CC BY
26Н.М. Бирюкова1, А.М. Островская1, В.Г. Соколов1,
Л.В. Кухарева2, В.А. Игнатенко2, Т.В. Г иль2
ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ И СОСТАВА ФЛАВОНОИДОВ И ФЕНОЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ РАСТЕНИЙ РОДА BUPLEURUM L., КУЛЬТИВИРОВАННЫХ В БЕЛАРУСИ
1Учреждение Белорусского государственного университета «Научно-исследовательский институт физико-химических проблем» 2Государственное научное учреждение «Центральный ботанический сад НАН Беларуси»
Приведены результаты исследования качественного и количественного состава биофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот в образцах лекарственного растительного сырья володушки, выращенных в коллекционном питомнике Центрального ботанического сада НАН Беларуси, а также прослежена сезонная изменчивость содержания этих компонентов. Методами ВЭЖХ, спектрофотометрии и бумажной хроматографии были идентифицированы агликоны флавонолов и установлено высокое содержание биофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот. Данные образцы могут рассматриваться как перспективное сырье для разработки новых отечественных лекарственных средств.
Ключевые слова: Bupleurum L., Bupleurum aureum Fisch., Bupleurum rotungifo-lium L., флавоноиды, кверцетин, кемпферол, фенолкарбоновые кислоты, ВЭЖХ.
ВВЕДЕНИЕ
Фундаментальные и прикладные исследования природных полифенолов послужили основой для создания целой
области фармацевтической индустрии, выпускающей сотни наименований лекарственных средств, пищевых и биологически активных добавок (БАД), основным компонентом которых являются
флавоноиды. Именно в сфере лечебного использования флавоноидов традиционная медицина особенно близко сомкнулась с имеющими тысячелетнюю историю восточными системами лечения, основанными на использовании лекарственных растений. Флавоноидсодер-жащие растения привлекают внимание исследователей вследствие их перспективности в получении лекарственных средств широкого спектра действия.
В основе антиоксидантного действия флавоноидов лежит их способность подавлять образование свободных радикалов, являющихся причиной возникновения у человека многих тяжелых патологий, и выводить их из организма. Г идроксильные группы флавоноидов содержат подвижные атомы водорода, легко реагирующие с перекисными радикалами и обрывающие цепи окисления [1,2].
Выбор объектов исследования, часто определяющий результативность работы, должен обосновываться потенциальными или доказанными возможностями их практического использования. Виды володушек (Вир1еигит L.) используются в народной и официнальной медицине в качестве желчегонных, вяжущих и стимулирующих средств. Фармакологами и клиницистами установлено желчегонное и противовоспалительное действие настоев из травы володушки, а также благоприятное действие володушки золотистой на выделение желудочного сока. Зарубежные ученые объясняют фармакологическую активность (капилляроукрепляющее и антигиалуронидаз-ное действие) видов рода Вир1еигит L. действием флавоноидов, содержащихся в различных органах растения [3,4].
Проведенный анализ рынка продукции, содержащей растения рода Вир1еигит L., выявил широкий спектр лекарственных средств, производимых в странах ближнего и дальнего зарубежья [5-9].
Род Вир1еигит L. представлен как многолетними, так и однолетними травянистыми растениями, имеет обширный ареал. Отдельные виды их встречаются в Европе, Сибири, Казахстане, Киргизии, Монголии, Китае, на Урале и Дальнем Востоке. Растут на субальпийских лугах, высокогорных полянах, среди смешанных хвойных и лиственных лесов, реже на пойменных лугах, в горных тундрах,
на каменистых склонах в высокогорьях [4]. На территории Беларуси растения рода Вир1еигит L. не произрастают. Одним из условий закладки искусственных плантаций полезных растений, в том числе и лекарственных, является создание базы исходного материала, источником которого является наличие особей, прошедших интродукционные испытания и показавших высокие адаптационные способности в новых условиях. Полученные в лаборатории биоразнообразия растительных ресурсов ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси» результаты позволяют рассматривать володушку как лекарственную культуру, перспективную для испытания в промышленных условиях Беларуси.
Целью настоящей работы являлось изучение качественного и количественного состава биофлавоноидов и фенол-карбоновых кислот и установление времени оптимальных сроков сбора сырья для получения наибольшего выхода ценных компонентов в сухой надземной массе володушек, выращенных в коллекционном питомнике лаборатории биоразнообразия растительных ресурсов ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси».
МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования были выбраны образцы володушки золотистой (Ви-р1еигит аигеит Fisch.) и володушки крупнолистной (Вир1еигит гotungifo1ium L.), выращенные в коллекционном питомнике лаборатории биоразнообразия растительных ресурсов ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси».
