CC BY
136
УДК 616.34-056.2(470.323)
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИСТЕНОЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА МЫШЕЙ В УСЛОВИЯХ АНОМАЛЬНОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБИОЗЕ
© Медведева О.А., Калуцкий П.В., Беседин А.В., Медведева С.К.
Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: kaf. mikrobio @kurskmed. com
Изучение характера мукозной микрофлоры кишечника экспериментальных животных, подвергавшихся воздействию аномального магнитного поля, позволило установить, что оно приводит к изменениям в составе кишечного микробиоценоза. При этом изменяется количество и частота обнаружения представителей как облигатной, так и тран-зиторной флоры. При оценке качественного и количественного разнообразия микробного сообщества пристеночного муцина толстого кишечника мышей в условиях воздействий магнитного поля фоновых и аномальных значений в норме и при дисбиозе, вызванном введением антибиотика, установлены изменения, которые позволяют сделать вывод о наличии реактивности пристеночной микрофлоры кишечника мышей на воздействие аномального магнитного поля. Эти изменения, по всей вероятности, обусловлены изменением четвертичной структуры энзимов и белков цитоплазматической мембраны микробов, а следовательно, и их функции.
Ключевые слова: дисбиоз, магнитные поля, микрофлора кишечника.
RESEARCH OF MICE INTESTINE MUCINE MICROFLORAE UNDER THE EFFECT OF ABNORMAL MAGNETIC FIELD IN NORM AND AT EXPERIMENTAL DISBIOSIS Medvedeva O.A, Kalutsky P. V., Besedin A. V., Medvedeva S.K.
Microbiology, Virology, Immunology Department of the Kursk State Medical University, Kursk
Reseach of mucosal intestinal microflora at experimental animals exposed to the anomalous magnetic field, revealed that it leads to changes in the composition of intestinal microbiosinosis. The number and frequency of obligate and transient flora representatives are changed.The changes of a qualitative and quantitative variety of microbial community mice large intestine mucine microflora under the effect of background and abnormal values magnetic field in norm and in disbiosis, causing by antibiotic administration were detected. They allow to draw a conclusion about reactivity of mice intestine mucine microflora to the effect of the abnormal magnetic field. These changes, most likely, are caused by changing of microbes enzymes and cytoplasmatic membrane structures and their functions.
Keywords: disbiosis, magnetic fields, intestines microflora.
Важную роль в жизнедеятельности организма человека играет нормальная микрофлора. В настоящее время нормальную микрофлору человека рассматривают как совокупность микробиоценозов различных частей тела. Нормофлора включает в себя более 500 видов микроорганизмов, которые формируют качественный и количественный состав в зависимости от локализации клеток [1, 2, 3].
Роль микрофлоры человека многообразна. В частности, она обеспечивает регуляцию отношений между организмом и окружающей средой.
И.И. Мечников писал о полезных микроорганизмах как о «биоплёнке», состоящей из сотен видов микробов и покрывающей кожу и слизистые оболочки человека наподобие перчаток. Понятие биоплёнки осталось актуальным и в наши дни [2, 5, 12].
В толстом кишечнике находится огромное, поражающее воображение количество микроорганизмов, которые представлены 17 семействами, 45 родами и более чем 500 видами. Его микрофлора состоит из большого количества различных
групп и видов бактерий. Общее количество про-светной и пристеночной флоры на один грамм тканей кишечника может достигать 1012 КОЕ [6,
11, 13].
Но при воздействии анормальных экзо- и эндогенных факторов микробиоценозы выходят из состояния микробиологического равновесия, что, в свою очередь, сопровождается возникновением дисбактериоза [10].
В настоящее время на территории Курской области чётко обозначен район выраженных геомагнитных аномалий, где геомагнитное поле по его напряжённости резко превышает фоновые значения (в 4-5 раз) - Железногорский район. Такое отклонение напряжённости геомагнитного поля оказывает влияние на жизнедеятельность различных организмов, постоянно обитающих в этих условиях. Кроме того, магнитное поле (МП) в регионе Курской магнитной аномалии (КМА) действует непрерывно в отличии от магнитных бурь, действующих повсеместно, но кратковременно. Проведенные исследования позволили установить, что в условиях КМА возникают из-
менения свойств биологических объектов, длительное время находящихся под воздействием геомагнитного поля аномальных характеристик.
В связи с вышеизложенным целью нашей работы явилась оценка качественного и количественного разнообразия микробного сообщества пристеночного муцина толстого кишечника мышей в условиях воздействий магнитного поля фоновых и аномальных значений в норме и при дисбиозе, вызванном введением антибиотика (гентамицина).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперимент проводили на мышах линии СВА весом 18-20 граммов. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755). Все животные содержались при сходных условиях в отношениях температуры, влажности и освещения, а также рациона питания.
Животные были разделены на 5 групп: 1 группа - животные находились при фоновых значениях геомагнитного поля г. Курска (контроль), еще две группы находились в аномальном магнитном поле (АМП) при предварительном «омаг-ничивании» до моделирования экспериментального дисбиоза в течение 1 (АМП-1) и 2 (АМП-2) недель соответственно (лекарственный дисбиоз у животных создавали путем ежедневного внутри-брюшинного введения раствора гентамицина в течение 5 дней). Четвертая и пятая группы мышей находились в аномальном магнитном поле при предварительном «омагничивании» в течение
1 и 2 недель без моделирования экспериментального дисбиоза. У животных второй и третьей групп
вывод из эксперимента проводился на 3, 5, 7, 10 и 14 сутки после последней инъекции гентамицина.
