CC BY
197
ОБЗОРЫ ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ... 105
УДК 615.31 В.И. Масычева, А.О. Белкина ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СПЕРМИДИНА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Институт медицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора Контактная информация:
Масычева Валентина Ивановна, д-р биол. наук, профессор, директор института медицинской биотехнологии ФУГН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
адрес: 633010, Новосибирская область, г. Бердск-10, а/я 112; тел. +7(3841)-580-91 e-mail: masvcheva@ngs.ru
Статья поступила 28.09.2009, принята к печати 27.10.2009.
Резюме
При создании средств адресной доставки лекарств, нанопрепаратов и других биотерапевтических средств используются различные полимеры. Преимущество отдается тем, которые имеют эндогенное происхождение, биодеградируемы, малотоксичны, хорошо проникают в клетку. К таким полимерам относится биогенный полиамин спермидин. К настоящему времени накоплены сведения о роли спермидина в жизнедеятельности клетки, токсичности, о характере взаимодействия спермидина с нуклеиновыми кислотами, которые могут рассматриваться как обоснование для использования спермидина при конструировании биотерапевтических препаратов, для транспорта биологически активных веществ в клетки и ткани, в частности для стабилизации и доставки нуклеиновых кислот.
В обзоре представлены сведения о современных направлениях работ по конструированию и исследованию биопрепаратов, содержащих спермидин.
Ключевые слова: спермидин, биопрепараты, средства доставки лекарств, нанобиочастицы.
V. I. Masycheva, A.O. Belkina
THE PROSPECTS OF USING SPERMIDINE FOR CONSTRUCTION OF BIOPREPARATIONS
Institute of Medical Biotechnology, FSRI SRC VB “VECTOR”, Rospotrebnadsor
Abstract
Various polymers are used to develop vehicles for the addressed delivery of drugs, nanopreparations, and other biotherapeutic remedies. The preference should be given to those which have an endogenous origin, low toxicity, and high ability to penetrate into cells and to be biodegradable capacity. Biogenic polyamine, spermidine, possesses such properties. To date, a large amount of information is collected on the role of spermidine in cell viability, its toxicity, and the character of its interaction with nucleic acids. These data serve as the basis for the use of spermidine for designing the biotherapeutic preparations, for the delivery of biologically active compounds, in particular nucleic acids, into cells, and, for stabilization of nucleic acids.
The present review provides the information on the current status of the problem.
Key words: spermidine, nanoparticles, nanobiopreparations, drug delivery systems.
Введение
Недостаточная эффективность многих медицинских препаратов может быть обусловлена рядом причин, в том числе - особенностью проницаемости для них клеточной мембраны и гистогематических барьеров, быстрой деградацией активной молекулы в цитоплазме или доставкой ее в лизосомальный ком-партмент, специализирующийся на процессах деградации. Перспективным направлением по преодолению этих недостатков является создание комплексных препаратов, объединяющих биологически активное вещество с полимерами, и молекулярных векторных конструкций, включающих транспортное средство (липосо-мы, мицеллы, дендримеры, вирусоподобные частицы и др.) с активной биологической субстанцией. Это позволяет создать препараты с контролируемым высвобождением действующего начала, использовать значительно меньшие количества биологически активного вещества для получения специфического эффекта и/или получить многократно увеличенный специфический эффект, изменить фармакокинетические характеристики, уменьшить токсический эффект препаратов, а также защитить биологически активное вещество от биодеградации.
Успех создания препаратов нового поколения в значительной степени зависит от выбора веществ, обеспечивающих транспорт лекарственного средства. В настоящее время сформулированы основные требования, которым должны удовлетворять вещества, используемые для транспорта лекарств. К ним можно отнести эндогенное происхождение, способность к биодеградации и быстрому выведению из организма, обеспечение транспорта через мембраны и тканевые барьеры, возможность переноса малых молекул, пептидов, белков и нуклеиновых кислот, низкую токсичность, отсутствие отдаленных последствий и т.д. С другой стороны, при выборе транспортных молекул необходимо иметь сведения о путях синтеза, распада и выведения таких веществ из организма, о распределении по органам и тканям, наличии рецепторов и мишеней, об основных биологических свойствах. В совокупности эти данные позволят обеспечить целенаправленное создание лекарства с заданными свойствами. К веществам, удовлетворяющим этим требованиям, относится биогенный полиамин спермидин - природное соединение, содержащееся в тканях млекопитающих, в вирусах и микроорганизмах, во многих пищевых продуктах и обладающее рядом полезных биологических свойств.
В мире проводятся исследования его биологической активности - как в интересах фундаментальной науки, так и для оценки возможностей использования в медицине. Одним из перспективных направлений в фармацевтике является конструирование препаратов нуклеиновой природы, что находит отражение в разработке ДНК-содержащих средств для генной терапии, ДНК-вакцин, РНК-препаратов.
Большую роль в создании фармацевтических препаратов нуклеиновых кислот могут сыграть биогенные полиамины, в частности - спермидин, поскольку они являются хорошими переносчиками нуклеиновых кислот и других биологически активных (терапевтических) молекул в клетки.