Химический анализ образцов на содержание отдельных групп фенольных соединений проводили с использованием следующих методов:
- суммарное количество антоциано-вых пигментов - по методу [10] с измерением оптической плотности элюатов на фотоколориметре КФК-2 при длине волны 540 нм. Градуировочную кривую строили по кристаллическому цианидину, полученному из плодов аронии черноплодной и очищенному по методике [11];
- суммарное количество катехинов -по методу [12] с использованием ванилинового реактива. Расчет проводили по
градуировочному графику, составленному по (+)-катехину. Измерение оптической плотности элюатов проводили на фотоколориметре КФК-2 при длине волны 490-500 нм;
- суммарное количество флавонолов -по методу [13], модифицированному [14]. Оптическую плотность элюатов измеряли на спектрофотометре VSU=2P (Германия) при длине волны 258 нм. Расчет проводили на кверцетин;
- суммарное количество фенолкар-боновых кислот - по методу [15]. Оптическую плотность элюатов измеряли на спектрофотометре VSU=2P (Германия) при длине волны 325 нм. Расчет проводили по градуировочному графику, составленному по хлорогеновой кислоте.
ВЭЖХ - анализ агликонов флавоно-лов проводили согласно методике [16].
Условия экстрагирования: 0,1 г измельченного материала заливали 10 мл 70 % этилового спирта и проводили экстрагирование на кипящей водяной бане до полного извлечения флавоноидов (4 слива через 30 мин). Для получения агликонов водно-спиртовой экстракт гидролизовали 2 N раствором хлористоводородной кислоты 2 часа на водяной бане. После охлаждения гидролизат пропускали через фильтр Шотта с диаметром пор 16 мкм.
Условия хроматографирования: для выполнения анализа использовали хроматограф Agilent 1200, оборудованный детектором на основе диодной матрицы. Разделение смеси проводили на колонке Zorbaz Eclipse XDB-C18 (150*4,6 мм, размер зерна 5 мкм), оснащенной пред-колонкой Zorbax SB-C18 (4,6*12,5 мм, размер зерна 5 мкм), применив градиентный режим элюирования. В подвижной фазе содержание метанола в водном растворе ортофосфорной кислоты (0,1 %) изменялось от 50 до 52 % за 18 мин. Скорость потока элюента 1 мл/мин. Температура колонки 26°С. Объём вводимой пробы 20 мкл. Детектирование осуществляли при Х=370 нм. Для приготовления подвижных фаз использовали метиловый спирт (ос.ч.), ортофосфорную кислоту (ос.ч.), бидистиллированную деионизованную воду. Для приготовления стандартных образцов применяли стандарты флавоноидов производства фирмы «Sigma».
Научные публикации РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сопоставление времен удерживания сигналов веществ на хроматограммах анализируемых образцов со временем удержания сигналов стандартных образцов флавоноидов и анализ УФ-спектров позволили достоверно идентифицировать в обоих образцах кверцетин, квер-цетрин, кемпферол и изорамнетин. По величине пиков можно судить о том, что кверцетин значительно превалировал во всех образцах.
На рисунке 1 представлена типичная хроматограмма гидролизата этанольного экстракта сухой надземной массы воло-душки.
УФ спектры идентифицированных агликонов флавонолов и их формулы представлены на рисунках 2-5 [17].
Сезонную изменчивость содержания биофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот изучали на двух ценопопуляциях в 2010 году в фазах вегетации, бутонизации, цветения и плодоношения (рисунки 6, 7).
Как видно из рисунков 6, 7, в фенольном комплексе исследуемой надземной массы володушек золотистой и крупнолистой преобладали флавонолы, содержание которых различалось по фазам развития. Максимальное накопление последних достигалось в фазу вегетации: до 4352 мг% для володушки золотистой и до 1178 мг% для володушки крупнолистной.
Для володушки золотистой было характерно постепенное равномерное накопление антоциановых пигментов с максимумом в фазу созревания семян (3679 мг%). В отличие от володушки золотистой антоциановые пигменты володушки крупнолистной накапливались неравномерно с максимумом в фазу плодообразования (819 мг%) и полным отсутствием в фазы цветения и созревания семян.
Были отмечены характерные особенности в изменении содержания катехинов володушки золотистой от фазы вегетации к фазе созревания семян. Количество кате-хинов соответственно уменьшалось от 533 мг% до 338 мг%. Такая же закономерность наблюдалась и у фенолкарбоновых кислот - от 1409 до 528 мг%. Максимальная сумма биофлавоноидов для володушки золотистой, отражающая все текущие тенденции, составила 5538 мг% в фазу созревания семян (см. рисунок 6).
Рисунок 1 - Типичная хроматограмма гидролизата этанольного экстракта сухой
надземной массы володушки.
