коллаген : вода, мощность - 75 %; 2:50 --100 -соотношение коллаген : вода, мощность - 100 %; 2:80 --100 - соотношение коллаген : вода, мощность - 100 % Fig. 1. Accumulation of water soluble proteins at the

différent parameters of US treatment of. Condition: 2: 50 - 75 ratio collagen : water, power -75 %; 2: 80 -75 ratio collagen : water, power - 75 %; 2: 50 -100 ratio collagen : water, power - 100 %; 2: 80 -100 ratio collagen : water, power - 100 %

В контрольном образце без УЗ-обработки содержание белка при гидромодуле 2 : 50 составило 1,68 мг/мл, при гидромодуле 2 : 80 - 1,45 мг/мл, что составило 4,2 % от массы препарата, или 7,0 % от количества коллагена в первом случае, 5,8 % и 9,6 % - во втором. В течение 10 мин при гидромодуле 2 : 50 при УЗ-обработке при 75 % мощности количество растворимого белка увеличилось в 1,23 раза, через 15 мин - в 1,5 раза. Для образца с гидромодулем 2 : 80 эти показатели составили 1,3 и 1,5 раза соответственно. Увеличение мощности УЗ до 100 % привело к росту растворимых соединений за 10 мин в 1,3 раза и за 15 мин - в 1,5 раза (гидромодуль 2 : 50). При гидромодуле 2 : 80 эти величины составили 1,3 и

1,4 раза соответственно. Дальнейшее увеличение времени УЗ-обработки приводило к значительному увеличению температуры, что вызывало денатурацию белков. Полученные результаты показывают невысокий рост содержания растворимых соединений при обработке коллагена медузы. При этом гидромодуль и мощности УЗ-обработки не вызывают значительных различий в качестве образцов. Наибольшее содержание водорастворимых белков обнаружено при гидромодуле 2 : 50, мощности 75 %, времени 15 мин. Следовательно, данный метод может быть рекомендован только в качестве предварительной обработки.

Далее исследовали молекулярно-массовое распределение белков в образцах, обработанных УЗ различной мощности в течение различных промежутков времени от 1 до 10 мин.

Хроматография экстракта медузы (УЗ-ЮО Гц)

* * i \ 1 (« »

j f\i и 1 1 I'1 -1 -

! 1 lii-1 Ч ; I 1 1 V

1 П1 ii i I : L" > : l

J ! 1/Ш U /

t 5 А ////IMW /;Л lUil \\ it :

■i I 141: 1 i ; : v j A 1 ' //// \\W

ч * 1/ V \1 /> /:' VW U

а

Хроматография медузы (УЗ-50)

If li

Л 1 1»( X\

й ¥■ //< % A

m ,w \m 11

v^ " L л. —

б

Рис. 2. Хроматограммы молекулярно-массового распределения белковых фракций медузы, обработанной УЗ: а - частота 100 Гц; б - частота 50 Гц. Сорбент Сефадекс G-75, скорости

элюции 0,4 мл/мин

Fig. 2. Chromatograms of molecular-mass distribution of protein factions ofjelly-fish after US treat: а - frequency 100 Hertzs; б - frequency 50 Hertzs. Sorbent of Sefadex G-75, rate of elution 0,4 ml/min

В контрольных образцах наблюдали присутствие одного пика, условно соответствующего средней молекулярной массе среди всех полученных фракций. При частоте УЗ излучения в 50 Гц происходит постепенное снижение количества белков данной фракции и накопление

77

нехарактерных для контрольного образца компонентов как с меньшей молекулярной массой, так появление пиков в зоне, соответствующей более высокой массе. Таким образом, при УЗ-обработке происходит не только распад белковых соединений, но и образование более крупных белковых агрегатов. При частоте УЗ-излучения в 100 Гц общий характер процесса сохраняет ту же тенденцию. Однако образование более крупных белковых агрегатов, нехарактерных для исходного препарата, происходит с большей интенсивностью.

При получении водорастворимой формы коллагена медузы методом ферментативного гидролиза использовали условия, ранее примененные для обработки коллагенсодержащего сырья и хрящевой ткани гидробионтов [11]. В качестве ферментного препарата использовали коллагеназу камчатского краба с активностью 300 ПЕ/г, условия ферментолиза: температура 48 оС, рН 8,0, концентрация фермента 0,5 % от массы сырья, время 3 ч.

Результаты анализа содержания растворимого белка в образцах коллагена медузы, полученных различными способами, представлены в табл. 1. Для сравнения использовали водный раствор; экстракт в 0,5 М уксусной кислоте (прием, традиционно используемый для фракционирования кислоторастворимой фракции коллагена из животного сырья); водный раствор после обработки УЗ; ферментолизат.

