CC BY
50
ВЕСТНИК ПНИПУ
2018 Химическая технология и биотехнология № 2
БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННАЯ ЭКОЛОГИЯ
Б01: 10.15593/2224-9400/2018.2.01 УДК 577.152. +542.952 +579.22
Г.А. Коваленко
Новосибирский государственный университет, Институт катализа Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
Л.В. Перминова
Институт катализа Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
А.Б. Беклемишев, М.Б. Пыхтина
НИИ биохимии Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ РЕКОМБИНАТНОЙ
липазы из therm0myces ¡-амив/мозиэ,
ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА СИЛИКАГЕЛЕ, В РЕАКЦИИ ЭТЕРИФИКАЦИИ
В настоящее время иммобилизованные липазы находят широкое применение в органическом синтезе, благодаря своей уникальной способности осуществлять низкотемпературный синтез сложных эфиров в неводных средах органических растворителей. Эфиры жирных кислот, как известно, это ценные продукты пищевой и косметической промышленностей, поскольку они являются душистыми веществами, смягчающими компонентами, нетоксичными сурфактантами.
В данной работе рекомбинантная липаза из Thermomyces lanuginosus, клонированная в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris (гР^Ыа/Нр), была иммобилизована на мезопористом силикагеле путем пропитки по влагоемкости сухих гранул носителя растворами фермента. Приготовленные таким образом твердые биокатализаторы были исследованы в реакции этерификации насыщенных жирных кислот алифатическими спиртами, различающимися строением молекул, а именно: количеством атомов углерода, изомерией углеродного скелета, наличием ароматических или циклических остатков. В результате сравнения скоростей реакции этерификации различных пар субстратов (кислоты и спирта) была изучена субстратная специфичность иммобилизованной рекомбинантной липазы rPichia/lip.
Показано, что иммобилизованная на силикагеле рекомбинантная липаза обладает сравнительно широкой субстратной специфичностью и с высокой скоростью
этерифицирует жирные насыщенные кислоты с участием первичных алифатических спиртов с количеством атомов углерода в молекуле больше 4 (до 16-18). Субстраты, содержащие ароматические и циклические остатки, а также третичные спирты в реакции этерификации не участвуют. Приготовленные биокатализаторы обладают высокой стабильностью и сохраняют ферментативную активность в течение более 300 ч, проводя периодический процесс низкотемпературного синтеза сложных эфиров в среде органических растворителей (гексана и диэтилового эфира).
Ключевые слова: рекомбинантная липаза из Thermomyces lanuginosus, иммобилизация, этерификация, субстратная специфичность, эфиры жирных кислот.
G.A. Kovalenko
Novosibirsk State University,
Institute of Catalysis of Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
L.V. Perminova
Institute of Catalysis of Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
A.B. Beklemishev, M.B. Pykhtina
Institute of Biochemistry of Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
STUDY ON THE SPECIFICITY OF RECOMBINANT THERMOMYCES LANUGINOSUS LIPASE IMMOBILIZED ON SILICA IN THE REACTION OF ESTERIFICATION
Nowadays, immobilized lipases are widely used in organic synthesis due to its unique ability to perform low-temperature synthesis of various esters in non-aqueous media of organic solvents. Esters of fatty acid are known to be valuable products of the food and cosmetic industries, because they are fragrant substances, and emollients, and non-toxic surfactants.
In this study, the recombinant Thermomyces lanuginosus lipase cloned in methylotrophic yeast Pichia pastoris (denoted rPichia/lip) is immobilized in mesoporous silica by moisture capacity impregnation of dry support's granules with the enzyme solutions. The prepared biocatalysts are examined in the esterification of saturated fatty acids with primary aliphatic alcohols differing in the structure of the molecules, namely, the number of carbon atoms, and the isomerism of the carbon skeleton, and the presence of aromatic or cyclic residues. When the esterification reaction rates for various pairs of substrates (acid and alcohol) are compared, the specificity of immobilized lipase rPichia/lip is determined.
It was shown that the recombinant lipase immobilized on silica has relatively broad substrate specificity, and at high rate it esterifies saturated fatty acids with primary aliphatic alcohols with more than 4 carbon atoms in the molecules (up to 16-18). Substrates containing aromatic and cyclic residues, as well as ternary alcohols do not
participate in the esterification reaction. The prepared biocatalysts are highly stable and remain active for more than 300 h in a batch process of low-temperature synthesis of various fatty acid esters in medium of organic solvents (hexane and diethyl ether).
Keywords: Thermomyces lanuginosus recombinant lipase, immobilization, esterification, substrate specificity, ester of fatty acids.
