CC BY
137
Химия растительного сырья. 2012. №1. С. 71-75.
Низкомолекулярные соединения
УДК 581.192+547.914
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ЭКСТРАКЦИИ БЕРЕСТЫ БЕРЕЗЫ ЭТАНОЛОМ И ИЗОПРОПАНОЛОМ ПРИ ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ
© Н.Г. Береговцова1, В.И. Шарыпов1, С.В. Барышников1, Б.Н. Кузнецов1’2
1 Институт химии и химической технологии СО РАН, К. Маркса, 42,
Красноярск, 660049 (Россия), e-mail: ngb@icct.ru
2Сибирскийфедеральный университет, пр.Свободный, 79, Красноярск,
660041 (Россия)
Исследован процесс экстракции бересты березы этиловым и изопропиловым спиртами при повышенной температуре и давлении, обеспечивающими нахождение экстрагента в жидкой фазе. Показано, что экстракция алифатическими спиртами при повышенных температурах позволяет значительно сократить продолжительность процесса экстракции и увеличить выход бетулина по сравнению с экстракцией в обычных условиях в 1,4-1,5 раза.
Методом ВЭЖХ количественно установлено содержание бетулина и бетулиновой кислоты в продуктах экстракции бересты березы этиловым и изопропиловым спиртами,
Ключевые слова: экстракция, бетулин, бетулиновая кислота,
Введение
Кора березы содержит разнообразные экстрактивные вещества, в частности, пентациклический три-терпеноид бетулин [1, 2]. Доступность и разнообразная биологическая активность бетулина открывают широкие возможности для его применения в медицине, фармацевтической, пищевой и других отраслях промышленности [3].
Наиболее распространенные методы выделения бетулина основаны на экстракции бересты различными растворителями в аппарате Сокслета, а также на щелочном гидролизе бересты с последующей экстракцией бетулина [4]. Основными недостатками этих методов являются длительность стадии выделения бетулина, обусловленная его невысокой доступностью для экстрагентов и низкой растворимостью в боль -шинстве растворителей. С целью интенсификации процесса выделения бетулина предложены методы предварительной активации коры березы водяным паром в условиях «взрывного» автогидролиза [5, 6], активирующей обработки бересты перегретым паром в присутствии щелочи [5-7], предварительного ударно-акустического воздействия [8]. Разрабатываются процессы экстракции бетулина сверхкритическим диоксидом углерода и легкими углеводородными газами [9]. Достоинства сверхкритических (флюидных) сред в качестве экстрагентов обусловлены их эффективным растворением веществ, в том числе и неполярных соединений, высокой диффузионной способностью, низкой вязкостью, простотой разделения экстракта и экстрагента.
К недостаткам сверхкритических сред можно отнести высокое давление, при котором достигается эффективное извлечение целевых продуктов.
Известно, что растворимость многих экстрагируемых веществ в органических растворителях увеличивается с ростом температуры, что способствует значительному сокращению продолжительности экстракции. В частности, в работе [10] показано, что при повышении температуры экстракции бетулина в алифатических спиртах с 278,2 до 308,2 К его растворимость возрастает в 2-2,3 раза.
* Автор, с которым следует вести переписку,
Цель настоящей работы - изучение влияния повышенных температур (100-150 °С) и давления (2,0 МПа) на скорость выхода и состав продуктов экстракции бересты березы этанолом и изопропанолом в реакторе проточного типа.
Экспериментальная часть
В экспериментах использовали бересту березы (Betula pendula) с размером частиц 2-4 мм, предварительно высушенную при температуре 105 °С. Экстракцию спиртами осуществляли на лабораторной установке в проточном реакторе объемом 40 см3 при температурах 100 и 150 °С. Для сохранения в этих условиях жидкого состояния экстрагента в реакторе поддерживалось давление 2,0 МПа. Схема реактора приведена на рисунке 1. Кварц (4), стекловолокно (1) и измельченную бересту (3) располагали таким образом, чтобы карман для термопары (2) находился в середине слоя сырья. Реактор устанавливали в безградиентную печь и присоединяли к технологическим линиям. Скорость подачи растворителя, нагретого до температуры экстракции, составляла 50 мл/ч. В ходе эксперимента после достижения заданной температуры через каждые 30 мин. реакции производился отбор экстракта. Спиртовый раствор экстракта переносили в колбу и отгоняли спирт, в колбе оставляли не менее 10 мл раствора. Колбу с оставшейся пробой высушивали под вакуумом до постоянного веса и определяли выход сухого экстракта в расчете на массу загружаемой бересты. Из экстракта выделяли концентрат бетулина и экстрагируемую в этих условиях часть суберина по следующей методике. В круглодонную колбу объемом 500 мл, снабженную обратным холодильником, помещали 5 г сухого экстракта и кипятили в 30 мл 20% водного раствора NaOH и 250 мл этилового спирта в течение 4 ч. Затем отгоняли этиловый спирт, реакционную массу охлаждали, разбавляли 10 мл дистиллированной воды и отфильтровывали. Полученный таким образом концентрат бетулина промывали на фильтре до нейтральной реакции, сушили и доводили до постоянного веса. Фильтрат подкисляли соляной кислотой до pH 4-5, при этом выпадал коричневый хлопьевидный осадок - суберин. Осадок фильтровали и промывали до нейтральной реакции и определяли выход экстрагируемой в выбранных условиях части суберина.