Биохимические методы для определения содержания спермидина в препаратах, биологических жидкостях и тканях в настоящее время достаточно хорошо представлены, что значительно облегчает анализ препаратов, в состав которых входит сперми-дин, разработку документации на получение и контроль качества таких препаратов.
Эти данные могут рассматриваться как обоснование для использования спермидина для конструирования биотерапевтических препаратов, в том числе в качестве средства для транспорта биологически активных веществ, в частности - нуклеиновых кислот. Цель работы заключается в анализе накопленных сведений о молекулярно-биологических свойствах спермидина и подходах к его использованию при создании эффективных иммунобиологических препаратов.
Распространенность в биологических объектах
Биогенные полиамины широко распространены в природе. Они синтезируются многими микроорганизмами, вирусами, их обнаруживают во многих растительных и животных клетках [11; 21]. Предшественником спермидина является образующийся из аргинина орнитин. Орнитин под действием фермента орнитиндекарбоксилазы превращается в путресцин, из которого получается спермидин, являющийся предшественником спермина.
В клетках животных и человека спермидин находится во многих тканях в весьма заметных количествах. Спермидин и спермин локализованы в основном в ядре. Они входят в состав хроматина и участвуют в репликации ДНК, принимают участие в процессах пролиферации клеток и роста тканей, в регуляции синтеза белка. В сыворотке крови здоровых людей находится 2,5±0,3 нмоль/мл, в моче -4,5±0,16 нмоль/мл, в белом веществе головного мозга 20 нг/мг спермидина [7], в спинномозговой жидкости содержание спермидина равно 110-190 пмоль/мл [43]. Спермидин содержится в довольно значительных количествах во многих продуктах питания, ежедневно употребляемых человеком. В кофе, яйцах, фруктах, овощах, мясе, сахаре, и др. - до
0,02-4 мг и более спермидина на 100 г продукта. Ежедневно человек потребляет от 0,143 до 0,285 мг спермидина, что равно 0,25-0,50 мг спермидин три-хлорида [44]. В расщеплении спермина и спермидина участвует фермент диаминоксидаза (амилориди-наминоксидаза). Плазма крови резко снижает антибиотическое действие спермидина против бактерий за счет наличия в плазме крови сперминоксидазы.
Кроме того, в превращениях спермидина участвует ряд ферментов: ксантиндегидрогеназа, диа-минацетилтрансферазы-1 и -2, орнитиндекарбокси-лаза, сперминсинтаза, спермидинсинтаза [42]. Спер-мидин окисляется в 1,4-диаминобутан, который в заметных количествах экскретируется с мочой.
Взаимодействие спермидина с нуклеиновыми кислотами
Модуляция клеточных функций полиаминами хорошо изучена [21]. Полиамины играют существенную роль в росте клетки благодаря эффектам на уровне транскрипции и трансляции, модулируют функции ДНК, нуклеозидтрифосфатов, белков и особенно РНК. Они влияют на белковый синтез, стимулируя сборку 30S рибосомальных субъединиц, на деградацию и аминоацилирование РНК [19; 20; 22], фосфорилирование белков, на превращение B формы ДНК в Z-форму, на прогрессию клеточного цикла, апоптоз и функцию ионных каналов. Они обладают также способностью тормозить активность ряда ферментов - протеинкиназ, орнитиндекарбоксилазы [42]. Природные полиамины (путресцин, спермидин и спермин) способны к самосборке в стимулирующем физиологическом окружении в агрегаты, которые взаимодействуют с геномной ДНК и защищают ее от деградации нуклеазами [15].
Полиамины найдены, в основном, в виде полиамин-РНК комплексов (в печени крысы, лимфоцитах быка, в E. coli и др). Спермидин прочно связывается и с ДНК и может способствовать стабилизации ее двуспиральной структуры. С АТФ спермидин также образует комплексы [29]. Так, содержание связанного с ДНК, РНК, фосфолипидами и АТФ спермидина в лимфоцитах барана составляет 12,8 %; 57,2 %; 3,0 % и 12 %, а в клетках E. coli - 5,1 %; 89,7 %; 0,7 % и 0,7 %, соответственно.
Из этих данных видно, что спермидин в клетках в большей степени связан с РНК, чем с ДНК. Показано, что в лимфоцитах барана связывается 0,46 моль спермидина на 100 моль фосфатов ДНК или АТФ, а в печени крысы этот показатель составляет 0,19 [21].