Липазы как активные компоненты биокатализаторов привлекают пристальное внимание специалистов в области органического синтеза своими уникальными свойствами. Какие же свойства липаз делают их идеальными инструментами для проведения химических реакций? Во-первых, это хемо-, регио- и стереоселективность биокатализа липазами. Во-вторых, липазы легко получить в сравнительно больших количествах, потому что многие микроорганизмы, в том числе бактерии и микроскопические грибы, синтезируют липазы как внутриклеточно, так и внеклеточно с высоким выходом. В-третьих, получены кристаллические формы многих липаз, расшифрованы их аминокислотные последовательности, промоделированы структуры их молекул, что значительно облегчило разработку рациональных инженерных стратегий, включая получение рекомбинантных штаммов-продуцентов генно-инженерными методами. В-четвертых, липазы для проведения реакций не требуют дорогостоящих ко-факторов. И наконец, липазы способны сохранять ферментативную активность в нетрадиционных для ферментов средах органических растворителей, практически не содержащих воды, тогда как для работы большинства ферментов необходима водная буферная среда. Каждый год появляется около 1000 оригинальных научных публикаций, а также обзорные статьи по практическому применению липаз [1-7].
Возможность менять и регулировать свойства ферментов, включая их стабильность, активность и селективность, является одним из самых привлекательных направлений в биокатализе. Развитие и применение методов молекулярной биологии и генетической инженерии позволило разработать современные подходы к получению мутантных форм различных ферментов, в том числе липаз. Например, только одна точечная мутация в молекуле липазы из Geobacillus zalihae приводит к заметному изменению характеристик фермента, например, увеличивает конформа-ционную стабильность молекулы, повышает активность фермента [8]. Иммобилизация и условия реакционной среды также позволяют модулировать свойства фермента. Например, добавление некоторых соединений (третичных аминов, краун-эфиров) в реакционную среду приво-
дит к «немедленной настройке реакции», катализируемой липазой, при этом увеличивается скорость реакции и изменяется энантиоселектив-ность [9]. В работе [10] описано изменение региоселективности иммобилизованной липазы из T. lanuginosus в зависимости от химической природы гидрофобных носителей, используемых для адсорбции фермента. Для реакции ферментативного этанолиза растительного масла было показано, что липаза, адсорбированная на носителе с дивинилбен-зольными группами, проявляет 1,3-региоспецифичность по отношению к положению ацильной группы в молекуле триглицеридов, тогда как липаза, адсорбированная на носителе с октадециловыми группами (С 18), такой региоспецифичности не проявляет [10].
Исследования субстратной специфичности различных липаз в реакции этерификации представляют особый интерес для разработки процессов низкотемпературного синтеза сложных эфиров, в том числе эфи-ров жирных кислот, которые являются ценными продуктами органического синтеза, широко применяемыми в товарах бытовой химии, а также в косметической и пищевой промышленностях в качестве душистых веществ, отдушек, эммолиентов (смягчающих и влагоудерживающих компонентов), неионных сурфактантов. В работе [11] было обнаружено, что липаза из Penicillium simplicissimum с высокой скоростью этерифи-цировала длинные жирные кислоты длинными вторичными спиртами, тогда как скорость реакции с участием первичных и третичных спиртов были низкими. Как было показано в работе [12], иммобилизованные микробиальные липазы из Staphylococcus warneri и S. xylosus со сравнительно высокими скоростями этерифицировали гексановую (С6:0) и олеиновую (С18:1) кислоты с участием спиртов - этанола и гексанола, тогда как реакция с уксусной (C2:0), масляной (С4:0), валериановой (С5:0), а также с 2(3)-метилбутановой кислотами не протекала. В работе [13] авторы показали, что рекомбинантная липаза rPichia/lip, иммобилизованная на мезопористом силикагеле, обладает сравнительно широкой специфичностью. Высокие скорости реакции наблюдались в синтезе сложных эфиров насыщенных жирных кислот с количеством атомов углерода С6-С18 и первичных алифатических спиртов С2-С16; скорость реакции этерификации с участием вторичных спиртов была на 2 порядка ниже, третичные спирты в реакции не участвовали [13].
В работе [14] авторы исследовали субстратную специфичность микробиальных липаз в обратной реакции - гидролиз восьми сложных эфиров различных (в том числе ароматических) органических кислот
с различными (в том числе циклическими) спиртами, в зависимости от строения активного центра (а.ц.) липаз. Исследованные липазы были разделены на 4 группы (табл. 1). В работе [14] было обнаружено, что липазы СаЬЛ и СаЬБ обладали более широкой специфичностью, чем липазы ЯшЬ, которые с очень низкой скоростью гидролизовали эфиры ароматических и циклических кислот и спиртов, а также эфиры с разветвленным спиртовым остатком.