На хроматограмме обозначены агликоны флавонолов: кверцетрин (Rt = 4,977 мин), кверцетин (Rt = 7,34 мин), кемпферол (Rt = 12,509 мин), изорамнетин (Rt = 14,007 мин)
Рисунок 2 - У Ф-спектр и структурная формула кверцетрина Спектр поглощения этанольного раствора кверцетрина характеризуется ?макс = 260 и 362 нм.
Рисунок 3 - У Ф-спектр и структурная формула кверцетина Спектр поглощения этанольного раствора кверцетина характеризуется Хмакс =257 и 375 нм.
Рисунок 4 - У Ф-спектр и структурная формула кемпферола
Спектр поглощения этанольного раствора кемпферола характеризуется полосами в УФ-области спектра с ^макс = 218, 253, 266, 294, 322, 367 нм.
Рисунок 5 - УФ-спектр и структурная формула изорамнетина
Спектр поглощения этанольного раствора изорамнетина характеризуется полосами в УФ-области спектра с ^макс = 253, 370 нм.
вегетация, мг%
бутонизация, мг%
цветение, мг%
пл од ообразов ание, мг%
созревание семян, мг%
□ сумма антоциановых пигментов
л катехинві
□ сумма биофпавоноидов
Ш фенол карбонов віє кислоты
Рисунок 6 - Содержание фенольных соединений в сухой надземной массе володушки
золотистои, в мг%
□ сумма антоциановых пигментов
вегетация, мг%
бутонизация, мг% 570
цветение, мг%
плодообразов ание, мг%
819
созревание семян, 0
J катехины
397
0
□ флавонолы
979
266
□ сумма биофлавоноидов
□ фенолкарбоновые кислоты
2290
1044
1948
966
1033
765
2195
564
266
294
0
Рисунок 7 - Содержание фенольных соединений в сухой надземной массе володушки
крупнолистной, в мг%
В образцах володушки крупнолистной катехины также плавно расходовались и в фазе созревания семян полностью отсутствовали. Фенолкарбоновые кислоты от максимума в фазу вегетации (1044 мг%) заметно уменьшились к фазе созревания семян (294 мг%). Эти тенденции отразились на суммарном количестве биофлавоноидов, с плавным и волнообразным переходом от фазы к фазе, проявляя тем самым своеобразие накопления веществ вторичного синтеза в процессе вегетации.
Таким образом, изучение особенностей образования и накопления биофлаво-ноидов и фенолкарбоновых кислот у растений володушек в течение вегетационного периода позволило установить, что эти особенности носят закономерный характер, тесно связанный с фазами развития в условиях произрастания.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методом ВЭЖХ был изучен состав агликонов флавоноидов в образцах воло-душки золотистой и володушки крупнолистной, выращенных в коллекционном питомнике лаборатории биоразнообразия растительных ресурсов ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси», и установлен типичный «флавоноидный профиль» для этого вида.
Определено, что в володушках золотистой и крупнолистной содержатся значительные количества биофлавоноидов (до 5538 и 2290 мг%, соответственно) и фенолкарбоновых кислот (до 1409 и 1044
мг%, соответственно). Содержание этих веществ в значительной степени определяется вегетационным периодом. Самый высокий уровень накопления биофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот наблюдался в фазах вегетации и созревания семян.
Оба образца володушки, выращенные в коллекционном питомнике лаборатории биоразнообразия растительных ресурсов ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси», характеризуются высоким содержанием биофлавоноидов и фенолкар-боновых кислот. С учетом высоких интро-дукционных показателей, а также острой потребности белорусского рынка в создании принципиально новых отечественных импортозамещающих лекарственных средств на основе растительного сырья для лечения заболеваний различного генезиса, данные образцы, безусловно, представляют интерес в качестве перспективного источника био-флавоноидов и фенолкарбоновых кислот как для традиционных, так и качественно новых лекарственных средств.
SUMMARY
N.M. Birykova, A. M. Ostrovskaya,
V. G. Sokolov, L.V. Kukhareva,
V.A. Ignatenko, T.V. Gil THE INVESTIGATION OF FLAVONOIDS' AND PHENOLCARBONIC ACIDS' CONTENT AND COMPOSITION OF BUPLEURUM L., CULTIVATED IN BELARUS
The results of the study of bioflavonoids’ and phenolcarbonic acids’ content and com-
position in samples of medicinal plant raw material Bupleurum L. cultivated in the collection nursery of the Central Botanical Garden of NAS of Belarus as well as seasonal variation of these components are given. Fla-vonol aglycons composition has been identified by HPLS method. High content of bioflavonoids and phenolcarbonic acids has been determined by the methods of spectzopho-tometry and paper chromatography. These samples can be regarded as a challenging raw material for the development of new domestic drugs.
Keywords: Bupleurum L., Bupleurum aureum Fisch., Bupleurum rotungifolium L., flavonoids, quercetin, kaempferol, phenolcar-bonic acids, HPLC.