Положительно заряженные аминогруппы биогенных полиаминов взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатами нуклеиновых кислот, образуя мостики между полинуклеотидными цепями или между смежными фосфатными группами в одной цепи. Deng H. et. al. [14] исследовали с помощью метода Рамановской спектроскопии связывание полиаминов с ДНК. Они показали, что спермидин и спермин взаимодействует с фосфатами не зависимо от состава оснований ДНК. Имеет место неспецифическое катионное связывание с локализацией полиаминов диффузно вдоль ДНК в соответствии с градиентом электростатического потенциала, перпендикулярно оси спирали ДНК. Слабая зависимость связывания полианионов с ДНК от состава основания в геноме предполагает, что состав последовательности играет вторичную роль в узнавании полиаминами ДНК. Спермидин является катионным полиамином с зарядом 3+, его избыток может привести к агрегации и преципитации ДНК [28]. Исследование с помощью Раманов-ской спектроскопии водных растворов 60 mM фосфатов ДНК (~20 мг ДНК/мл) и 1; 5 и 60 mM полиамина (т.е. с молярными соотношениями поли-амин:фосфат 1:60, 1:12, 1:1) показало, что при низкой плотности полиамина (1:60, 1:12) геномная ДНК остается в растворе, а при соотношении 1:1 комплекс преципитирует [14]. Показано образование больших ДНК-агрегатов, индуцированных спермидином. Преципитация ХДНК происходит в диапазоне концентрации спермидина 0,4-0,6 мМ и концентрации ХДНК 12-90мкг/мл. Этот факт необходимо учитывать при конструировании средств доставки, включающих спермидин и (в качестве активного начала) нуклеиновые кислоты.
При изучении взаимодействия полиаминов с РНК и ДНК было показано, что связывание сперми-дина с РНК, содержащими двуцепочечные участки (поли АУ, поли ГЦ и рибосомальная РНК), было практически одинаковым, т.е. не наблюдалось зависимости от состава оснований. Среди одноцепочечных РНК предпочтительное связывание спермина убывало в ряду: полиУ> полиЦ> полиА. В присутствии 2мМ K+ и 100мМ Mg2+ связывание спермина с РНК было гораздо выше, чем с ДНК. При изучении связывания спермина с 16s рибосомальной РНК и 3GS рибосомальными субъединицами разницы в связывании не наблюдалось, что свидетельствует, по мнению авторов, о том, что присутствие рибосомаль-ных белков не влияет на связывание спермина с рибо-сомальной РНК [22]. Установлено, что полиамины оказывают незначительное влияние на вторичную структуру ДНК [14].
С другой стороны показано, что полиамины вызывают структурные изменения петлевых участков РНК, что может лежать в основе стимуляции синтеза ряда белков, сборки 30S рибосомальных субъединиц и сплайсинга эукариотических пре-мРНК [20]. Так как многие виды РНК содержат петлевые области дсРНК, полагают, что влияние полиаминов на клеточный рост происходит вследствие стабилизации вторичной структуры РНК путем связывания полиаминов с петлевыми участками. Данные о том, что спермидин и спермин ингибируют транскрипцию реовируса млекопитающих (MRV) могут быть объяснены тем, что геном этого вируса содержит 10 сегментов дсРНК, с которыми полиамины могут связываться, увеличивать стабильность дуплексных участков РНК [13] и нарушать тем самым транскрипцию.
Фармако-токсикологические исследования
Метаболизм полиаминов может играть доминантную роль в ответе организма на лекарства, стрессовую стимуляцию, вносить вклад в этиологию различных патологических состояний, включая рак. Дисрегуляция полиаминового катаболизма часто сопровождает различные патологические состояния, и, возможно, включена в механизм заболевания. Так, показано изменение уровня полиаминов в крови у пациентов с панкреатитом [24]. При шизофрении резко возрастает уровень секреции и выведения полиаминов с мочой [7]. Обнаружено увеличение количества акролеина, продукта превращения полиаминов с помощью полиаминоксидазы, при хронических нарушениях функции почек или инсульте мозга. В нормальных условиях акролеин незначительно продуцируется в клетках, поскольку полиамины существуют в виде РНК-полиаминовых комплексов, а не в свободной форме. Igarashi K. et al. предположили, что акролеин начинает эффективно продуцироваться, если клетки повреждены и разрушен комплекс РНК-полиамин. Поэтому изменение уровня акролеина может оказаться хорошим маркером патологий, которые сопровождаются повреждением клеток [21]. Обнаружено увеличение количества полиаминов в период деления клеток. Содержание полиаминов увеличено в опухолевых и пролиферирующих клетках. Этот факт привлекает внимание ученых также с точки зрения изучения возможности ингибирования клеточного роста путем воздействия на синтез полиаминов в клетках. Поэтому в качестве химиотерапевтических противоопухолевых средств разрабатываются селективные ингибиторы и модификаторы метаболизма полиаминов [В; 44]. Кроме того, показано, что аналоги природных полиаминов могут мимикрировать под биогенные полиамины на молекулярном уровне, но
не способны заменять природные полиамины в процессах клеточной пролиферации, что также может быть использовано в биомедицинских целях [З4]. Следовательно, воздействие лекарственных средств на метаболизм полиаминов может оказаться уникальным инструментом для управления патологическим процессом [10]. Обнаружена способность спермидина влиять на состояние иммунной системы. Показано, что он обладает иммуномодулирующим действием на линию NR8383 макрофагов, ингибирует секрецию провоспалительных цитокинов, ФНО-a и моноцит-хемоаттрактантных белков-i (MCP-i) [ЗВ]. Иммуномодулирующие свойства спермидина могут быть использованы при создании средств для лечения ряда болезней, таких как рак, различные инфекции, а также иммунодефицитные состояния. Исследовано влияние спермидина и его солей (уксусной, лимонной, глута-ровой или винной в комбинации с носителями, стабилизаторами в виде сиропов, инъекций, таблеток, гранул, капсул, суппозиториев или мазей) при введении животным в количестве 0,005-50 мг/кг веса тела в день. Показано, что в дозе 0,005-5 мг/кг спермидин влияет на активность супрессорных клеток. Добавление спермидина к культуре клеток селезенки увеличивает продукцию ими интерлейкина-2, независимо от стимуляции Con A, оказывает ингибирующий эффект на рост опухолевых клеточных линий IMC и L-1210. Противоопухолевый эффект показан на IMC-карциноме, трансплантированной CDFi мышам. В дозе 0,05-50 мг/кг веса тела в день наблюдается ингибирование роста опухоли на 30-60 %. Спермидин в дозе 5 мг/кг у мышей с имплантированной лейкемией (клетки L-1210) после 10-кратного применения вызывает полную ремиссию у 30 % животных. В сочетании с противоопухолевым средством - блеомицином [35; Зб] - наблюдается синергидный эффект (более длительное время жизни мышей, чем при использовании одного блеомицина или спермидина).