Таблица 1
Классификация липаз по типу строения активного центра [14]
Группа Название класса Микроорганизм-продуцент Свойства активного центра липазы
1 RmL R. miehei, T. lanuginosus, Fusarium oxysporum А.ц. расположен близко к поверхности ферментной глобулы. Строение а.ц.: узкая щель - для ацильной группы Б1, широкая щель - для связывания 82
2 CaLA Candida antarctica A, Candida rugosa А.ц. в глубине ферментной глобулы. Строение а.ц.: узкий тоннель для Б1, широкий участок - для 82
3 CaLB Candida antarctica B, Ustilago maydis А.ц. в глубине ферментной глобулы. Строение а.ц.: широкая щель для Б1, узкая щель - для 82
4 Cutinase Fusarium solani, Humicola insolens Строение а.ц.: широкие щели для Б1 и 82
Примечание: S1 - субстрат кислота, S2 - субстрат спирт.
В данной работе проведены дальнейшие исследования субстратной специфичности иммобилизованной на силикагеле рекомбинантной липазы гР/сЛ/а/Нр (липаза ЯшЬ типа) в реакции низкотемпературной этерификации насыщенных жирных кислот, протекающей в неводных средах органических растворителей (гексане и диэтиловом эфире) при комнатной температуре.
Экспериментальная часть. В работе использовали рекомбинант-ную липазу из Т. lanuginosus (обозн. гР/сЛ/а/Нр), продуцируемую специально сконструированным штаммом-продуцентом метилотрофных дрожжей Р/сЫа pastoris шт. Х-33. Получение данного штамма состояло из ряда генно-инженерных манипуляций, описанных в работе [15]. Липаза гР/сЛ/а/Нр была получена в препаративных количествах в результате культивирования рекомбинантного штамма в 10 л биореакторе газовихревого типа «БИОК-10» (ЗАО «Саяны», Россия). После 3 суток культивирования в биореакторе в течение последующих 4 суток в среду
вносили метанол каждые сутки до конечной концентрации 1 % для индукции экспрессии гена липазы из T. lanuginosus в клетках рекомби-нантного штамма дрожжей. После завершения культивирования дрожжевые клетки отделяли центрифугированием, осадок отбрасывали. Из надосадочной жидкости липазу rPichia/lip осаждали сульфатом аммония (до 75 % насыщения) при 4 оС в течение 16 ч. Отделенный центрифугированием осадок, содержащий целевой фермент - липазу rPichia/lip, растворяли в дистиллированной воде и проводили диализ против 25 мМ ацетатного буфера рН 4.0. Концентрацию белка в растворе измеряли при помощи красителя Кумасси G-250, для построения градуировочного графика использовали бычий сывороточный альбумин (Sigma).
Для иммобилизации липазы rPichia/lip и приготовления твердых (гетерогенных) биокатализаторов использовали коммерческий силика-гель марки КСК-Г (АО «Химический завод им. Л.Я. Карпова», Россия) в виде гранул размером 1-2 мм. Удельная поверхность носителя составила 150 м2/г; объем пор 0,75 см3/г; средний размер пор составил 20 нм; микропоры (менее 2 нм) занимали не более 0,5 % от общего объема пористого пространства. Пористую структуру данного носителя исследовали методом азотной порометрии на приборе AUTO-PORE 9200 и ASAP 2400 V3.07 (Micromeritics Instrument Co., США).
Биокатализаторы готовили путем пропитки сухих носителей по влагоемкости растворами липазы rPichia/lip следующим образом. Си-ликагель (1 г) пропитывали растворами липазы rPichia/lip (0,8 мл) с концентрацией белка 6-17 мг/мл и выдерживали в плотно закрытом бюксе в течение 5 ч при 20-22 оС. Затем биокатализаторы сушили до суховоздушного состояния в условиях окружающей среды в течение 2-3 сут; их влажность не превышала 10 %. Содержание липазы в биокатализаторе рассчитывали, исходя из концентрации белка и объема пропиточного раствора.
Реакцию этерификации проводили в следующих условиях. Биокатализаторы (0,5 г) заливали реакционной средой (3,0 мл), содержащей 0,25-0,35 М кислоты (субстрат S1) в бинарном органическом растворителе состава гексан : диэтиловый эфир = 1:1. Реакцию инициировали добавлением спирта (субстрат S2) в двухкратном молярном избытке по отношению к кислоте. Начальную скорость реакции определяли по линейному участку кинетической кривой убыли кислоты, концентрацию которой определяли титриметрически с помощью раствора NaOH с известной концентрацией. Активность биокатализатора
выражали в международных единицах активности (ЕА) в расчете на 1 г сухого биокатализатора (1 ЕА = 1 мкмоль/мин). Статистическая обработка результатов при п = 4-6 с доверительной вероятностью 0,95 показала, что относительная ошибка не превышала 6 %.