В продуктах экстракции количественно определяли содержание бетулина и бетулиновой кислоты с использованием жидкостного микроколоночного хроматографа «Милихром А-02» (ЗАО Институт хроматографии «Эконова», Новосибирск) со спектрофотометрическим сканирующим детектором УФ-диапазона. Для анализа
использовали колонку из нержавеющей стали (2,0*75 мм), упакованную сорбентом Prontosil С18 AQ с размером зерна 5,0 мкм, температура колонки 35,0±0,3 °С. Подвижная фаза: ацетонитрил (НПК «Криохром», Санкт-Петербург, сорт 0) - деионизированная вода в соотношении 86 : 14 [11], скорость потока 200 мкл/мин. Дозируемый объем раствора исследуемого вещества - 4 мкл. Время регистрации хроматограммы - 7,5 мин.
Для калибровки в качестве стандарта использовали образец бетулина, полученный методом, описанным в работе [12]. Согласно данным термогравиметрического анализа (синхронный термоанализатор STA 449C Jupiter, совмещенный с масс-спектрометром QMS 403C Aeols), стандартный образец бетулина содержал 3,4% масс. растворителей. Бетулиновая кислота синтезирована из бетулина по методу [13]. Отношение площадей пиков стандартов бетулина и бетулиновой кислоты, записанных при 210 нм, при соответствующих концентрациях с точностью 8% совпало с данными работы [11].
С использованием стандартных образцов получены калибровочные зависимости. С этой целью приготовлены растворы в этиловом спирте, содержащие различную концентрацию бетулина и бетулиновой кислоты. Калибровочные зависимости сигнала детектора от содержания анализируемых веществ определены по 5 точкам в диапазоне концентраций 0,301-1,079 мг/мл и 0,028-0,431 мг/мл соответственно для бетулина и бетулиновой кислоты. Для каждой точки выполнено по 3 измерения. В указанном диапазоне зависимость для бетулина и бетулиновой кислоты носит линейный характер.
Не
жндкне н газообразные продукты
Рис. 1. Схема реактора лабораторной проточной установки: 1 - стекловолокно;
2 - карман для термопары;
3 - береста; 4 - кварц
Концентрация в растворах менялась в пределах 0,301-1,079 мг/мл для бетулина и 0,028-0,431 мг/мл для бетулиновой кислоты. Измерение каждой точки проводилось 3 раза. Предел детектирования, рассчитанный по отношению интенсивности минимального регистрируемого сигнала к уровню шума, составил
0,4 и 0,6 мкг/мл для бетулина и бетулиновой кислоты соответственно.
Хроматографические пики бетулина и бетулиновой кислоты в экстрактах и концентратах бетулина, полученных в разных условиях, идентифицировали по времени удерживания и спектральным отношениям относительно канала 210 нм (табл. 1). Обработка полученных результатов осуществлялась программой МультиХром-СПЕКТР для Windows (Ampersand Ltd.).
Таблица 1. Спектральные отношения для бетулина и бетулиновой кислоты (относительно канала 210 нм)
Спектральные отношения /S2io
S220 S230 S240 S250 S260
Бетулин 0,105 0,002 0,000 0,000 0,000
Бетулиновая кислота 0,107 0,018 0,006 0,010 0,000
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований показали, что скорость экстракции бересты березы этиловым и изопропиловым спиртами растет с увеличением температуры процесса (рис. 2). За первые 0,5 ч процесса в исследуемых спиртах при 100 °С получено 14,6 % масс. растворимых продуктов и при 150 °С -21% масс. Из рисунка 2 следует, что процесс экстракции может быть условно разделен на два этапа. В течение первого часа экстрагируется большая часть бетулина (примерно 80 % масс. при 150 °Си 60% масс. при 100 °С). Затем скорость извлечения бетулина существенно снижается. Суммарный выход концентрата бетулина в процессе экстракции бересты в токе этилового и изопропилового спиртов при повышении температуры процесса до 100-150 °С изменяется в пределах 26,9-32,2% масс. (табл. 2). При экстракции по стандартной методике в аппарате Сокслета в течение 24 ч этот показатель в 1,4—1,5 раз ниже и колеблется в пределах 19,1-21,7% масс.