Таблица 1

Содержание водорастворимого белка в образцах коллагена медузы, % общей массы

Table 1

Contents of water soluble proteins is in the samples of collagen of jelly-fish, % total mass

Образец Содержание белка, %

Без обработки 2,8

Экстракт в 0,5 М уксусной кислоте 5,4

Обработка УЗ (20 мин; мощность 75 % ) 2,98

Ферментолизат (3 ч, 48 оС, 0,5 % фермента) 74,2

Обработка УЗ так же, как и кислотная экстракция позволяет лишь незначительно повысить выход растворимого белка. При УЗ-обработке происходят структурные перестройки и изменение молекулярно-массового распределения, как это показано выше. Обработка ферментным препаратом со специфичностью к коллагену позволяет перевести практически % его количества в растворимое состояние. При этом содержание высокомолекулярного коллагена в ферментолизате составило 16,6 %, а в образцах до и после обработки УЗ - 20,3 %.

При исследовании суммарного содержания растворимых компонентов ферментолизата коллагена при различных условиях были получены следующие результаты (рис. 3). Наибольшая растворимость наблюдается в водном растворе. Для достижения полного растворения навески препарата в 500-кратном количестве воды требуется 5 мин. Повышение концентрации хлорида натрия приводит к увеличению времени полного растворения до 10 мин. Таким образом, повышение ионной силы раствора приводит к снижению его растворимости. Зависимость растворимости ферментолизата коллагена от рН имеет нелинейную зависимость. При этом в слабокислой зоне (рН 6,0) отмечена наилучшая растворимость препарата. Дальнейшее снижение рН приводит к достаточно резкому снижению растворимости при рН 4,0, хотя далее она вновь растет. Для коллагена медузы без обработки, как и обработанного ультразвуком, полного растворения не наблюдалось ни при каких вышеназванных условиях.

Коллаген, применяемый в качестве сырья для производства наружных средств, должен обладать хорошей растворимостью при нейтральных значениях рН, чтобы не вызывать раз-

дражения на коже, иметь высокие показатели адсорбции для хорошего связывания с другими компонентами средства, а также высокую эмульгирующую активность для стабилизации кремов и мазей. Определение данного показателя важно для установления области применения коллагенового препарата.

а б

Рис. 3. Зависимость времени растворения ферментолизата коллагена медузы от концентрации

хлорида натрия (а) и от рН (б) Fig. 3. Dependence of time of dissolution of the enzymes hydrolyzates of collagen from jelly-fish on the

concentration of natrium chloride (а) and рН (б)

Методом гель-электрофореза в ПААГ было проведено разделение и определена молекулярная масса белков в трех препаратах: коллаген медузы без обработки, обработанный ультразвуком и ферментативный гидролизат.

Электрофореграмма разделения белков коллагена медузы позволяет оценить общую картину распределения белковых фракций в зависимости от их молекулярной массы и заряда молекул. Для расчета молекулярной массы проводили разделение белков-маркеров с известной молекулярной массой в этих же условиях.

Денситометрическое сканирование полученных электрофореграмм позволяет наиболее точно рассчитать молекулярную массу отдельных фракций (рис. 4).

Максимальное количество фракций (7) молекулярной массой от 15 до 70 кДа обнаружено в ферментолизате коллагена медузы (табл. 2). В коллагене, обработанном ультразвуком, присутствуют 3 низкомолекулярных компонента от 19 до 71 кДа и 3 компонента - свыше 100 кДа. В коллагене без обработки преобладающей является фракция с молекулярной массой 220 кДа.

Сравнение результатов молекулярно-массового распределения, полученных при гель-фильтрации и электрофорезе, в целом не противоречат друг другу. Хотя при хроматографии были получены высокомолекулярные фракции, отсутствующие в исходном сырье, следует учитывать, что электрофорез проводился в присутствии додецилсульфата натрия (0,1 % SDS), т.е. в условиях денатурации белков и распада белковых субъединиц, не связанных ко-валентной связью.