Реакцию этерификации проводили в реакторе смешения в периодическом режиме при 20-22 оС. Продолжительность одного реакционного цикла определялась временем, необходимым для полной конверсии кислоты (~85 %), и составляла от 2 до 24 ч в зависимости от активности биокатализатора. Далее реакционную смесь, содержащую продукт реакции, декантировали; биокатализаторы промывали растворителем и заливали свежей реакционной средой, содержащей субстраты. Продукты реакции этерификации обозначали Сх|Су, где х - количество атомов углерода в кислоте, у - количество атомов углерода в спирте. В качестве контрольной (тестовой) реакции использовали реакцию синтеза эфира энантовой кислоты с бутанолом (обозн. С7|С4).
Результаты и их обсуждение. Были проведены систематические исследования биокаталитических свойств приготовленных биокатализаторов, а именно: этерифицирующей активности, стабильности и субстратной специфичности. Было показано, что при увеличении содержания липазы в биокатализаторе ферментативная активность увеличивалась пропорционально. Сравнение данных рис. 1, 2 показало, что иммобилизованная липаза гР/сЛ/а/Нр проявляет более выраженную специфичность по отношению к субстрату Б1, чем к субстрату Так, скорости этерификации низкомолекулярных кислот, таких как уксусная (С2), масляная (С4), валериановая (С5) и капроновая (С6), были низкими по сравнению с жирными кислотами с числом атомов углерода выше 7 и практически не зависели от строения молекулы спирта. Так, скорость этерификации уксусной кислоты была минимальной, энанто-вой кислоты - максимальной (см. рис. 1). Как отмечалось выше, выраженной специфичности по отношению к спирту не наблюдалось; и при варьировании субстрата (спирта) кислота этерифицировалась со сравнительно высокой скоростью (см. рис. 2). Эти результаты косвенно подтвердили строение активного центра липазы ЯшЬ-типа (см. табл. 1), к которому относится использованная в данной работе рекомбинантная липаза из T.lanuginosus, клонированная в метилотрофных дрожжах Р. pastoris. Так, широкая щель а.ц. для субстрата обеспечивает широкую специфичность по отношению к спирту, тогда как более тонко организованная щель активного центра для связывания ацильной группы субстрата обеспечивает более узкую специфичность.
Сх|С12
||| II
д||
Сх|С2
■ II
Сх|С12
Р 255 20 е
о 15-
5 10 11 12 13 14 15 16 17 1Е Количество атомов углерода в молекуле кислоты
а
|2-
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Количество атомов углерода в молекуле кислоты
Л1
Сх|С8
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Количество атомов углерода в молекуле кислоты
(II
Сх|С16
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Количество атомов углерода в молекуле кислоты
Рис. 1. Субстратная специфичность липазы хР1сЫа/\\р, иммобилизованной на мезопористом силикагеле, в реакции этерификации жирных кислот, различающихся числом атомов углерода в молекуле, первичными и-спиртами: а - этанолом; б - октанолом; в - доде-канолом; г - гексадеканолом (цетиловым спиртом). Содержание липазы в биокатализаторе составило 6,2 мг/г (а, в, г) и 14,0 мг/г (б)
С7|Су
¿4-й 22 Й 7П
8 9 10 11 12 13 14 15 16 )в углерода в молекуле спирта
С10|Су
9 10 11 12 13 14 15 1(
ш углерода в молекуле спирта
а б
Рис. 2. Субстратная специфичность липазы хР1сЫа/Х\р, иммобилизованной на мезопористом силикагеле, в реакции этерификации энантовой (а) и каприновой (б) кислот первичными алифатическими и-спиртами, различающимися числом атомов углерода в молекуле. Содержание липазы в биокатализаторе составило 6,2 мг/г (а) и 14,0 мг/г (б)
в
Было показано, что этерификация кислот и спиртов, содержащих ароматические и циклические остатки, протекает очень медленно. Например, скорость реакции этерификации бензойной кислоты с п-6у-танолом равна нулю; и на ТСХ-пластинках следы образовавшегося эфира не обнаруживаются. Скорость образования эфира энантовой (гептановой, С7:0) кислоты с метилциклогексанолом была в 240 раз меньше, чем скорость синтеза эфира С7|С4 этой кислоты и ^бутанола (0,07 и 16,9 ЕА/г соответственно). Образование сложного эфира, содержащего циклический остаток, было подтверждено методом ТСХ. На хроматограммах, представленных на рис. 3, пятна от образовавшихся эфиров видны отчетливо. Было также обнаружено, что максимальная конверсия энантовой кислоты в реакции с метилциклогекса-нолом не превышает 50 %, тогда как с ^бутанолом достигает 90 %, что может указывать на ингибирование продуктом реакции. После проведения реакции этерификации с субстратами, содержащими ароматические и циклические остатки, биокатализаторы были многократно отмыты растворителем и протестированы в контрольной реакции синтеза эфира С7 |С4. Активность биокатализаторов восстановилась до ~80 % от первоначальной активности. Таким образом, кислоты и спирты с ароматическими и циклическими остатками не являются субстратами иммобилизованной липазы гР/сЛ/а/Ир, а также не проявляют необратимого ингибирую-щего действия.
