CC BY
32
УДК 577.151
В. С. Гамаюрова, Н. И. Бильданова, М. Джамай
ЭНЗИМАТИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БУТИЛПРОПИОНАТА
Ключевые слова: липазы, этерификация, сложные эфиры, конверсия.
В работе осуществлен энзиматический синтез душистого вещества бутилпропионата с применением ряда липаз Novozym 435, Novozym 40086 и Lypozyme ^1М.. Показано, что все использованные липазы эффективно катализируют процесс этерификации. Конверсия через 3 часа ведения процесса составляет порядка 90%. Этерификация проводилась в органическом растворителе гексане. Продукт выделен и снят его спектр ИКС, подтверждающий образование эфира.
Key words: lipases, esterification, esters, conversion.
The enzymatic synthesis of the flavour substance of butyl propionate was carried out using a number of lipases Novozym 435, Novozym 40086 and Lypozyme TLIM. It is shown that all lipases used effectively catalyze the esterification process. Conversion after 3 hours of process maintenance is about 90%. The esterification was carried out in an organic solvent hexane. The product was isolated and its spectrum of IRS was removed, confirming the formation of the ether.
Введение
Бутилпропионат входит в реестр душистых веществ РФ, имеет запах эфирно-фруктовый с грибным оттенком и применяется в качестве ароматического вещества в пищевой промышленности [1]. Основной задачей в настоящей работе было показать возможность получения бутилпропионата ферментативным способом, поскольку последний имеет ряд преимуществ технологического, экологического и энергетического характера по сравнению с существующими химическими методами. Использование ферментативных методов, кроме указанных преимуществ, позволяет получать более чистые продукты, вследствие высокой специфичности ферментов и низких температур синтеза.
Ранее нами было проведено ряд синтезов душистых веществ из класса сложных эфиров и было показано, что наиболее подходящим растворителем для проведения процесса является гексан [2-4]. Очень интенсивно начали проводиться исследования по энзиматическому синтезу душистых веществ за рубежом [5,6].
Материалы и методы
В работе использовались следующие липазы фирмы Novozymes:
1. Novozym 435 - неспецифическая липаза, иммобилизована на силикагеле, продуцент Aspergillus niger.
2. Novozym 40086 - 1,3 липаза, иммобилизована на силикагеле, продуцент Aspergillus oryzae.
3. Lypozyme TLIM - 1,3 липаза, иммобилизована на силикагеле, продуцент Aspergillus oryzae.
Использовался спирт бутиловый марки «А», ГОСТ 6006-78, кислота пропионовая марки «Ч», гексан марки «ХЧ» с температурой кипения 69°С. Кислота в экспериментах использовалась в концентрации 0,1N, молярное соотношение кислота: спирт 1:2, концентрация ферментов варьировались 10 и 20 мг/мл, температура 30-35°С. Контроль
процесса осуществлялся по остаточному количеству кислоты в реакционной массе путем титрования водно-спиртовым раствором щелочи NaOH. Конверсия кислоты (В) рассчитывалась по формуле В=К-°х100%, где К - количество раствора щелочи,
К
пошедшее на титрование контроля; О - количество щелочи, пошедшее на титрование пробы.
После завершения процесса фермент отделялся от реакционной массы, и она подвергалась отгонке под вакуумом для удаления растворителя и избытка спирта.
Чистота продукта реакции определялась методами ИК спектроскопии и рефрактометрии. Показатель преломления определялся на рефрактометре ИРФ-20.
ИК спектр эфира снимали на Фурье-спектрометре «Инфралюм ФТ-08» (Perkin Elmer) с приставкой НПВО (нарушенного полного внутреннего отражения) «Алмаз KRS-5» (разрешение 1 см-1, накопление 32 сканов, диапазон съемки 4000-400 см-1).
Все эксперименты проводили в 6 повторностях, обработка результатов по программе «STATISTICA 6» показала среднюю стандартную ошибку 6,3%.
Результаты и обсуждение
Процесс проводили в гексане, так как он обладает наименьшим ингибирующим эффектом на ферменты. На рис. 1 приведены результаты ферментативного синтеза бутилпропионата с использованием ферментного препарата Novozym 435 при вариации концентрации его 10 и 20 мг/мл, температура 30 и 35°С.
