CC BY
25
УДК 579.6:663.18
Сальникова А.Г., Хромова Н.Ю., Кареткин Б.А., Гордиенко М.Г., Шакир И.В., Панфилов В.И.
ИССЛЕДОВАНИЕ РОСТОВЫХ И КРИОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ ГИДРОЛИЗАТА ПШЕНИЧНОЙ МУКИ ПРИ ФЕРМЕНТАЦИИ И ЛИОФИЛЬНОМ ВЫСУШИВАНИИ БИФИДОБАКТЕРИЙ
Сальникова Анна Геннадьевна, студент 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; e-mail: anutkasalnikovamz@rambler.ru
Хромова Наталья Юрьевна, аспирант, ведущий инженер кафедры биотехнологии Кареткин Борис Алексеевич, к.т.н., младший научный сотрудник кафедры биотехнологии Гордиенко Мария Геннадьевна, к.т.н., в.н.с. НИЧ РХТУ им. Д.И. Менделеева Шакир Ирина Васильевна, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии Панфилов Виктор Иванович, д.т.н., профессор, заведующий кафедрой биотехнологии Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
В работе исследована кинетика роста штамма бифидобактерий B. adolescentis ATCC 15703 на экспериментальной среде, содержащей в качестве основного источника пептидов панкреатический гидролизат пшеничной муки, показана их высокая продуктивность (3,0*109 КОЕ/мл). Установлено, что использование гидролизата в качестве защитной среды для лиофильного высушивания культуры бифидобактерий позволяет обеспечить высокую степень сохранения жизнеспособности клеток в лиофилизате (90%). Гибель лиофилизированных клеток в ходе длительного хранения не превышает 10%.
Ключевые слова: зерновое сырье, ферментативный гидролиз, бифидобактерии, лиофильная сушка, криопротекторы.
INVESTIGATION OF THE GROWTH AND CRYOPROTECTIVE PROPERTIES OF WHEAT FLOUR HYDROLYSATE DURING FERMENTATION PROCESS AND FREEZE-DRYING OF BIFIDOBACTERIA
Salnikova A.G., Khromova N.Yu., Karetkin B.A., Gordienko M.G., Shakir I.V., Panfilov V.I. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
The growth kinetics of B. adolescentis ATCC 15703 strain in an experimental medium containing a pancreatic hydrolysate of wheat flour as the main protein source was shown. Also, the high productivity (3.0*109 CFU/mL) of B. adolescentis ATCC 15703 strain was shown. It has been found that the use of the hydrolysate as a freeze-drying protector of bifidobacterium culture allows to obtain high viable cells count in the lyophilizate. The number of survived cells was 90%. The death of cells does not exceed 10% during long-term storage.
Keywords: grain raw materials, enzymatic hydrolysis, Bifidobacterium, freeze-drying, cryoprotectants
coli, а также Bacillus, Saccharomyces, Streptococcus. Бифидобактерии составляют основную часть нормофлоры человека и широко применяются при производстве пробиотиков [5].
Эффективность пробиотического продукта зависит от вида входящих в него микроорганизмов, а также от его формы. Так, известно, что сухие препараты имеют значительно больший срок хранения, чем суспензии [6]. Однако процесс высушивания может повлечь за собой повреждение и гибель клеток. Поэтому для получения пробиотических культур обычно применяют лиофильную сушку [7]. Процесс включает в себя заморозку суспензии и последующую возгонку влаги под вакуумом [8]. Высушивание проводится в два этапа: первичная сушка осуществляется для удаления кристаллов льда, которые могут повредить клетки, вторичная - для дальнейшего обезвоживания замороженной суспензии [7].