Исследование стабильности показало, что этерифицирующая активность приготовленных биокатализаторов практически не изменяется в течение 7-10 реакционных циклов (табл. 2-6). После проведения последовательных реакционных циклов определяли активность работающего биокатализатора в контрольной тест-реакции синтеза эфира С7|С4 и сравнивали с начальной активностью этого же, свежеприготовленного биокатализатора (17,9 ЕА/г). Было обнаружено, что после работы биока-
Рис. 3. Результаты ТСХ анализа реакционной смеси после проведения реакции этерификации с (1) энанто-вой (гептановой, С7:0) кислотой и n-бутанолом, (2) энантовой кислотой и метилциклогексанолом
тализатора с низкомолекулярными субстратами С4-С6 его активность в тест-реакции незначительно уменьшилась (на 13 %) и составила в среднем 15,3 ЕА/г. После работы биокатализатора с высокомолекулярными субстратами (кислотами С7-С18 и С12-С16) биокаталитическая активность незначительно увеличивалась (на 9%) и составила в среднем 19,0 ЕА/г. Затем, во втором цикле синтеза эфира С7|С4 активность биокатализатора практически полностью возвращалась к первоначальному значению активности свежеприготовленного биокатализатора. Наличие такой своеобразной «кратковременной памяти» может быть обусловлено тем, что реагенты и продукт реакции (эфир) удерживаются в матрице силикагеля вблизи иммобилизованной липазы, и замена реакционной среды, содержащей другую пару субстратов и Бг, происходит в течение одного реакционного цикла (24 ч). Как отмечалось выше (в экспериментальной части), после каждого реакционного цикла, завершающегося полной конверсией кислоты (85-90 %), биокатализаторы отмывались растворителем в течение 1-3 сут. Полноту отмывки от продукта и субстратов реакции контролировали с помощью ТСХ. Было обнаружено, что после многократной (3-4 раза) отмывки на ТСХ-пластинках наблюдались чрезвычайно слабые следы эфира, т. е. биокатализаторы были отмыты практически полностью. Если стадию полной отмывки биокатализатора от эфира не проводить, то в следующем реакционном цикле скорость реакции существенно снижается, по-видимому, за счет замедленного распада комплекса фермента с продуктом. Таким образом, отмывка биокатализатора перед каждым реакционным циклом от реагентов, а именно: от спирта, взятого в 2-кратном избытке, и продукта реакции - эфира, является необходимым условием эффективной работы биокатализатора в следующем реакционном цикле.
Систематические исследования стабильности приготовленных биокатализаторов показали, что только в реакции этерификации различных жирных кислот с участием деканола (С 10) биокатализаторы инактивировались в течение 9-10 реакционных циклов (рис. 4), и данные результаты воспроизводились при многократном повторении. После смены деканола на другой спирт активность биокатализаторов восстанавливалась, т. е. деканол не являлся необратимым ингибитором иммобилизованной липазы гР/сЛ/а/Нр. Инактивирующее действие деканола можно объяснить тонким строением Бг-связывающего участка а.ц., наиболее прочно связывающего именно алифатический нормальный (неразветвленный) спирт С10.
