CC BY
137
УДК 615.277.3
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ОБРАЗОВАНИЯ КОНЪЮГАТОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВАКЦИННЫХ КОНСТРУКЦИЙ
Екатерина Александровна ВОЛОСНИКОВА
ФБУН ИМБТ ГНЦ ВБ Вектор
633010, Новосибирская обл., г. Бердск, а/я 112
Исследован процесс образования конъюгатов антигенов с полимерным носителем с целью повышения их иммуногенности. Получаемые конъюгаты предназначались для создания иммуногенов в виде вирусоподобных частиц. Поэтому они содержали кроме белка-антигена и декстрана спермидин для ионной связи молекул конъюгата с центральной нуклеиновой кислотой. Показано, что варьируя количество образующихся активных групп при активации полимера, длительность реакций конъюгирования и последовательность внесения компонентов, можно получать конъюгаты с заранее заданными свойствами.
Ключевые слова: иммуногенность, конъюгат, полимеры, гель-фильтрация, окислитель.
Известно, что существенной проблемой при создании вакцин нередко является слабая иммуногенность антигенов. Одним из способов ее решения может быть конъюгирование антигенов с полимерными носителями (пегилирова-ние и др.) или создание искусственных иммуногенов. С этой точки зрения большой интерес представляют конструкции, имитирующие структуру патогена. Как известно, в вирусах нуклеиновая кислота окружена капсидной оболочкой, состоящей из белков. Ранее Л.Р. Лебедевым с соавторами [1] была предложена структура молекулярной конструкции, так называемой вирусоподобной частицы, которая может быть использована для транспортировки и представления как белковых антигенов, так и ДНК-вак-цин. Ключевым моментом при сборке такой конструкции является формирование за счет ионных сил связи полимерной полисахаридной матрицы, конъюгированной с молекулами белков-антигенов, с центральной нуклеиновой кислотой, для чего необходимо придать молекулам матрицы положительный заряд.
В связи с этим целью данной работы являлся подбор количественных соотношений и исследование условий проведения процесса конъюгирования компонентов конструкции: де-кстрана, белка и небольших положительно заряженных молекул спермидина.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Белок-антиген представлял собой рекомбинантный белок TBI с молекулярной массой 21000 ± 1000 Да, искусственный Т- и В-кле-точный иммуноген ВИЧ [2, 3], полученный из E. coli JM-103/pTBI. Очистку белка проводили хроматографическими методами [4].
В качестве полимерной матрицы был выбран биодеградируемый полимер - декстран с молекулярной массой 60000 Да (полиглюкин). Для придания молекуле конъюгата положительного заряда использовали спермидин (Sigma), молекулярная масса 145 Да. В качестве центральной нуклеиновой кислоты при получении частиц использовали дрожжевую двуспиральную кислоту (дсРНК) (ООО «Диафарм», г. Бердск), полученную из киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y 448.
Для получения конъюгатов использовали реакцию Малапрада (М. р.) [5], которую проводили при комнатной температуре (+20 -+25 °С). Растворы декстрана и периодата натрия смешивали в соотношении 1 : 25 (моль/моль). Через выбранные промежутки времени аликвоты раствора подвергали гель-фильтрации на сефадексе G-25 и к активированному декстра-ну добавляли спермидин либо антиген - белок TBI. О полноте прохождения реакции судили, интерпретируя результаты, полученные с помощью методов гель-фильтрации (на колонке с се-
Волосникова Е.А. - аспирант БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 31, № 6, 2011
фадексом G-150) и денситометрически с помощью электрофореза (в 12%-м полиакриламидном геле в денатурирующих условиях) [6, 7]. Показатель полноты реакции (%) определяли как отношение количества спермидина/белка в составе конъюгата к исходному содержанию компонентов в реакционной смеси.
Результаты указаны в виде среднего арифметического и его стандартного отклонения. Достоверность различий определяли с использованием критерия Манна-Уитни и считали статистически значимыми при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В связи с тем, что молекулы белков содержат не одну реакционноспособную аминогруппу, возникает вероятность при избыточной степени окисления декстрана в реакции конъюги-рования получить вместо отдельных молекул конъюгата поперечно сшитый гель. Поэтому для получения несвязанных между собой молекул конъюгатов реакцию конъюгирования проводили при ограниченной степени окисления матрицы.
Было изучено действие основных факторов, оказывающих влияние на процесс образования конъюгатов.
Влияние времени инкубации окислителя с декстраном на последующее образование конъюгатов. Конъюгаты синтезировали, как описано в разделе «Материал и методы».