Большая часть инактивируемых в процессе лиофильного высушивания клеток теряет жизнеспособность во время заморозки, а не при
Введение
Издавна было известно, что некоторые продукты способны приносить значительную пользу здоровью человека. Однако, научные исследования по выявлению связи между питанием и его воздействием на здоровье, начатые еще Ильей Ильичом Мечниковым, приобрели широкое распространение лишь в середине XX века [1]. Сам термин «функциональные продукты питания» был впервые введен в обращение в 1993 году [2]. Такие продукты обогащаются витаминами, ценными пищевыми веществами, пробиотиками и другими компонентами, оказывающими благоприятное воздействие на здоровье человека и, в то же время, препятствующими возникновению и развитию тех или иных заболеваний [3]. Пробиотики предназначены для поддержания состава и активности нормальной микрофлоры кишечника [4]. Основными пробиотическими культурами являются представители родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, некоторые штаммы вида Escherichia
высушивании [8]. Использование криопротекторов позволяет повысить эффективность процесса, так как делает возможным достаточно интенсивное проведение лиофилизации при сохранении жизнеспособности клеток [9]. Часто в качестве криопротектора используют обезжиренное молоко или его компоненты (сывороточный белок, лактозу), углеводы (глюкозу, трегалозу, сахарозу, декстраны, крахмал), глицерин [8-10]. Криопротекторное действие углеводов заключается в повышении температуры стеклования содержимого клетки, из-за чего клетка переходит в стеклообразное состояние до формирования кристалликов льда, которые могли бы разорвать клеточную мембрану [10].
Цель настоящей работы заключалась в изучении ростовых характеристик бифидобактерий
Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 на питательной среде, содержащей в качестве основного источника азота белковый гидролизат пшеничной муки, и возможности его использования для лиофильного высушивания культуры в виде защитной среды.
Материалы и методы
В качестве исходного сырья использовали пшеничную муку высшего сорта состава (на 100 г): белки - 10,3 г, жиры - 1,1 г, углеводы - 69,0 г. Ферментативный гидролиз проводили ферментным препаратом панкреатин (Pancreac), обладающим протеолитической и амилолитической активностью, при оптимальных условиях pH 8.0, T = 40 °C, т = 2 часа в количестве 2 % от содержания белка в муке, гидромодуль 5,43. Полученный гидролизат центрифугировали в течение 10 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали в качестве основы для приготовления питательных сред для культивирования бифидобактерий.
В качестве микробного объекта был выбран штамм Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703. Глубинное периодическое культивирование микроорганизмов проводили с постоянным перемешиванием и поддержанием pH в биореакторе при температуре 37°С в течение 30 ч на питательной среде на основе ферментолизата пшеничной муки, используемого в качестве источника азота, с добавлением дополнительных компонентов: глюкозы - 10 г/л; дрожжевого экстракта - 5 г/л; хлорида натрия - 2,5 г/л; L-цистеина - 0,5 г/л; сульфата магния - 0,5 г/л; аскорбиновой кислоты -0,5 г/л; натрия уксуснокислого - 0,3 г/л; pH 6,8-7,2. В процессе ферментации проводилась подтитровка 25% водным раствором аммиака.
Культуральную жидкость, содержащую биомассу бифидобактерий, центрифугировали при 6000 g, ресуспендировали со стерильным 0.9 %-ным раствором NaCl в буфере до У исходного объема и смешивали со стерильными защитными средами (обезжиренное молоко или гидролизат пшеничной муки, полученный при обработке панкреатином) в соотношении 1:1 для лиофильной сушки. Сушка проводилась в аппарате CoolSafe 110 (ScanLaf,
Дания). Полученные лиофилизаты хранили при температуре от +3 до +6 °С.
Определение количества жизнеспособных клеток бифидобактерий (КОЕ/г) проводили методом последовательных десятикратных разведений в полуагаризованную «Бифидум-среду».
Результаты и их обсуждение
На первом этапе для получения биомассы пробиотических микроорганизмов было проведено культивирование бифидобактерий В. adolescentis на экспериментальной питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат муки в качестве единственного источника азота, в условиях поддержания рН в биореакторе (кривые роста и потребления субстрата приведены на рисунке 1).
Рис. 1. Кривые роста и потребления субстрата культуры B. adolescentis
По результатам культивирования были определены характеристики роста культуры: продолжительность лаг-фазы составляла около 5 часов, максимальная удельная скорость роста в процессе ферментации достигала 0,53 ч-1, стационарная фаза роста наступала на 27 час культивирования. Конечный титр клеток составлял 3х10у КОЕ/мл, что позволяет предположить, что ростовые свойства экспериментальной среды идентичны ростовым свойствам стандартной среды MRS.