Таблица 2
Активность биокатализатора (ЕА/г) в реакции синтеза этиловых эфиров жирных кислот Сх|С2 (содержание липазы в биокатализаторе 6,2 мг/г)
Номер реакционного цикла Кислота
С4:0 С5:0 С6:0 С7:0 С9:0 С10:0 С18:0
1 1,4 1,5 1,0 9,9 3,8 4,7 5,2
2 1,2 1,6 1,3 9,2 4,3 5,0 5,6
3 1,2 1,5 1,2 9,2 5,6 4,9 5,6
4 1,4 1,7 1,4 8,2 5,3 5,0 6,8
5 1,6 1,7 1,6 8,3 3,6 6,0 7,1
6 1,6 1,7 1,5 9,8 4,3 5,7 6,4
7 1,4 1,7 1,5 9,2 4,8 5,4 5,4
8 1,6 1,7 1,4 9,9 4,9 4,8 5,5
Таблица 3
Активность биокатализатора (ЕА/г) в реакции синтеза эфиров жирных кислот с ^ундеканолом Сх|С 11 (содержание липазы в биокатализаторе 6,2 мг/г)
Номер реакционного цикла Кислота
С4:0 С5:0 С6:0 С7:0 С9:0 С10:0 С18:0
1 1,5 1,7 1,8 8,7 4,7 5,6 6,1
2 9,3 4,0 5,6 8,8
3 1,5 1,8 1,6 9,8 4,3 5,4 7,2
4 1,0 1,4 1,1 14,3 5,0 5,7 6,8
5 1,3 1,6 1,5 9,7 4,5 5,6 5,7
6 1,5 1,8 1,7 12,1 5,2 5,8 7,2
7 1,5 1,7 1,5 10,4 4,8 5,0 6,3
Таблица 4
Активность биокатализатора (ЕА/г) в реакции синтеза эфиров жирных кислот с ^додеканолом (С 12) (содержание липазы в биокатализаторе 6,2 мг/г)
Номер реакционного цикла Кислота
С4:0 С5:0 С6:0 С7:0 С9:0 С10:0 С18:0
1 1,0 1,5 1,2 8,3 3,7 4,3 4,3
2 1,0 1,5 1,4 9,4 4,5 5,1 5,0
3 0,9 1,1 1,2 8,8 4,6 5,8 4,8
4 0,8 1,3 1,1 8,1 2,9 3,6 6,4
5 1,3 1,4 1,4 10,0 4,0 4,5 7,7
6 1,1 1,3 1,2 9,3 4,8 4,7 6,4
7 10,1
Таблица 5
Активность биокатализатора (ЕА/г) в реакции синтеза эфиров жирных кислот с и-гексадеканолом (С 16) (содержание липазы в биокатализаторе 6,2 мг/г)
Номер реакционного цикла Кислота
С4:0 С5:0 С6:0 С7:0 С9:0 С10:0 С18:0
1 1,0 1,3 1,7 6,8 3,5 3,1 3,0
2 0,8 1,2 1,1 10,4 3,4 4,2 6,1
3 0,9 1,1 1,0 5,6 3,4 4,1 4,2
4 0,7 1,0 0,8 6,4 3,4 4,3 6,3
5 0,7 1,2 1,1 7,9 3,5 4,5 5,8
6 0,6 1,2 0,9 7,3 3,2 4,5 7,5
7 0,7 1,0 0,9 7,4 3,9 4,8 7,1
8 0,8 1,2 1,3 7,8 3,1 3,8 9,1
9 0,9 1,4 1,3 7,4 4,1 4,4 5,1
10 8,3 3,5 5,0 6,9
11 0,9 1,4 1,3 8,4 4,0 6,4 6,0
Таблица 6
Активность биокатализатора (ЕА/г) в реакции синтеза эфиров жирных кислот с и-октанолом (С8) (содержание липазы в биокатализаторе 14,0 мг/г)
Номер реакционного цикла Кислота
С4:0 С5:0 С6:0 С7:0 С9:0 С10:0 С18:0
1 0 0 2,4 11,1 8,6 6,7 8,2
2 3,5 5,2 7,6 33,2 19,7 18,1 19,1
3 5,8 7,4 9,2 33,8 22,5 24,3 22,1
4 7,4 8,5 10,6 42,2 28,6 29,5 29,1
5 6,6 8,9 9,5 35,8 25,9 33,2 19,6
6 5,2 6,4 7,1 42,9 24,7 24,7 25,9
7 4,3 4,9 5,9 46,2 19,8 22,3 20,8
8 4,1 5,1 6,8 44,7 27,1 29,2 20,1
9 3,2 5,7 6,5 36,3 23,9 23,1 24,2
10 4,5 6,0 7,6 38,7 29,4 31,1 27,3
Характерным является поведение свежеприготовленного биокатализатора в первых двух реакционных циклах. Из данных, представленных на рис. 4 и табл. 6, видно, что этерифицирующая активность увеличивается в 1,5-2 раза; наблюдается стадия «кондиционирования» биокатализатора. Это происходит благодаря образованию в процессе этерификации молекул воды как продукта реакции; силикагель удерживает воду внутри гранул, что создает благоприятное для биокатализа водное окружение вблизи иммобилизованной липазы.
2 4 б 8 ю
Номер реакционного цикла
Рис. 4. Стабильность биокатализатора в реакции синтеза сложного эфира энантовой кислоты в зависимости от строения спирта -
децилового (С 10) и цетилового (С 16). Содержание липазы в биокатализаторе составило 6,2 мг/г
Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУН ИК СО РАН.
Список литературы
1. Jaeger K.-E., Egge T. Lipases for biotechnology // Current Opinion in Biotechnology. - 2002. - № 13. - С. 390-397.
2. Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches / P. Villeneuve, J.M. Muderhwa, J. Graille, M.J. Haas // J. Mol. Catal. B: Enzym. - 2000. - № 9. - P. 113-148.
3. Rodrigues R.C., Fernandez-Lafuente R. Lipase from Rhizomucor miehei as an industrial biocatalyst in chemical process // J. Mol. Catal.B: Enzym. - 2010. -№ 64. - P. 1-22.