О протекании реакции окисления судили по полноте вхождения компонентов в конъюгат. Результаты гель-фильтрации показали, что пос-
Рис. 1. Степень включения спермидина в состав конъюгатов декстран—спермидин в зависимости от длительности активации декстрана
ле 15-минутной активации декстрана количество спермидина, вступившего в реакцию, почти в 2 раза меньше, чем при инкубации смеси в течение 30 и 60 мин (рис. 1). Аналогичные результаты были получены в реакции конъюгиро-вания декстрана с белком. После 150-минутной активации декстрана пик образующихся впоследствии конъюгатов на электрофореграмме был гетерогенным (размытым), что может свидетельствовать о частичном разрушении конъюгата. То есть оптимальная длительность активации декстрана для последующего включения молекул белка и спермидина в состав конъюгата составляет 30-60 мин, при этом уровень включения компонентов в конъюгат близок к 100 %.
Влияние соотношения концентраций пе-риодата натрия и декстрана при активации на скорость реакции и характеристики получаемых конъюгатов. Эксперименты по получению конъюгатов проводили по аналогичной схеме. Растворы декстрана и периодата натрия смешивали в соотношении на 1 моль полимера - 5, 10, 20, 40, 80 моль окислителя. Смесь инкубировали в течение 60 мин.
На рис. 2 представлена электрофореграмма состава реакционной смеси после проведения реакции конъюгирования декстрана с белком TBI.
Видно, что при соотношениях окисли-тель/декстран (моль/моль) ниже значений 1 : 5 и 1 : 10 последующее образование конъюгатов декстран-TBI происходит в низких количествах. Полнота реакции (более 95 %) достигалась при соотношении окислитель/декстран 1 : 20 и выше. Аналогичные закономерности были обнаружены при анализе конъюгатов декстран-спермидин. При меньшей степени окисления образование конъюгата декстрана со спермиди-ном шло более активно, чем с белком. Возможно, это связано с большей доступностью активированных групп декстрана для спермидина, по сравнению с молекулами белка. Дело в том, что, как показывают теоретические расчеты с учетом молекулярных масс компонентов, активированных мономеров декстрана на поверхности глобулы в доступном для реакции сте-рическом состоянии (среднестатистически) для белка TBI может находиться лишь 1 из 10-12, а для спермидина - 10 из 10-12 [1].
Влияние длительности реакции конъюги-рования на характеристики конъюгатов. Конъюгаты готовили, как описано в разделе «Материал и методы». Растворы декстрана и периодата натрия смешивали в соотношении на 1 моль полимера - 20 моль периодата и инку-
М 1 2 3 4 5 6
66 000-
36 000-
- Конъюгат
- Белок ТВ1
Рис. 2. Электрофореграмма образцов конъюгатов декстран-ТВ1 в 12%-м полиакриламидном геле. М — белки-маркеры (14400 — 66000 Да); 1 — белок ТВ1 (контроль); 2, 3, 4, 5, 6 — образцы, полученные при соотношении окислитель/декстран 1 : 5, 1: 10, 1: 20, 1: 40 и 1: 80 соответственно
бировали в течение 60 мин. К активированному декстрану добавляли белок и спермидин в соотношении на 1 молекулу декстрана - 1 молекула белка ТВІ/ 10 молекул спермидина.
Данные, представленные на рис. 3, свидетельствуют о том, что практически полное включение спермидина в конъюгат при использованном соотношении компонентов достигается через 80-120 мин от начала реакции, белка - через 120-160 мин.
Образование конъюгатов спермидина с де-кстраном происходит быстрее, чем декстрана с белком и, следовательно, при одновременном внесении компонентов на выходе реакции следует ожидать преимущественно молекулы конъюгата декстрана со спермидином. Поэтому для получения конъюгата с заданными соотношениями (на 1 молекулу декстрана - 1 молекула белка и 10 молекул спермидина) была предложена следующая схема: после активации полимера и удаления окислителя к нему добавляли белок (1 моль/1 моль), инкубировали 120 мин, после этого вносили спермидин (10 моль/1 моль) и продолжали инкубацию еще 120 мин.
100-1
0х
80-
60-
40-
8 В
К 204
пи.
10 40 80 120
Время инкубации, мин
160 240
Рис. 3. Динамика образования конъюгатов спермидина (серые столбики) и ТВ1 (черные столбики) с декстраном в зависимости от длительности конъюгирования
Влияние количества спермидина, введенного в состав конъюгата, на его способность образовывать вирусоподобные частицы с нуклеиновыми кислотами. Конъюгаты готовили, как описано в разделе «Материал и методы». Растворы декстрана (полиглюкина) и периода-та натрия смешивали в молярном соотношении 1/20 и инкубировали в течение 60 мин. К раствору активированного полиглюкина добавляли белок ТВ1 в соотношении 1 моль декстрана:
1 моль ТВ1, и после 120 мин инкубации - раствор спермидина в соотношении на 1 моль полимера - 3, 10 или 50 моль спермидина, инкубировали 120 мин.
Анализ конъюгатов методом гель-фильтрации на сефадексе 0-150 показал, что при увеличении количества спермидина, введенного в конъюгат, более 50 молекул на молекулу поли-глюкина молекулярная масса конъюгата сдвигается в низкомолекулярную область. Это, вероятно, является следствием разрывов молекул декстрана.
