CC BY
19
УДК 577.151
К. Л. Шнайдер, А. Ф. Каюмова, В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева
ЭНЗИМАТИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ БЕНЗИЛБУТИРАТА
Ключевые слова: панкреатическая липаза, синтез бензилбутирата.
Показана возможность синтеза бензилбутирата в среде органического растворителя с помощью биокатализатора - панкреатической липазы. Оптимизация процесса этерификации проводилась с учетом мольного соотношения кислота:спирт (1:1- 1:2,5),температуры процесса (25-37 °С), концентрации фермента и продолжительности процесса. В подобранных условиях конверсия масляной кислоты составила 91 % за 12 часов.
Keywords: pancreatic lipase, the synthesis of benzyl butyrate.
The possibility of the synthesis of benzyl butyrate by using pancreatic lipase as biocatalysts in organic solvents has been shown. Optimization of esterification process was carried out taking into account the molar ratio of acid:alcohol (1:11:2,5), temperature(25-37 °C),concentration of enzyme and duration of the process. In selected conditions, the conversion of butyric acid was 91% during 12 hours.
Введение
В современной биотехнологии одно из важных мест принадлежит ферментным препаратам липаз. Благодаря уникальным свойствам липаз, они представляют наибольший интерес для использования в различных отраслях промышленности. Они применяются для производства биодизельного топлива, создания различных душистых веществ, ПАВ, вос-ков, биологически активных веществ, синтеза лекарственных средств и так далее [1-7].
В данной работе показана возможность энзима-тического синтеза одного из душистых веществ бензилбутирата, а также экспериментально подобраны параметры процесса, позволяющие повысить выход целевого продукта.
Материалы и методы
Для синтеза был использован коммерческий препарат Lipase from porcine pancreas, Type II лио-фильно высушенный с активностью 100-500 ед./мг белка (107 ед./мг белка с использованием оливкового масла в качестве субстрата), производство -США.
В типичном эксперименте концентрация масляной кислоты составляла 0,1 М/л, концентрация бен-зилового спирта менялась от 0,1 до 0,25 М/л. Концентрация фермента изменялась от 3 мг/мл до 20 мг/мл.
Методика эксперимента: к сухому ферментному препарату добавляли раствор субстратов в гексане. Полученную суспензию тщательно перемешивали и выдерживали в течение 0-30 часов без перемешивания. Температура проведения процесса составляла 25-37 °С.
Контрольные пробы не содержали ферментного препарата. В контрольный образец вносили ферментный препарат непосредственно перед проведением титрования.
По истечении заданного времени опытные и контрольные пробы оттитровывали свежеприготовленным 0,1 н спиртовым раствором едкого натра в присутствии 2-3 капель 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина.
Конверсию масляной кислоты (W, %) рассчитывали по формуле
^ = KO>.100,
K
где К - объем 0,1 н спиртового раствора едкого натра пошедшего на титрование контрольной пробы, мл; О - объем 0,1 н спиртового раствора едкого натра пошедшего на титрование опытной пробы, мл.
Для получения продукта после проведения реакции суспендированный фермент отделяли фильтрованием через фильтровальную бумагу Whatman, тип № 1. Органический растворитель из реакционной массы отделяли отгонкой вод вакуумом и образование эфира подтверждали определяя показатель преломления (n20D).
Все эксперименты проводились не менее чем в пяти повторностях. Расчет погрешности измерений произведен по стандартной методике, используя критерий Стьюдента при доверительной вероятности 0,95.
Обсуждение результатов
Душистые вещества находят широкое применение в различных отраслях промышленности: парфюмерно-косметической, пищевой, а также в арома-терапии. Одним из современных методов получения душистых веществ является ферментативный метод, который позволяет осуществлять синтез эфиров в «мягких условиях» без образования побочных продуктов.
В данной работе исследован ферментативный синтез бензилбутирата с помощью ферментного препарата панкреатической липазы в среде гексана.
Бензилбутират обладает фруктовым запахом с ноткой жасмина и широко применяется в парфюмерных композициях, отдушках и пищевых ароматических эссенциях при дозировке до 5 %.