Известно, что большое значение в характеристике лекарственных препаратов имеет уровень токсичности. Показано, что среднесмертельная доза для спермидина при пероральном введении крысам составляет 600 мг/кг. Обнаружено, что амины, в том числе и спермидин, вызывают у крыс снижение артериального давления после внутривенного введения и вызывают падение температуры тела. Скармливание спермидина крысам в течение б недель приводило к уменьшению в плазме уровней креатинина, кальция и неорганического фосфора. При введении перорально дозы 1000 ppmol (ВЗ мг/кг веса тела в день) неблагоприятные эффекты не наблюдаются [41]. Показано также, что спермидин нетоксичен в дозе 250 мг/кг при внутривенном введении мышам [35; Зб].
Интерес к спермидину как потенциальному препарату подтверждается его регистрацией в Банке лекарств (DrugBank, США). Банк лекарств (США) является уникальным биоинформационным и химико-информационным ресурсом, который объединяет описания лекарственных средств (химические, фармакологические и фармацевтические) с их всеобъемлющими мишенями. База данных содержит около 5000 описаний, включая около 1550 одобренных FDA и 3 450 - экспериментальных лекарств. К числу последних относится спермидин (Spermidine). Спермидин зарегистрирован в DrugBank под номером DB03566, в статусе экспериментального объекта, в виде малой молекулы (Drug Type: Experimental, Small Molecule). Подчеркнуто, что спермидин найден почти во всех тканях в ассоциации с нуклеиновыми кислотами, он является катионом при всех рН и стабилизирует клеточные мембраны и нуклеиновые кислоты [42].
Представленные результаты исследований свидетельствуют, что спермидин обладает рядом уникальных биологических свойств, низким уровнем токсичности, подвержен разрушению эндогенными ферментативными системами, что ставит его в число перспективных объектов для использования при конструировании препаратов с улучшенными свойствами.
Создание биотерапевтических приператов c использованием спермидина
Катионные полиамины, в том числе и сперми-дин, являются хорошими переносчиками биологически активных (терапевтических) молекул в клетки, что используется при создании новых препаратов.
С целью получения новых противоопухолевых препаратов для фотодинамической терапии синтезированы полиамин - порфириновые конъюгаты, несущие две (в цис- и транс- позициях) или четыре молекулы спермидина или спермина. Показано, что такие конъюгаты связываются с ДЦК, и под действием облучения происходит фоторазрезание ДЦК. Эти данные демонстрируют возможность использования конъюгатов полиамин - порфирин в качестве агентов для фотодинамической терапии [16]. Для улучшения фармацевтических свойств платины, широко используемой в онкологии, созданы и изучаются комплексы платины со спермидином. Показано, что присутствие спермидина повышает противоопухолевый эффект соединений платины [18; З2]. Это может свидетельствовать о возможности использования спермидина в качестве компонента противоопухолевых лекарств. Обращает на себя внимание тот факт, что спермидин не препятствует проявлению активности других компонентов изучаемых комплексных препаратов, что говорит о его пригодности для создания комплексных или многокомпонентных медицинских препаратов.