ЛИТЕРАТУРА
1. Семенов, A.A. Очерк химии природных соединений / А.А. Семенов. - Новосибирск: Наука, 2000. - 365 с.
2. Костюк, В.А. Биорадикалы и биоантиоксиданты / В.А. Костюк, А.И. Потапович.
- Минск: БГУ, 2004. - 179 с.
3. Pan, Sheng-Li. Bupleurum species. Scientific evaluation and clinical applications / Sheng-Li Pan. - FL, USA: Taylor & Francis Group, 2006. - 257 p.
4. Минаева, В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование / В.Г. Минаева. - Новосибирск: Наука, 1978. - 256 с.
5. Mori, K. Effect of Hochu-ekki-to (TJ-41), a Japanese herbal medicine, on the survival of mice infected with influenza virus / K. Mori, T. Kido, H. Daikuhara et al // Antiviral Research. - 1999. - V. 44. - №2. - P. 103111.
6. Гаман, A.B. Определение противоопухолевой активности препаратов растительного происхождения / А.В. Гаман, К.В. Яременко // Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока: Тез. докл. Всес. конф. СО АМН СССР, Новосибирск, 18-20 октября 1983 г. / Новосибирск: Наука, 1983. - С. 179-181.
7. Влияние водных извлечений из лекарственных растений на процессы свободнорадикального окисления / М.А. Рыжикова [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1999. - Т. 62(2). - С. 36-38.
8. Полифенольные и тритерпеновые соединения нового желчегонного препарата
пекворина / П.Е. Кривенчук [и др.]; // Материалы III Всероссийского съезда фармакологов / Свердловск, 1975. - С. 301-302.
9. Bermejo, P. Antiviral activity of seven iridoids, three saikosaponins and one phenylpropanoid glycoside extracted from Bupleurum rigidum and Scrophularia scorodonia / P. Bermejo, M.J.Abad, Am. Diaz et al. // Planta Med. - 2002. - Vol. 68(2). - P. 106-110.
10. Swain, T. The phenolic constituents of Prunus Domenstica. 1. The quantitative analysis of phenolic constituents / T. Swain, W. Hillis // J.Sci. Food Agric. - 1959. - Vol. 10(1). - P. 63-68.
11. Скорикова, Ю. Г. Методика определения антоцианов в плодах и ягодах / Ю. Г. Скорикова, Э.А. Шафтан // Тр. 3 Всесоюз. семинара по биологически активным (лечебным) веществам плодов и ягод, 27-30 марта 1966 г. / Свердловск: Уральский лесотехнический ин-т., 1968. - С. 451-461.
12. Запрометов, М.Н. Биохимия катехинов / М.Н. Запрометов. - М.: Наука, 1964. -325 с.
13. Сарапуу, Л. Фенольные соединения яблони / Л. Сарапуу, Х. Мийдла // Уч. зап. Тарт. гос.ун-та, 1971. - Вып.256. - С.111-113.
14. Шапиро, Д.К. Определение флаво-нолов в черноплодной рябине и других окрашенных плодах / Д.К. Шапиро, Л.Э. Дашкевич, Т.В. Довнар // Интродукция растений и зеленое строительства / Ред. Смольский Н.В. - Минск, 1974. - С. 209213.
15. Мжаванадзе, В.В. Количественное определение хлорогеновой кислоты в листьях черники кавказской (V. arctostaphylos L.) / В.В. Мжаванадзе, И.Л. Таргамадзе, Л.И. Драник // Сообщ. АН Груз ССР. 1971.
- Т. 63. - вып. 1. - С. 205-210.
16. Васильева, М.С. Хроматографическое исследование содержания и состава флаво-ноидов змеевика лекарственного Bistorta Officinalis Delabre, произрастающего в Сибири / М.С. Васильева, Г.И. Высочина // Растительный мир Азиатской России. -2010. - Т. 5(1). - С. 87-94.
17. Клышев, Л.К. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследований) / Л.К. Клышев, В.А. Бандюкова, Л.С. Алюкина.
- Алма-Ата: Наука, 1978. - 218с.
18. Государственная фармакопея Республики Беларусь. В 3 т. Т.2. Контроль ка-
чества вспомогательных веществ и лекарственного растительного сырья / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»; под общ. ред. А.А. Шеряко-ва. - Молодечно: «Типография «Победа», 2008. - С. 385.
Адрес для корреспонденции:
220030, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Ленинградская, д.14, к. 710, Учреждение Белорусского государственного университета «Научно-исследовательский институт физико-химических проблем»
(НИИ ФХП БГУ)
тел. (служебный): (017)-226-56-43,
E-mail: sektormed@bsu. by,
Бирюкова Н.М.
Поступила 27.09.2011 г.