Предыдущие исследования в области ферментативного синтеза [3,4] показывают возможность осуществления синтеза бутиленгликольлаурата, изоамилпропионата, изоамилвалерата, изоамилбен-зоата, изоамилабиетата, изоамилсалицилата с помощью панкреатической липазы. В этих работах
отражено влияние на протекание ферментативного синтеза ряда параметров: вида органического растворителя, температуры, концентрации реагентов в реакционной смеси, количество фермента, продолжительности реакции.
Поэтому изначально была исследована зависимость ферментативной активности от соотношения кислота:спирт. В качестве органической среды использовался неполярный растворитель - гексан, так как, на основании литературных данных [3] известно, что в среде гексана ферментативный синтез протекает более успешно, чем в других органических растворителях. Условия реакции были следующими: масляная кислота вводилась в систему в концентрации 0,1 М/л, количество бензилового спирта менялось в диапазоне концентраций от 0,1 до 0,25 М/л. Полученные данные представлены на рисунке 1.
100
1,0:1,0 1,0:1,5 1,0:2,0 1,0:2,5
Соотношение масляная кислота : бензиловый спирт, М/М Рис. 1 - Влияние соотношения масляная кисло-та:бензиловый спирт на конверсию масляной кислоты (условия реакции: среда - гексан, количество фермента - 5 мг/мл, температура - 30 °С, продолжительность процесса - 24 часа)
Обычно скорость реакции прямо пропорциональна количеству фермента, при условии, если содержание субстрата в пределах оптимума или немного выше [4].
Второй этап работы заключался в подборе количества фермента для данной реакции, диапазон составил от 3 до 20 мг/мл. В ходе исследования было определено, что наибольший выход бензилбутирата наблюдается в системе содержащей 5 мг/мл ферментного препарата. Вероятно, при более высоком содержании фермента в реакционной системе наблюдаются внешнедиффузионные ограничения, что приводит к снижению эффективности использование ферментного препарата. Данные представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Влияние количества фермента на степень конверсии масляной кислоты (условия реакции: среда - гексан, температура - 30 °С, продолжительность процесса - 24 часа, соотношение кислота : спирт (М/М) - 1:1,5)
Душистое Количество ферментного препарата, мг/мл Конверсия масляной кислоты, %
вещество
3 87± 2,3
Бензил- 5 91± 0,6
бутират 10 86,5 ± 1,2
20 80 ± 1,2
Температура - один из важных параметров проведения ферментативной реакции. Следующим этапом был подбор температуры для проведения ферментативного синтеза. Был рассмотрен диапазон температур от 25 до 37 °С. Данные представлены на рисунке 2.
^ 100
25 "С 30 "С 37 "С
Температура, °С
Рис. 2 - Влияние температуры на на степень конверсии масляной кислоты (условия реакции: среда - гексан, количество фермента - 5 мг/мл, продолжительность процесса - 24 часа, соотношение кислота : спирт -1:1,5)
Установлено, что в среде органического растворителя активность ферментного препарата практически не меняется в диапазоне исследуемых температур.
Исследование кинетической зависимости синтеза бензилбутирата показало, что максимальный выход целевого продукта достигается уже через 12 часов проведения процесса. При дальнейшем увеличении
Из данных представленных на рисунке 1, видно, что при увеличении доли бензилового спирта ферментативная активность возрастает, и, достигнув определенного максимума, снижается. Наибольшая конверсия кислоты наблюдалась при мольном соотношении кислота:спирт - 1:1,5-1:2,090,5 и составила 90-91,0 % при. Снижение выхода продукта реакции при дальнейшем повышении концентрации спирта в системе связано с ингибированием фермента избытком спирта. Так как значения конверсии кислоты при соотношении кислота : спирт в реакционной смеси 0,1:0,15 и 0,1:0,20 М/М были близки, то с целью уменьшения затрат на реагенты и очистку целевого продукта было выбрано соотношение масляная кислота и бензиловый спирт равное 0,1 М/л и 0,15 М/л, соответственно.