Возможность использования спермидина в составе средства доставки нуклеиновых кислот показана группой авторов под руководством V. Janout et S.L. Regen, которые разрабатывают «молекулярные зонтики» - амфоморфные соединения. Эти соединения формируют гидрофобные или гидрофильные поверхности в зависимости от гидрофильного или гидрофобного микроокружения. Такие молекулы состоят из двух или более амфифилов, связанных с центром. «Молекулярные зонтики» синтезируют с использованием в качестве «стенок» зонтика желчные кислоты и полиамины, такие как спермин и спермидин и l-лизина в качестве ветвей. Такие «зонтики» способны траспортировать вдоль липосомальных мембран пассивной диффузией гидрофильные пептиды, нуклеотиды и олигонуклеотиды. Они также могут увеличивать водную растворимость и гидролитическую стабильность гидрофобных лекарств и проявлять существенную противовирусную активность. Показано, что такие флуоресцентно меченые «молекулярные зонтики» проникают в клетки HeLa, что подтверждает возможность использования их в качестве носителей лекарств [2З; Зі]. H.L. Phama et al. синтезированы, очищены и исследованы физико-химические свойства катионного иммуностимулирующего комплекса, состоящего из полиаминов, присоединенных к остатку глюкуроновой кислоты сапонина QuilA. Полученные коллоидальные частицы имели размер 245-400 нм и положительный зета-потенциал. Подобные частицы могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот или анионных белков [З9].
Интересными оказались результаты создания на основе конъюгата «спермидин-полиглюкин» транспортного средства для дсPHK. Для этого получена молекулярная конструкция в виде вирусоподоб-
ной частицы (ВПЧ), содержащей в центре дсPHK и защищенной конъюгатом «спермидин-полиглюкин» [5]. Размер такой наночастицы составляет 25-50 нм. При внутривенном введении она распределялась по периферическим органам и тканям и быстро элиминировалась из кровеносного русла мышей. Haиболее высокое содержание препарата было в почках, селезенке, кишечнике. Основным путем выведения ВПЧ-дсPHK являлись почки [2]. Уровень токсичности и регистрируемые эффекты (снижение массы тела, температуры, изменение гематологических, биохимических показателей и т.д.) BПЧ-дсPHK не отличаются от эффектов свободной дсPHK. В ряде случаев негативные эффекты были более выраженными на введение дсPHK, чем BПЧ-дсPHK. Это свидетельствует о том, что присутствие спермидина в составе ВПЧ-дсPHK не усиливает токсические эффекты и не блокирует биологические эффекты дсPHK [25; З0]. Для дсPHK в составе ВПЧ показана повышенная устойчивость к действию нуклеаз, по сравнению со свободной дсPHK. Достоинством данной конструкции является то, что ее составляющими являются модуляторы иммунного ответа ^PHK, спермидин и полиглюкин) и ее биодеградируемость, поскольку в организме имеются ферменты, разрушающие спермидин и дсPHK.
Данная молекулярная конструкция перспективна в качестве фармакологического препарата, в том числе и для транспорта белковых молекул. Эта идея была реализована при конструировании нанопрепарата «BПЧ-дсPHK-рекомбинaнтный фактор некроза опухолей альфа человека» (BПЧ-дсPHK-ФHO-a) [З].
В результате исследования BПЧ-дсPHK-ФHO-a на мышах - опухоленосителях было установлено повышение накопления ФHO-a в опухолевой ткани, снижение эффективной противоопухолевой дозы ФHO-a и повышение значений ЛД50 по сравнению с ЛД50 свободного ФТО-а
Перспективным направлением биотерапии является генная терапия. Внимание исследователей концентрируется на создании невирусных систем доставки генов, которые являлись бы стабильными, безопасными и простыми. Все большее внимание в качестве средств доставки привлекают катионые полимерные системы, которые являются эффективными переносчиками генов [45]. Способность катионного полиамина спермидина хорошо связываться с нуклеиновыми кислотами используется в настоящее время при создании генсодержащих препаратов.
Так, с использованием спермидина был создан невирусный вектор с низкой токсичностью для переноса генов. Для этого был синтезирован ряд алкил-олигоаминовых производных низкотоксичного ПЭИ с ММ 10 kDa с помощью реакции ПЭИ с серией омега-бромоалкилкарбоксильных кислот с различной длиной цепи, и далее добавления различных полиаминов, в том числе спермидина. Модифицированный таким образом полиэтиленимин образовывал с плазмидной даК наночастицы размерами около 100 нм. Показана эффективность трансфекции с помощью такого вектора гена люциферазы в клетки мышиной нейробла-стомы N2A [12]. Создано соединение, состоящее из спермидина, ковалентно связанного с холестерином, названное авторами «Transfectall». При использовании генов люциферазы и бета-галактозидазы показано, что происходит высоковоспроизводимая и эффективная трансфекция генов в клетках HuH-7. Авторы считают, что комплекс спермидин-холестерин может осуществлять перенос других генов в клетки млекопитающих [ЗЗ]. Подобные катионные амфифилы, облегчающие транспорт терапевтических молекул в клетки, описаны в патенте США [З7].
Амфифилы содержат липофильные группы стероидов и катионные группы производных аминов, алкиламинов или полиалкиламинов. Показано, что спермидин-холестеролкарбамат эффективно переносит ген, кодирующий трансмембранный регуляторный белок цистного фиброза человека (CFTR) в иммортализованные клетки цистного фиброза человека (CFT-1) и также эффективно переносит гены при интраназальном и внутривенном введении мышам. Предложенные соединения могут использоваться для переноса таких биологически активных молекул, как рибосомальная РНК, антисенсполинук-леотиды, РНК или ДНК, рибозимы, полинуклеотиды геномной ДНК, кДЦК, мРНК.