Эти данные показывают, что через 0,5 часа конверсия кислоты составляет 74-82% в зависимости от концентрации фермента, и через 1 час при концентрации фермента 10 и 20 мг/мл процесс фактически завершен с конверсией около 90%. Увеличение концентрации фермента с 10 до 20 мг/мл ускоряет процесс на его начальных стадиях.
На рис. 2 приведены результаты ферментативного синтеза бутилпропионата с использованием фермента Novozym 40086.
Рис. 1 - Контроль ферментативного синтеза бутилпропионата. Фермент - Novozym 435, количество 10 и 20 мг/мл, Т=35°С
0
0,5
1
2 3
Время, час
Рис. 2 - Контроль ферментативного синтеза бутилпропионата. Фермент - Novozym 40086, количество 10 и 20 мг/мл, ^ Т=30^ и 35°С.
При использовании фермента Novozym 40086 эффективность этерификации составляет 90% конверсии через 2 часа процесса при Т=30°С. Увеличение температуры процесса до 35°С способствует повышению конверсии на 5-10% (при низком содержании фермента, 10 мг/мл) и 9-13% при увеличении содержания фермента (20 мг/мл).
На рис. 3 приведены результаты ферментативного синтеза бутилпропионата с использованием ферментного препарата Lypozyme ТЬГМ. Эти данные показывают, что фермент Lypozyme ТЬГМ также активно осуществляет этерификацию пропионовой кислоты бутанолом. Максимальные выходы достигают через 3 часа процесса и составляют 90-92% конверсии кислоты.
Увеличение концентрации фермента ведет к ускорению процесса. Увеличение температуры процесса с 30 до 35°С ведет к незначительному увеличению конверсии кислоты при более высоком содержании фермента (20 мг).
После завершения процесса избыток спирта и растворитель были отогнаны под вакуумом, а продукт реакции был исследован методами ИКС и рефрактометрии.
Рис. 3 - Контроль ферментативного синтеза бутилпропионата. Фермент - Lypozyme TLIM, количество 10 и 20 мг/мл, Т= 30 и 35°С
■10ыг'ыл,30оС
■Юмг-мл.З^С
-20 иг Hi. 3011С
-20 mW 35*1;
Был снят ИК-спектр бутилпропионата и пропионовой кислоты. Появление в спектре частоты
валентных колебаний эфирной связи Ус_о 1182,1
см_1, смещение частоты валентных колебаний Ус=о
1736,6 см-1 в эфире по сравнению с Ус=о
пропионовой кислоты Ус=о 1708,5, а также отсутствие на спектре эфира частоты колебаний гидроксильных групп в области 3000-3200 см-1 являются достоверными доказательствами получения чистого эфира бутилпропионата. Показатель преломления бутилпропионата п^°=1,40000.
Выводы
Все использованные ферменты способны эффективно катализировать процесс этерификации бутанола и пропионовой кислоты. На основании полученных данных можно подобрать нужную концентрацию ферментов и температуру процесса в соответствии с поставленными задачами. Спектр ИКС и рефрактометрия подтверждают получение чистого продукта бутилпропионата.
Литература
Изд.
С.
Е.В.Смирнов, Пищевые ароматизаторы, «Профессия», Санкт-Петербург, 2008, 725 с. Е. В. Елизарова, М. Е. Зиновьева, В Гамаюрова//Вестник Казанского технологического университета, 2006, №6, с. 69-72. В. С. Гамаюрова, К. Л. Шнайдер, Матаз Дж. Джамай//Катализ в промышленности, 2016, т.16, №3, с. 64-68.
V.S. Gamayurova, K.L. Shnaider, S.K. Zaripova, MJJamai//Joumal of Advanced Chemical Sciences 2(2), 2016, р. 259-260.
Jitian Wang, Wei Du// Journal of Mol.Catalysis:B:Enzymatic, v.127, 2016, p.11-17. 6. A. Katogan, A. Kecskemeti, A. Srekeris// Journal of Mol.Catalysis: Enzymatic, v.127, 2016, p. 47-55.
2
3
4
5
В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, gamaur@kstu.ru; Н. И. Бильданова - магистр той же кафедры; М. Джамай - асп. той же кафедры.
V. S. Gamayurova - Doctor of Chemistry, Professor of the Department of "Food Biotechnology" KNRTU, gamaur@kstu.ru; N. I. Bildanova - Master of the same Department; M. Jamay - postgraduate student of the same Department.