Известно, что на ферментативную активность, а, следовательно, и на выход сложного эфира может влиять изменение количества фермента в системе. Такая закономерность подтверждается литературными данными [4], которые основываются на протекании реакции по закону действующих масс.
продолжительности процесса устанавливается равновесие между прямой и обратной реакцией, и выход целевого продукта практически не изменяется. Поэтому дальнейшее увеличение продолжительности процесса нецелесообразно, т.к. не приводит к повышению выхода целевого продукта. Полученные данные представлены на рисунке 3.
Продолжительность процесса, ч
Рис. 3 - Влияние продолжительности процесса на выход бензилбутирата (условия реакции: среда -гексан, количество фермента - 5 мг/мл, соотношение кислота:спирт - 0,1:0,15 (М/М), температура - 30 °С)
В результате проведенных исследований были определены следующие условия ферментативного синтеза, позволяющие получить максимальный выход целевого продукта (табл. 2).
Образование сложного эфира подтверждали, определяя показатель преломления, значение которого n20D составило 1,4980 [8].
Таким образом, установлены оптимальные параметры процесса ферментативного синтеза бензилбу-тирата, позволяющие получить целевой продукт с выходом 91%.
Таблица 2 - Условия проведения ферментативного синтеза бензилбутирата панкреатической липазой
Параметр проведения реакции Значение параметра
Соотношение масляная кислота : бензиловый спирт в реакционной смеси, М/М 0,1:0,15
Количество ферментного препарата, мг/мл 5
Температура проведения реакции, °С 25-37
Продолжительность процесса, ч 12
Литература
1. Miranda, J.S., Silva, N.C.A., Bassi, J.J., Corradini, M.C.C., Lage, F.A.P., Hirata, D.B., Mendes, A.A., Immobilization of Thermomyces lanuginosus Lipase on Mesoporous Poly-Hydroxybutyrate Particles and Application in Alkyl Esters Synthesis: Isotherm, Thermodynamic and Mass Transfer Studies. Chem. Eng. J. 251, 2014, 392403.
2. Silva, N.C.A., Miranda, J.S., Bolina, I.C.A., Silva, W.C., Mendes, A.A., Immobilization of Porcine Pancreatic Lipase on Poly-Hydroxybutyrate Particles for the Production of Ethyl Esters from Macaw Palm Oils and Pineapple Flavor. Biochem. Eng. J. 82, 2014,139-149.
3. Зиновьева М. Е. Ферментативный синтез бутиленгли-кольлаурата / М. Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова, К. Л. Шнайдер, Е. В. Назаренко // Вестник технологического университета. - 2015. - №1. - С. 100-103.
4. Гамаюрова В. С. Ферментативный синтез душистых веществ / В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева, Е. В. Елизарова // Вестник Казанского технологического университета. - 2004. - №1. - С. 239-244.
5. V.S. Gamayurova, K.L. Shnaider, S.K. Zaripova, M.J. Jamai. Synthesis of aliphatic flavoring substances by lipase / J. Adv. Chem. Sci. 2(2) (2016) 259-260.
6. Гамаюрова В.С., Шнайдер К.Л., Джамай М.Д. Ферментативный синтез бутиратов сивушного масла. Катализ в промышленности. 2016;16(3):64-68.
7. С.А. Войткевич. 865 душистых веществ для парфюмерии и бытовой химии// М.: Пищевая промышленность, 1994г. - 594с.
© К. Л. Шнайдер - к.х.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ; А. Ф. Каюмова - бакалав ргруппы 623111 кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ; В. С. Гамаюрова - д.х.н., проф. кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ; М. Е. Зиновьева - к.т.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ, romanova_rg@mail.ru;
© K. L. Shnaider - PhD in Chemical sciences, Associate Professor at the Department of Food biotechnology KNRTU, A. F. Kayumova - Bachelor at the Department of Food biotechnology KNRTU; V. S. Gamayurova - Doctor of in Chemical sciences, Professor at the Department of Food biotechnology KNRTU; M. E. Zinov'eva - PhD in Engineering sciences KNRTU, Associate Professor at the Department of Food biotechnology KNRTU, romanova_rg@mail.ru.