Полученные конъюгаты были исследованы на способность образовывать вирусоподобные частицы с дсРНК.
На электрофореграмме (рис. 4) видно, что комплексы, образованные двуспиральной РНК (в виде Ь- и М-форм), покрытой конъюгатом полиглюкин-спермидин, имеют заметно меньшую подвижность, чем дсРНК, в том случае, если молярное соотношение спермидин/поли-глюкин в конъюгатах было выше 10:1. Это можно объяснить увеличением молекулярной массы дсРНК в результате образования комплекса и тем, что положительно заряженный спермидин частично нейтрализует в комплексе отрицательный заряд РНК.
Факт сборки вирусоподобных частиц, полученных с использованием конъюгатов в молярном соотношении спермидин и полиглюкин 10/1, подтвержден электронно-микроскопичес-
к 1 2 3 к
Рис. 4. Электрофореграмма препаратов вирусоподобных частиц, полученных при молярных соотношениях спермидин/полиглюкин: 1—3 : 1; 2 — 10: 1; 3 — 50: 1; к — исходная дсРНК
ким исследованием, в ходе которого показано, что полученные вирусоподобные частицы имели шарообразный вид с размерами 25-40 нм [1, 8].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Показано, что оптимальное время активации полисахаридной матрицы (инкубации окислителя с декстраном) для последующего образования конъюгатов составляет 30-60 мин, оптимальное соотношение концентраций компонентов - 1 : 20 (моль/моль).
2. Для образования вирусоподобных частиц с дсРНК соотношение спермидина и декстрана в конъюгате должно быть не менее 10 : 1.
3. Установлен порядок внесения компонентов в реакционную смесь для получения конъюгатов заданного состава (на одну молекулу полиглюкина - одна молекула белка ТВІ и 10 молекул спермидина). Показано, что для этого необходимо первоначально к активированной матрице добавлять белок, после 120 мин инкубации вносить спермидин, продолжая инкубацию реакционной смеси еще 120 мин.
Таким образом, установлено, что варьируя количество образующихся активных групп при активации полимера, длительность реакций конъюгирования с компонентами и последовательность внесения последних, можно получать
конъюгаты полисахаридов с белками-антигенами с заранее заданными свойствами.
БЛАГОДАРНОСТИ
Выражаю благодарность за постоянную помощь в работе научному руководителю д.м.н. Л.Р. Лебедеву
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Лебедев Л.Р., Гилева И.П., Карпенко Л.И., Ерошкин А.М. Конструирование оригинальных искусственных иммуногенов - кандидатов в вакцины против HIV-I // Молек. генетика, микробиол. вирусол. 2000. (3). 36-40.
Lebedev L.R., Gileva I.P., Karpenko L.I., Erosh-kin A.M., Construction of original artificial immunogens - candidates for a vaccine against HIV-I // Molek. genetika, mikrobiol. virusol. 2000. (3). 3640.
2. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P. et al. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine // Protein Eng. 1995. 8. (2). 167-173.
3. Ерошкин А.М., Жилкин П.А., Шамин В.В. Новый подход к разработке вакцины против ВИЧ-1, основанный на искусственных белках с предсказанной третичной структурой // Молек. биол. 1993. 27. (3). 538-551.
Eroshkin A.M., Zhilkin P.A., Shamin V.V. A new approach to the development of a vaccine against HIV-1 based on artificial proteins with the predicted tertiary structure // Molek. biol. 1993. 27. (3). 538551.
4. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Акулова Н. И. Очистка рекомбинантного белка TBI - антигена ВИЧ // Биотехнология. 2010. (4). 65-68.
Volosnikova E.A., Lebedev L.R., Akulova N.I. Purification of the recombinant TBI protein — HIV antigen // Biotechnologiya. 2010. (4). 65-68
5. http://www.ximicat.com/info.php?id=3292
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М., 1984.
Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning. М., 1984.
7. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. (227). 680-685.
8. Lebedev L.R., Karpenko L.I., Poryvaeva V.A. et al. Construction of virus-like particles exposing HIV-I epitops // Mol. Biol. 2000. 34. (3). 413-417.
THE STUDY OF THE PROCESS OF FORMING CONJUGATES TO CREATE VACCINE CONSTRUCTS
Eсatherine Alexandrovna VOLOSNIKOVA
FSRI SRC VB Vector IMBT 633010, Novosibirsk Region, Berdsk
The process of forming antigens-polymeric carrier conjugates has been studied to improve their immunogenicity. These conjugates were used to create immunogens in the form of virus-like particles. In addition to protein-antigen and dextran, they contained spermidine to form ionic bonds of the conjugate molecules with the central nucleic acid. It has been shown that it is possible to create conjugates with predetermined properties by varying the number of active groups during activation of the polymer, the duration of the conjugation reactions and the sequence of adding the components.
Key words: immunogenicity. conjugated polymers, gel-filtration, oxidant.
Volosnikova E.A. - postgraduate student