Из таблицы 2 следует, что выход экстракта на 4-7% масс. превышает сумму выходов концентрата бетулина и экстрагируемого суберина. Отсутствие баланса объясняется наличием в составе экстракта веществ, которые в процессе его разделения на концентрат бетулина и экстрагируемый суберин (см. методику эксперимента) переходят в водный раствор.
Проведение экстракции бересты березы спиртами при повышенных температурах позволяет выделять значительную часть экстрагируемых продуктов из раствора при его охлаждении. Таким методом было выделено до 50% масс. экстрагируемого продукта от его содержания в экстракте, полученном при температуре 150 °С, давлении 2.0 МПа и продолжительности реакции 3 ч.
На рисунке 3 представлена характерная ВЭЖХ-хроматограмма экстракта, полученного экстракцией бересты березы изопропанолом в проточной установке при 100°С. Видно, что кроме пика бетулина (время выхода - 4,25 мин) присутствуют два пика бетулиновой кислоты, имеющие времена выхода 3,65 и 3,36 мин. Согласно литературным данным [14] эти пики могут принадлежать бетулиновой кислоте в р- и а-формах соответственно. Кроме того, на хроматограмме присутствуют два пика с временами выхода 5,40 и 7,18 мин, принадлежащих неидентифицированным в настоящей работе веществам, имеющим поглощение в УФ-области.
Согласно результатам анализа полученных экстрактов методом ВЭЖХ (табл. 3), экстракты, полученные в первые 30 мин экстракции, характеризуются относительно невысоким содержанием бетулина 68,1-71,4% масс. и максимальным содержанием бетулиновой кислоты 7,3-5,3% масс. В конце процесса концентрация бетулина в экстракте достигает 97,3-96,9% масс. Тип спирта не оказывает существенного влияния на состав экстрактов.
Таблица 2. Влияние условий экстракции бересты березы этиловым и изопропиловым спиртами
Условия Лабораторная установка, 3 ч, 2.0 МПа
Этиловый спирт Изопропиловый спирт
Температура, °С 100 150 100 150
Выход экстракта, % масс. 35,1 38,7 36,9 37,6
Выход концентрата бетулина, % масс. 26,9 29,2 29,2 32,2
Выход экстрагируемого суберина, % масс. 2,5 2,5 1,9 1,4
25-і Да / Д1
20 -
15 -
10 -
0,5
1,5
&
2 2,5 3
Продолжительность экстракции, ч
Рис. 2. Динамика изменения выхода Ла/Л! экстракта Рис. 3. ВЭЖХ-хроматограмма экстракта,
бетулина в процессе экстракции бересты: полученного экстракцией бересты березы
. клог. ж 1 ла ог изопропанолом при 100 °С, давлении 2,0 МПа.
■ - 150 °С, изопропанол; А - 100 °С, изопропанол; г г ’ 5
□ - 150 °С, этанол; О - 100 °С, этанол °тб°Р °браЗЦа осУЩествлен чеРез 0,5 4 Ре™
5
0
Таблица 3. Содержание бетулина и бетулиновой кислоты в экстрактах бересты березы
Период экстракции Изопропиловый спирт Этиловый спирт
бетулин, % масс. бетулиновая кислота, % масс. бетулин, % масс. бетулиновая кислота, % масс.
Начало экстракции - 0,5 ч 68,1 7,3 71,4 5,3
0,5—1,5 ч 93,0 2,9 91,3 2,4
1,5-3,0 ч 97,3 не обнаружена 96,9 не обнаружена
В ИК-спектрах образцов суберина, полученных экстракцией бересты при повышенной температуре (рис. 4), наблюдаются интенсивные полосы поглощения, которые могут принадлежать алифатическим оксикислотам: валентные колебания - ОН-групп в области 3400-3100 см-1, валентные и деформационные колебания алифатических -СН2-, СНз-групп в области 3000-2840 см-1, 1380-1485 см-1, соответственно; широкая сложная полоса поглощения в области 1510-1720 см-1. Для этих спектров характерно отчетливое проявление характеристических полос поглощения. Спектр образца, полученного щелочным гидролизом бересты, характеризуется низкой интенсивностью полос в области 3000-2840 см-1, что может быть, объяснено наличием высокомолекулярных веществ с низким содержанием алифатических структурных фрагментов.