Получен новый катионный полимер полифос-форамидспермидин, обладающий способностью связывать плазмидную ДНК и обеспечивающий ее проникновение в клетку. Такой искусственный полимер оказался менее токсичным, чем полифосфорамид, и обеспечивал доставку терапевтического bcl-2 в спинной мозг при введении в язык мышей [45].
Экспериментально доказана возможность использования конъюгата «спермидин-полиглюкин» как средства адресной доставки генов. Взаимодействие последнего с плазмидой, содержащей ген рчГ-КСФ, стимулятора гемопоэза, привело к созданию наночастицы, в центральной части которой находилась ДНК [40]. Наночастица имела сферическую форму и размер от 10 до 25 нм. Показана сохранность плазмидной ДНК в составе этой молекулярной конструкции в течение суток после обработки смесью ДНКазы и РНКазы, в то время как плазмидная ДНК в тех же условиях полностью разрушалась через 30 мин. Сохранность ДНК в молекулярной конструкции регистрировалась в плазме крови также в течение 24 ч. Накопление конструкции наблюдали в костном мозге мышей после введения препарата в дозе 100 мкг на животное. Через 7-8 сут. после введения молекулярной конструкции, содержащей ген рчГ-КСФ, в сыворотке крови мышей выявили антитела к Г-КСФ человека. Это служит подтверждением того, что в клетках костного мозга, куда была доставлена конструкция, происходит экспрессия гена рчГ-КСФ. Подобная конструкция была создана с геном интерлейкина-2 для введения ее в эукариотические клетки. Показана большая сохранность ДНК в составе ВПЧ-ДНК/ИЛ-2 по сравнению со свободной плазмидной ДНК [4]. Эти данные свидетельствуют о том, что использование конъюгата «сперми-дин-полиглюкин» как транспортной системы для ДНК позволяет повысить устойчивость ДНК к ферментативным системам крови и обеспечить доставку в ткани-мишени. Показана возможность применения конъюгата «спермидин-полиглюкин» для создания вакцин. С этой целью были сконструированы ВПЧ, содержащие в центральной части плазмидные ДНК, гены вирусных белков, а на поверхности - антигены инфекционного агента. На основе этих конструкций были получены экспериментальные образцы канди-датных вакцин против туберкулеза и клещевого энцефалита, показана их высокая эффективность при иммунизации лабораторных животных [1; 9; 17].
Полученные образцы кандидатных вакцин вызывают пролонгацию иммунного ответа, выступая в качестве своеобразного депо антигенов инфекционного агента, что, по-видимому, обусловлено повышенной устойчивостью белков, экспонированных на поверхности ВПЧ, к действию протеаз. Создание конструкции, содержащей в центральной части плазмиду с генами, кодирующими белки клещевого энцефалита, а на поверхности - эпитопы HIV-I, позволило индуцировать иммунный ответ как против ВИЧ, так и против вируса клещевого энцефалита.
Накоплены значительные сведения о конструировании и исследовании кандидатной полиэпи-топной вакцины против ВИЧ - КомбиВИЧвак, в центре которой находится плазмида pcDNA-TCI, кодирующая искусственный поли-СТЪ-эпитопный Т-клеточный иммуноген (TCI, T Cell Immunogen), содержащий более S0 Т-клеточных эпитопов, покрытая оболочкой из коньюгата «спермидин-полиглюкин», а на поверхности экспонирован белок TBI, содержащий четыре Т-клеточных эпитопа и пять В-клеточных эпитопов из белков ВИЧ-l Env и Gag [25-27]. Иммунизация мышей этой вакциной вызывала появление ВИЧ^-специфических антител. Сыворотки мышей, иммунизированных КомбиВИЧвак, активно подавляют размножение вируса в разведении l:l00. Эффективность подавления размножения вируса этими сыворотками сравнима с аналогичной характеристикой сыворотки человека, больного ВИЧ. В токсикологических экспериментах на мышах при введении кан-дидатной вакцины КомбиВИЧвак внутримышечно показано отсутствие выраженных отклонений в состоянии жизненно важных органов, иммунной системы, гематологических, морфологических показателях.
Заключение
Таким образом, спермидин является веществом, которое представлено в бактериях, вирусах, растениях, клетках млекопитающих, т. е. является эндогенно синтезируемым продуктом. Спермидин поступает в организм с продуктами питания. В организме млекопитающих существуют системы биодеградации спермидина, который разрушается и выводится из организма естественным способом. Спермидин связывает как дсРНК, так и с ДНК, связывание слабо зависит от состава оснований. Спермидин обладает иммуномодулирующим действием. С использованием спермидина создаются и исследуются комплексные соединения и средства для транспортировки биологически активных веществ в клетки и ткани. Сконструировано несколько типов кандидатных вакцин, которые обеспечивают формирование специфических иммунных ответов к возбудителям инфекционных заболеваний. Эндогенное происхождение, связывание с ДНК, дсРНК, РНК, олигонуклеотидами и другими малыми молекулами, биодеградируемость, биологическая (иммунотропная, противоопухолевая) активность, слабо выраженные токсические свойства спер-мидина позволяют рассматривать его как перспективное средство для создания иммунобиологических и терапевтических препаратов нового поколения.