Коллаген медузы, обработанный ультразвуком

Ферментолизат коллагена медузы

Рис. 4. Денситограммы электрофоретического разделения белков различных препаратов

коллагена медузы

Fig. 4. Densitograms of electrophoretic division of proteins of different preparations

from jelly-fish collagen/

Таблица 2

Молекулярно-массовое распределение белковых фракций препаратов

коллагена медузы

Table 2

Molecular-mass distribution of proteins factions in preparations of collagen from jelly-fish

Препарат Молекулярные фракции, кДа

Без обработки 220

УЗ 220, 140, 108, 71, 22, 19

Ферментолизат 220, 55-70, 50, 40, 29, 24, 20, 15

Таким образом, полученные результаты позволяют оценить вклад различных способов обработки коллагена медуз для образования растворимых компонентов. Показано, что исходный коллаген слабо растворим как в водных, так в солевых растворах и содержит одну белковую фракцию с массой 220 кДа. Обработка УЗ, в различных условиях, не способна дать существенного увеличения количества растворимых компонентов, однако образующиеся при этом низкомолекулярные компоненты способны агрегировать между собой. Подобные агрегаты распадаются при добавлении денатурирующих агентов. Наибольший выход низкомолекулярных растворимых белков образуется при ферментативном гидролизе (74,2 % водорастворимого белка). Но при этом частично сохраняется фракция, соответствующая молекулярной массе исходного компонента.

Полученные результаты также позволяют дать рекомендации по применению препаратов коллагена медузы, полученных различными способами. Хорошо растворимые образцы коллагена имеют преимущества при использовании в составе кремов и мазей, а слаборастворимые - при производстве волокон, пленок, губок, порошков, обладающих свойствами водо-и газопроницаемости, имеющих высокую сорбционную способность по отношению к биологически активным веществам, и обеспечивают их пролонгированное высвобождение. Эти свойства имеют большое значение при лечении инфицированных ран и ожогов, в косметологии благодаря высокой степени совместимости с фибробластами человека и отсутствию аллергических реакций.

Список литературы

1. Технология полимеров медико-биологического назначения. Полимеры природного происхождения / под ред. М.И. Штильмана. М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. 328 с.

2. Истранов Л.П., Абоянц Р.К., Истранова Л.П., Сыченников И. А. Коллагеновое вспомогательное вещество в технологии лекарств [Электронный ресурс]. Режим доступа: http:// collagen.su/archives/2628.

3. Антипова Л.В., Сторублевцев С.А. Коллагены: источники, свойства, применение. Воронеж : ВГУИТ, 2014. 512 с.

4. Bechir A., Sirbu R., Leca M., Maris M., Maris D.A., Cadar E.M.The Nanobiotechnology of Obtaining of Collagen Gels from Marin Fish Skin and Yours Reological Properties for using Like New Materials in Dental Medicine International Journal of Medical, Health, Biomedical, Bioengineering and Pharmaceutical Engineering. 2008. Vol. 2, No. 6. P. 190-196.

5. Пивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Есипенко Р.В. Полифункциональный препарат из тканей медузы ропилемы, содержащий мукополисахариды и коллаген // Пищ. и морская биотехнология: материалы 5 Междунар. конф., г. Калиниград 24 мая 2016 г. Калининград, 2016. С. 77-79.

6. Silvipriya K.S., Krishna Kumar K., Bhat A.R., Dinesh Kumar B., Anish John, Panayappan

Lakshmanan. Collagen: animal sources and biomedical application // Journal of Applied Pharmaceutical Science. 2015. Vol. 5 (03). Р. 123-127.

7. Masuda A., Baba T., Yamamura M. Mucin (qniumucin), a glycoprotein from jellyfish, and determination of its main chain structure // J. Nat. Prod. 2007. Vol. 70. P. 1089-1092.

8. Nagai T., Worawattanamateekul W., Suzuki N. Isolation and characterization of collagen from rhizostomous jellyfish (Rhopilema asamushi) // Food Chem. 2000. Vol. 70. Р. 205-208.

9. Machova E., Kogan G., Soltes L., Kvapilova K., Sandulaa J. Ultrasonic depolymerization of the chitin-glucan isolated from Aspergillus niger // Reactive & Functional Polymers. 1999. Vol. 42. P.265-271.

10. Пивненко Т.Н., Ковалев Н.Н. Сериновые протеиназы морских организмов: свойства, получение, применение: монография. Владивосток : Дальрыбвтуз, 2015. 498 с.

11. Пивненко Т.Н., Суховерхова Г.Ю., Запорожец Т.С., Гажа А.К., Иванушко Л. А. Функциональные компоненты ферментированной хрящевой ткани рыб и их влияние на экспрессию маркеров активации лимфоцитов // Биотехнология. 2017. Т. 33. С. 66-80.

Сведения об авторах: Пивненко Татьяна Николаевна, доктор биологических наук, профессор, e-mail: tnpivnenko@yandex.ru;

Позднякова Юлия Михайловна, кандидат технических наук, e-mail: pozdnyakova.julia@yandex.ru;

Ковалев Алексей Николаевич, e-mail: kovalevnn61@yandex.ru.