Рис. 4. ИК-спектры образцов суберина, полученных экстракцией бересты при 150 °С этанолом и щелочным гидролизом бересты
Выводы
Экстракция бересты березы этиловым и изопропиловым спиртами при 100 и 150 °С под давлением, обеспечивающим нахождение экстрактов в жидкой фазе, позволяет значительно сократить продолжительность процесса и увеличить в 1,5 раза выход бетулина по сравнению с экстракцией в аппарате Сокслета.
Методом ВЭЖХ количественно установлено содержание бетулина и бетулиновой кислоты в продуктах экстракции бересты березы этиловым и изопропиловым спиртами. С ростом продолжительности экстракции от 0,5 до 3 ч концентрация бетулина в экстрактах растет с 68,1 до 97,3% масс., а бетулиновой кислоты снижается с 7,3 до 2,4% масс. Содержание бетулина в концентратах бетулина, выделенных из экстрактов, составляет 94,1-96,5 % масс. бетулиновой кислоты менее 0,5% масс.
Термогравиметрические и ИК-спектроскопические исследования продуктов экстракции бересты березы осуществлены c использованием синхронного термоанализатора STA 449C Jupiter и ИК-Фуръе спектрометра Vector 22 (Bruker) Красноярского регионального центра коллективного пользования СО РАН.
Список литературы
1. Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. №13. С. 1-30.
2. Кузнецов Б.Н., Кузнецова С.А., Левданский В.А., Судакова И.Г., Веселова О.Ф. Совершенствование методов выделения, изучения состава и свойств экстрактов березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 391-400.
3. Krasutsky P.A. Birch bark research and development // Natural Product Reports. 2006. V. 23, N6. Pp. 919-942.
4. Долгодворова С.Я., Черняева Г.Н. Дубильные вещества коры березы // Биологические ресурсы лесов Сибири : сборник трудов Института леса и древесины СО АН СССР. Красноярск, 1980. С. 72-80.
5. Кузнецов Б.Н., Левданский В.А., Еськин А.П., Полежаева Н.И. Выделение бетулина и суберина из коры березы, активированной в условиях «взрывного» автогидролиза // Химия растительного сырья. 1998. №1. С. 5-9.
6. Ефремов А.А., Кротова И.В. Комплексная переработка древесных отходов с получением ценных органических продуктов с использованием метода взрывного автогидролиза // Химия растительного сырья. 1999. №2. С. 19-39.
7. Кузнецова С.А., Александрова Н.Б., Кузнецов Б.Н. Состав и превращение основных компонентов автогидро-лизованной древесины сосны, ели и осины //Химия в интересахустойчивого развития. 2001. №9. С. 655-665.
8. Кузнецова С.А., Михайлов А.Г., Скворцова Г.П., Александрова Н.Б., Лебедева А.Б. Ударно-акустическая активация процессов выделения арабиногалакгана из древесины лиственницы и бетулина из коры березы // Вестник КГУ. Серия естественных наук. Органическая химия. 2005. №2. С. 121-123.
9. Патент W00110885 (США). Birch bark processing and the isolation of natural products from birch bark. / C.F. Ed-wardson, I.V. Kolomitsyn, P.A. Krasutsky, R.M. Carlson, V.V. Nesterenko, 15.02.2001.
10. Dan Cao, Guoling Zhao, Weidong Yan. Solubilities of Betulin in Fourteen Organic Solvents at Different Temperatures // Journal of forestry research. 2007. N52. Pp. 1366-1368.
11. Guoling Zhao, Weidong Yan, Dan Cao. Simultaneous determination of betulin and betulinic acid in white birch bark using RP-HPLC// Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2007. V. 43. Pp. 959-962.
12. Абышев A.3., Журкович И.К., Агаев Э.М., Абдулла-заде А.А., Гусейнов А.Б. Методы стандартизации качества субстанций бетулинола и его лекарственных форм // Химико-фармацевтический журнал. 2006. Т. 40, №1. С. 49-53.
13. Ле Банг Шон, Каплун А.П., Шпилевский А.А., Андия-Правдивый Ю.Э., Алексеева С.Г., Григорьев В.Б., Швец В.И. Синтез бетулиновой кислоты из бетулина и исследование ее солюбилизации с помощью липосом // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24, №10. С. 787-793.
14. Drag M., Surowiak P., Drag-Zalesinska M., Dietel M., Lage H., Oleksyszyn J. Comparison of the Cytotoxic Effects of Birch Bark Extract, Betulin and Betulinic Acid Towards Human Gastric Carcinoma and Pancreatic Carcinoma Drug-sensitive and Drug-Resistant Cell Lines// Molecules. 2009. V. 14, N4. Pp. 1639-1651.
Поступило в редакцию 18 апреля 2011 г.