Литература
1. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Туманов Ю.В. и др. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммуногенных свойств // Биотехнология. - 2004. - 4. - С. 34-40.
2. Гамалей С.Г., Даниленко Е.Д., Батенева А.В. и др. Фармакокинетика молекулярной конструкции... // Сибирск. Мед. Ж. - 2008. - 23(3)(вып.2). - С. 92-5.
3. Заявка на патент РФ №2008140246 от І3.10.08 г. Противоопухолевое средство на основе наночастицы, несущей рекомбинантный фактор./ Масычева В.И., Лебедев Л.Р., Даниленко Е. Д. и др.
4. ЛебедевЛ.Р., Булычев Л.Е. и др. Изучение цитокинового профиля.. .//Иммунология. - 2007. - 28 (3). - С. 143-7.
5. Патент РФ 2190018. Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени I Сизов А.А., Лебедев Л.Р., Масычева В.И., Даниленко Е. Д.
6. Патент РФ 2317107. Рекомбинантная вакцина против вируса иммунодефицита человека 1 типа I Карпенко Л.И., Лебедев Л.Р., Бажан С.И. и др.
7. Свинарев В.И. Роль полиаминов в этиопатогенезе шизофрении. Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 2007. - 41 с.
8. Amendola R., Cervelli M., Fratini E. et. al. Spermine metabolism and anticancer therapy II Curr. Cancer Drug Targets. - 2009. - Vol. 9(2). - P. 118-30.
9. Bazhan S.I., Belavin P.A., Seregin S.V. et. al. Designing and engineering of DNA- vaccine.IIVaccine. -2004. - Vol. 22(13I14). - P. 1б72-82.
10. Casero R.A., PeggA.E. Polyamine catabolism and disease II Biochem. J. - 2009. - Vol. 421(3). - P. 323-38.
11. Chattopadhyay M.K., Tabor C. W., Tabor H. Polyamines are not required. II J. Bacteriol. - 2009. - Jun 19.
12. Dehshahri A., Oskuee R.K., Shier W. T. et. al. Gene transfer efficiency of high primary amine content, hydrophobic, alkyl-oligoamine derivatives of polyethylenimine II Biomaterials. - 2009. - Vol. 30(25). - P.4187-94.
13. Demidenko A.A., NibertM.L. Probing the transcription mechanisms of reovirus cores with molecules that alter RNA duplex stability II J. Virol. - 2009. - Vol. 83(11). - P.5659-70.
14. Deng H., Bloomfield V.A., Benevides J.M., Thomas G.J. Structural basis of polyamine-DNA recognition: spermidine and spermine interaction with genomic B-DNA of different GC content probed by Raman spectroscopy II Nucl. Acids. Research. - 2000. - Vol. 28(17). - P. 3379-85.
15. Di Luccia A., Picariello G., Iacomino G. et al. The in vitro nuclear aggregates of polyamines II FEBS J. -2009. - Vol. 27б(8). - P. 2324-35.
16. Garcia G., Sarrazy V., Sol V., Le Morvan C. et al. DNA photocleavage by porphyrin-polyamine conjugates II Bioorg. Med. Chem. - 2009. - Vol. 17(2). - P^^.
17. Goncharova E.P., Ryshikov A.B., Bulychev L.E. et al. A study of systems for delivering antigens and plasmid DNA for intranasal immunization against tick-borne encephalitis virus II Wien. Klin. Wochenschr. -2002. - Vol. 114(13I14). - P. б30-5.
18. Hegmans A., Kasparkova J., Vrana O. et al. Amide-based prodrugs of spermidine-bridged dinuclear Platinum. Synthesis, DNA binding, and biological activity II J. Med. Chem. - 2008. - Vol. 51(7). - P. 2254-б0.
19. Higashi K., Terui Y., Suganami A. et al. Selective structural change by spermidine in the bulged-out region of double-stranded RNA and its effect on RNA function II J. Biol. Chem.- 2008. - Vol. 283(47). - P.32989-94.
20. Higashi K., Terui Y., Inomata E. et al. Selective structural change of bulged-out region of double-stranded RNA.. .II Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2008. - Vol. 370(4). - P. 572-7.
21. Igarashi K., Kashiwagi K. Modulation of cellular function by polyamines II Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 2009.
22. Igarashi K., Sakamoto I., Goto N. et al. Interaction between polyamines and nucleic acids or phospholipids я Arch. Biochem. Biophys. - 1982. - Vol. 219. - P. 438-43.
23. Janout V., Regen S.L. Bioconjugate-based molecular umbrellasIIBioconjug. Chem. - 2009. - Vol. 20(2). - P. 183-92.
24. Jin H.T., Raty S., Minkkinen M. et al. Changes in blood polyamine levels in human acute pancreatitis II Scand. J. Gastroenterol. - 2009. - Vol. 14. - P. 1-8.