На следующем этапе культуральную суспензию подвергали сублимационной сушке. Для лиофильного высушивания биомассы B. adolescentis в качестве защитных сред использовали обезжиренное молоко (стандарт) и гидролизат пшеничной муки, содержащий крахмал. Известно, что молочный белок предотвращает повреждение клеток путем стабилизации клеточной мембраны, а кальций, содержащийся в молоке, повышает выживаемость бактерий после дегидратации [9]. С другой стороны, ферментолизат пшеничной муки содержит в составе пептиды, крахмал и декстрины, а также пребиотические вещества (ксилоолигосахариды), которые тоже являются хорошими протекторами и могут способствовать выживаемости культуры. Данные о выживаемости бифидобактерий в процессе лиофилизации представлены в таблице 1.
Таблица 1. Количество жизнеспособных клеток и показатель выживаемости штамма B. adolescentis, лиофилизированного с различными защитными средами
Криопротектор Количество жизнеспособных клеток (КОЕ) на 400 и 200 мл исходной суспензии Выживаемость, % Количество жизнеспособных клеток после высушивания, КОЕ/г
до высушивания после высушивания
- 1,2х1012 3,2х1011 26,8 2,30х1010
Обезжиренное молоко 6,0х1011 5,6х1011 93,3 1,24х1010
Гидролизат пшеничной муки 6,0х1011 5,4х1011 90,0 1,00х1010
Из результатов видно, что показатель выживаемости бифидобактерий в процессе высушивания при использовании гидролизата в качестве криопротектора идентичен показателю выживаемости при использовании модельного криопротектора (обезжиренного молока) и составлял около 90 %. Показатель же выживаемости при сушке культуральной жидкости без добавления криопротекторов был достаточно низким.
На третьем этапе исследовали стабильность численности бифидобактерий при длительном хранении полученных лиофилизатов (рис. 2).
Рис. 2. Зависимость отношения ^(КОЕ/г) в момент времени т (недели) к ^(КОЕ/г) в начальный момент времени от времени т (недели)
Было обнаружено, что потеря жизнеспособности биомассы в лиофилизате с гидролизатом муки происходит не быстрее, чем в лиофилизате с обезжиренным молоком и не превышает 10%.
Выводы
1. Установлено, что использование гидролизата пшеничной муки высшего сорта в качестве единственного источника азота для культивирования бифидобактерий позволяет получить высокий титр жизнеспособных клеток 3х109 КОЕ/мл.
2. Применение гидролизата пшеничной муки, полученного обработкой панкреатином, в качестве защитной среды для лиофильного высушивания культуры позволяет получить выживаемость
бифидобактерий не менее 90%, что подтверждает его высокие криопротекторные свойства.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 16-19-10469.
Список литературы
1. Mellentin J., Heasman M. The functional foods revolution: Healthy people, healthy profits. - Routledge,
2014.
2. Swinbanks D. Japan explores the boundary between food and medicine //Nature. - 1993. - Т. 364. -С. 180.
3. Горева Е. А., Петренко А. В. Пребиотики как функциональные компоненты питания //Непрерывное медицинское образование и наука. -
2015. - Т. 10. - №. 1. - С. 32-36.
4. Ардатская М. Д. Пробиотики, пребиотики и метабиотики в коррекции микроэкологических нарушений кишечника //Медицинский совет. - 2015. - №. 13.
5. Янковский Д. С., Дымент Г. С. Бифидобактерии и лактобациллы как оптимальная основа современных пробиотиков //Современная педиатрия. - 2006. - Т. 3. - №. 12. - С. 1-10.
6. Гордиенко П. А. и др. Научное обоснование создания новых лекарственных форм пробиотиков (обзор литературы и результаты собственных экспериментов) //Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2015. - Т. 32. - №. 22 (219).
7. Iaconelli C. et al. Drying process strongly affects probiotics viability and functionalities //Journal of biotechnology. - 2015. - Т. 214. - С. 17-26.
8. Wang L. et al. Cryoprotectant choice and analyze of freeze-drying drug suspension of nanoparticles with functional stabilizers //Journal of microencapsulation. - 2018. - №. just-accepted. - С. 126.
9. Несчисляев В. А. и др. Повышение эффективности процесса лиофилизации в технологии пробиотиков //Фундаментальные исследования. - 2007. - №. 12-2. - С. 369-370.
10. Meng X. C. et al. Anhydrobiotics: The challenges of drying probiotic cultures //Food Chemistry. - 2008. - Т. 106. - №. 4. - С. 1406-1416.