4. Rodrigues R.C., Fernandez-Lafuente R. Lipase from Rhizomucor miehei as a biocatalyst in fats and oils modification // J. Mol. Catal.B: Enzym. - 2010. -№ 66. - P. 15-32.
5. Fernandez-Lafuente R. Lipase from Thermomyces lanuginosus: Uses and prospects as an industrial biocatalyst // J. Mol. Catal.B: Enzym. - 2010. - № 62. -P.197-212.
6. Contesini F.J., Lopes D.B., Macedo G.A., Nascimento M., Carvalho P. Aspergillus sp. lipase: Potential biocatalyst for industrial use // J. Mol. Catal.B: Enzym. - 2010. - № 67. - P. 163-171.
7. Безбородов А.М., Загустина Н.А. Липазы в реакциях катализа в органическом синтезе (обзор) // Прикл. биохим. микробиол. - 2014. - № 50 (4). -С. 347-373.
8. Engineering catalytic efficiency of thermophilic lipase from Geobacillus zalihae by hydrophobic residue mutation near the catalytic pocket / R.A. Wahab, M. Basri, M.B.A. Rahman, R.N.Z.R.A. Rahman, A.B. Salleh, L.T. Chor // Adv. Biosci. Biotechnol. - 2012. - № 3. - P. 158-167.
9. Theil F. Enhancement of selectivity and reactivity of lipases by additives // Tetrahedron. - 2000. - № 56. - P. 2905- 2919.
10. Modulation of the regioselectivity of Thermomyces lanuginosus lipase via biocatalyst engineering for the ethanolysis of oil in fully anhydrous medium / E.A. Silveira, S. Moreno-Perez, A. Bass, S. Serban, R.P. Mamede, P.W. Tardioli, C.S. Farinas, J. Rocha-Martin, G. Fernandez-Lorente, J. Guisan // BMC Biotechnol. - 2017. - № 17. - P. 88-101.
11. Esterification reactions catalyzed by lipases in microemulsions: the role of enzyme localization in relation to its selectivity / H. Stamatis, A. Xenakis, M. Provelegiou, F.N. Kolisis // Biotechnol. Bioeng. - 1993. - № 42. - P. 103-110.
12. Talon R., Montel M.-C.; Berdague J.-L. Production of flavor esters by lipases of Staphyloccus warneri and Staphylococcus xylosus // Enz. Microb. Technol. - 1996. - № 19. - P. 620-622.
13. Ферментативная этерификация насыщенных жирных кислот алифатическими спиртами как альтернативный способ низкотемпературного синтеза сложных эфиров / Л.В. Перминова, Г.А. Коваленко, Н.В. Чуканов, Ю.В. Патрушев // Изв. Академии наук. Серия химическая. - 2017. - № 11. -С.2194-2197.
14. Lipases for use in industrial biocatalysis: Specificity of selected structural groups of lipases / S. Naik, A. Basu, R. Saikia, B. Madan, P. Paul, R. Chaterjee, J. Brask, A. Svendsen // J. Mol. Catal.B: Enzym. - 2010. - № 65. - P. 18-23.
15. Исследование специфичности этерификации энантовой кислоты с алифатическими спиртами иммобилизованной рекомбинантной липазой / Л.В. Перминова, Г.А. Коваленко, А.Б. Беклемишев, А.Л. Мамаев // Актуальная биотехнология. - 2017. - № 2 (21). - С. 21-24.
References
1. Jaeger K.-E., Egge T. Lipases for biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 2002, no. 13, pp. 390-397.
2. Villeneuve P., Muderhwa J.M., Graille J., Haas M.J. Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches. J. Mol. Catal.B: Enzym., 2000, no. 9, pp. 113-148.
3. Rodrigues R.C., Fernandez-Lafuente R. Lipase from Rhizomucor miehei as an industrial biocatalyst in chemical process. J. Mol. Catal.B: Enzym., 2010, no. 64, pp. 1-22.
4. Rodrigues R.C., Fernandez-Lafuente R. Lipase from Rhizomucor miehei as a biocatalyst in fats and oils modification. J. Mol. Catal. B: Enzym., 2010, no. 66, pp. 15-32.
5. Fernandez-Lafuente R. Lipase from Thermomyces lanuginosus: Uses and prospects as an industrial biocatalyst. J. Mol. Catal.B: Enzym., 2010, no. 62, pp. 197-212.
6. Contesini F.J., Lopes D.B., Macedo G.A., Nascimento M., Carvalho P. Aspergillus sp. lipase: Potential biocatalyst for industrial use. J. Mol. Catal.B: Enzym., 2010, no. 67, pp. 163-171.
7. Bezborodov A.M., Zagustina N.A. Lipazy v reaktsiiakh kataliza v organicheskom sinteze [Lipases in catalytic reactions of organic sybthesis]. Appl. Biochem. Microbiol., 2014, no. 4, pp. 347-373.