25. Karpenko L.I., Ilyichev A.A., Eroshkin A.M. et al. Combined virus-like particle-based polyepitope DNAIprotein HIV-1 vaccine design, immunogenicity and toxicity studies II Vaccine. - 2007. - Vol. 25(21). - P. 4312-23.
26. Karpenko L.I., Lebedev L.R., Ignatyev G.M. et al. Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes, and the study of their immunogenic properties II Vaccine. - 2003. - Vol. 21(5-6). - P.386-92.
27. Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Ilyichev A.A. et al. Comparative analysis using a mouse model of the immunogenicity of artificial VLP and attenuated Salmonella strain carrying a DNA-vaccine encoding HIV-1 polyepitope CTL-immunogen II Vaccine. - 2004. - Vol. 22(13I14). - P. 1692-9.
28. Kuramochi H., Yonezawa Y. Formation of large DNA.IIJ. Biosci. Bioeng. - 2001. - Vol. 92(2). - P. 183-5.
29. Maruyoshi K., Nonaka K., Sagane T. et al. Conformational change of spermidine upon interaction with adenosine triphosphate in aqueous solution II Chemistry. - 2009. - Vol. 15(7). - P. 1б18-2б.
30. Masycheva V.I., Danilenko E.D., Gamaley S.G. et al. A combined DNA protein HIV-1 vaccine containing polyepitope B-and T-cell immunogens: results of preclinical studiesII International symp. on HIV and emerging infectious diseases (15; 28-30 may 2008; Toulon, Franse) : Abstr. HIV clinical trials. - 2008. -9(Suppl.1). - P. 71. PD1I01.
31. Mehiri M., Chen W.H., Janout V., Regen S.L. Molecular umbrella transport: exceptions to the classic sizeIlipophilicity rule II J. Am. Chem. Soc. - 2009. - Vol. 131(4). - P. 1338-9.
32. Montero E.I., Benedetti B.T., Mangrum J.B. et al. Pre-association of polynuclear platinum anticancer agents on a protein, human serum albumin. Implications for drug design II Dalton Trans. - 2007. - Vol. 43. - P. 4938-42.
33. Moradpour D., Schauer J. I., Zuravski V. R. et aL Efficient gene transfer into mammalian cells with choles-teryl-spermidine II Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1996. - Vol. 221(Iss. 1). - P. 82-8.
34. N'soukpoё-Kossi C.N., Ouameur A.A., Thomas T. et al. DNA interaction with antitumor polyamine analogues: a comparison with biogenic polyamines II Biomacromolecules. - 2008. - Vol. 9(10). - P. 2712-8.
35. Patent EPO 0116693. An immunopotentiator having spermidine or its pharmacologically acceptable salt as active ingredient I Umesawa H., Takeuchi T., Ishizuka M.
36. Patent US 45593б2. Immunopotentiator I Umesawa H., Takeuchi T., Ishizuka M.
37. Patent US 57835б5. Cationic amphiphiles containingspermine or spermidine cationic group for intracellular delivery of therapeutic molecules I Lee E. R., HamsD.J., Siegel C.S. et. al.
38. Pёrez-Cano F.J., Franch A., Castellote C., CastellM. Immunomodulatory action of spermine and spermidine on NR8383 macrophage line in various culture conditions II Cell. Immunol. - 2003. - Vol. 22б(2). - P. 8б-94.
39. Pham H.L., Ross B.P., McGeary R.P. et al. Synthesis of cationic derivatives of Quil A and the preparation of cationic immune-stimulating complexes (ISCOMs) II Int. J. Pharm. - 2009. - Vol. 37б(1-2). - P.123-33.
40. Sizov A.A., Lebedev L.R., Masycheva V.I. et al. The development of a virus-like construct for the in vivo receptor-mediated delivery of the human granulocyte colonystimulating factor gene to bone marrow cells II Rus. J. Biotech. 2001. - Vol. 1(1). - P. 8-11. (Translated from Biotekhnologiya. - 2001. - 1. - P. 13-18).
41. Til H.P., Falke H.E., Prinsen M.K., Willems M.I. Acute and subacute toxicity of tyramine, spermidine, spermine, putrescine and cadaverine in rats II Food. Chem. Toxicol. - 1997. - Vol. 35(3-4). - P. 337-48.
42. URL: lUtD:IAv\v\v.drugbank.caIsearchIsearch?auery=spermidine (обращение 03.04.2009).
43. URL: http:IIwww.rusmedserver.ruImedIharisI291.html (обращение 03.04.2009).
44. URL: www.fda.govIohrmsIdocketsIdocketsl95s031бl95s-0з1б-фt02б9-03-vol200.pdf - (обращение 12.04.2009).
45. Wang J., Zhang P.-Ch., Lu H.-F. et al. New polyphosphoramidate with a spermidine side chain as a gene carrier II J. Contr. Release. - 2002. - Vol. 83. - P. 157-68.