8. Wahab R.A., Basri M., Rahman M.B.A., Rahman R.N.Z.R.A., Salleh A.B., Chor L.T. Engineering catalytic efficiency of thermophilic lipase from Geobacillus zalihae by hydrophobic residue mutation near the catalytic pocket. Adv. Biosci. Biotechnol., 2012, no. 3, pp. 158-167.
9. Theil F. Enhancement of selectivity and reactivity of lipases by additives. Tetrahedron, 2000, no. 56, pp. 2905-2919.
10. Silveira E.A.. Moreno-Perez S., Bass A., Serban S., Mamede R.P., Tardioli P.W., Farinas C.S., Rocha-Martin J., Fernandez-Lorente G., Guisan J. Modulation of the regioselectivity of Thermomyces lanuginosus lipase via biocatalyst engineering for the ethanolysis of oil in fully anhydrous medium. BMC Biotechnol, 2017, no. № 17, pp. 88-101.
11. Stamatis H., Xenakis A., Provelegiou M., Kolisis F. N. Esterification reactions catalyzed by lipases in microemulsions: the role of enzyme localization in relation to its selectivity. Biotechnol. Bioeng., 1993, no. 42, pp. 103-110.
12. Talon R., Montel M.-C.; Berdague J.-L. Production of flavor esters by lipases of Staphyloccus warneri and Staphylococcus xylosus. Enz. Microb. Technol., 1996, no. 19, pp. 620-622.
13. Perminova L.V., Kovalenko G.A., Chukanov N.V., Patrushev Iu.V. Fermentativnaia eterifikatsiia nasyshchennykh zhirnykh kislot alifaticheskimi spirtami kak al'ternativnyi sposob nizkotemperaturnogo sinteza slozhnykh efirov [Enzymatic esterification of saturated fatty acids with aliphatic alcohols as an alternative method of low-temperature synthesis of esters]. Russ. Bull.: Chem., 2017, no. 11, pp. 2194-2197.
14. Naik S., Basu A., Saikia R., Madan B., Paul P., Chaterjee R., Brask J., Svendsen A. Lipases for use in industrial biocatalysis: Specificity of selected structural groups of lipases. J. Mol. Catal.B: Enzym, 2010, no. 65, pp. 18-23.
15. Perminova L.V., Kovalenko G.A., Beklemishev A.B., Mamaev A.L. Issledovanie spetsifichnosti eterifikatsii enantovoi kisloty s alifaticheskimi spirtami immobilizovannoi rekombinantnoi lipazoi [Study on specificity of esterification of enanthic acid with aliphatic alcohols by immobilized recombinant lipase]. Aktual'naia biotekhnologiia, 2017, no. 21, pp. 21-24.
Получено 23.04.2018
Об авторах
Коваленко Галина Артемьевна (Новосибирск, Россия) - доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Института катализа СО РАН, профессор Новосибирского государственного университета (630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5, e-mail: galina@catalysis.ru).
Перминова Лариса Валентиновна (Новосибирск, Россия) - кандидат химических наук, научный сотрудник Института катализа СО РАН (630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5, e-mail: perminova@catalysis.ru).
Беклемишев Анатолий Борисович (Новосибирск, Россия) - доктор биологических наук, заведующий лабораторией НИИ биохимии СО РАН (630117, г. Новосибисрк, ул. Тимакова, 2, e-mail: beklem@niibch.ru).
Пыхтина Мария Борисовна (Новосибирск, Россия) - научный сотрудник НИИ биохимии СО РАН (630117, г. Новосибисрк, ул. Тимакова, 2, e-mail: Pykhtina_maria@mail.ru).
About the authors
Galina A. Kovalenko (Novosibirsk, Russian Federation) - Doctor of Chemical Sciences, Leading Researcher of the Institute of Catalysis of the SB RAS, Professor of Novosibirsk State University (5, Academician Lavrentiev av., Novosibirsk, 630090, e-mail: galina@catalysis.ru).
Larisa V. Perminova (Novosibirsk, Russian Federation) - Ph.D. in Chemical Sciences, Researcher of the Institute of Catalysis of the SB RAS (5, Academician Lavrentiev av., Novosibirsk, 630090, e-mail: perminova@catalysis.ru).
Anatoly B. Beklemishev (Novosibirsk, Russian Federation) - Doctor of Biological Sciences Head of Laboratory of the Research Institute of Biochemistry of the SB RAS (2, Timakov str., Novosibirsk, 630117, e-mail: beklem@niibch.ru).
Maria B. Pykhtina (Novosibirsk, Russian Federation) - Researcher of the Research Institute of Biochemistry of the SB RAS (2, Timakov str., Novosibirsk, 630117, e-mail: Pykhtina_maria@mail.ru).