Для исследования микрофлоры забирали би-оптаты толстого кишечника (слепой и прямой кишки), свободные от химуса. Материал помещали в стерильный фосфатный буфер (рН 6,0) в соотношении 1 мг ткани в 100 мкл раствора на срок
2 часа для разжижения муцина. Микробиологические исследования пристеночного муцина проводили согласно методике, предложенной Л.И. Ка-фарской и Н.А. Коршуновым [4, 5, 8].
Из материала готовились мазки, которые окрашивали по Граму. Разведение исследуемого материала готовили до концентраций 10-1; 10-2; 10-3; 10-4 и по 0,1 мл раствора соответствующего разведения засевали на поверхность питательной среды [5, 7, 8 ,9] (табл. 1).
Идентификация выделенных культур проводилась на микробиологическом анализаторе «Multiscan-Ascent» с использованием коммерческих тест систем «Лахема-Чехия» ЭНТЕРОтест -16, СТАФИтест - 16, Стрепто Тест - 16, ЭН-КОККУСтест - 16, API 20C Aux (BioMerieux 20 210).
Количество бактерий в 1 г биологического материала вычисляли по числу выросших колоний микроорганизмов - колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве из максимального разведения, где наблюдался рост не менее 10 колоний. При этом учитывали объем посевного материала. Для расчета использовали следующую формулу:
КОЕ=Е/ ^*v*n), где
КОЕ - колониеобразующая единица Е - общее количество бактерий К - количество внесенного материала v - количество чашек Петри n - разведение
Количество выделенных микроорганизмов выражали в Ig КОЕ/г массы биологического материала.
Таблица 1
Профиль бактериологического исследования микрофлоры кишечника мышей
Питательные среды Выделяемые микроорганизмы Пристеночный муцин
МРС агар Лактобактерии 0 1 ; 0 1
Эндо Энтеробактер; кишечная палочка о 1 ; о 1
Среда № 10 Стафилококки 10-2;10-4
Сабуро Дрожжеподобные грибы 10-2;10-4
Висмут-сульфит агар Сальмонеллы; цитробактер 10-2;10-4
Бифидо-агар Бифидобактерии 10-2;10-4
Кровяной агар Стафилококки, стрептококки, энтерококки 0 1 ; 0 1
Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической (М) и средней ошибки средней ^). При оценке достоверности различий сравниваемых данных за уровень значимости принимали р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение характера мукозной микрофлоры кишечника экспериментальных животных, подвергавшихся воздействию аномального магнитного поля, позволило установить, что его оно приводит к изменениям в составе кишечного микробиоценоза. При этом изменяется количество и частота обнаружения представителей как облигатной, так и транзиторной флоры.
Несмотря на то что облигатные представители (бифидо- и лактобактерии ) обнаруживаются в составе микрофлоры кишечника у всех экспериментальных животных, их количество умеренно снижается - бифидобактерий до ^ 3,97±0,3 (АМП-2) по сравнению с ^ 5,37±0,1 в контроле (ГМП), лактобактерий - ^ 4,87±0,1 (АМП-2) по сравнению с ^ 6,39±0,15 в
контроле (табл. 2). В популяции эшерихий не отмечено существенных изменений: их количество (lg 4,55±0,6) практически не отличалось от контрольных значений. Частота обнаружения эшерихий с нормальной ферментативной активностью составила 100%, как и энтерококков. Однако количество энтерококков при воздействии АМП в течение двух недель достоверно возросло до lg 5,22±0,1. Все идентифицированные энтерококки обладали гемолитической активностью.
Среди представителей условно-патогенных энтеробактерий также наблюдали выраженные изменения. Так, количество бактерий рода Enterobacter в контроле составляло lg 5,41±0,4, а после недельного воздействия АМП их количество уменьшилось в 1,5 раза и составило lg 3,59±0,2. При увеличении длительности воздействия АМП до двух недель количество бактерий рода Enterobacter увеличивалось в 1,1 раза по сравнению с контролем и в 1,7 раза по сравнению с АМП-1 и составило lg 6,12±0,1.
Численность бактерий рода Salmonella под воздействием АМП в течение одной недели изменялось незначительно (lg 5,14±0,2 в контроле и lg 4,84±0,3 в аномальном магнитном поле - 1 неделя).
Таблица 2
Десятичный логарифм численности мукозной микрофлоры кишечника экспериментальных животных, подвергавшихся воздействию магнитного поля различной напряженности и длительности
Характер воздействия Микроорганизмы N. ГМП M±m АМП (1 неделя) M±m АМП (2 недели) M±m
E.coli 4,83±0,1691 4,61±0,16 4,55±0,16
Enterobacter spp. 5,41±0,1353 3,59±0,13* 6,12±0,21*
Salmonella spp. 5,14±0,1285 4,84±0,17* 6,35±0,22*
Citrobacter spp. 6,07±0,1518 0* 0*
Enterococcus spp. 3,83±0,0958 3,96±0,14 5,22±0,18*
Streptococcus spp. 4,8±0,12 0* 0*
Staphylococcus spp. 0 5,15±0,18* 4,18±0,15*
Lactobacillus spp. 6,39±0,1598 5,44±0,19* 4,87±0,17*
Bifidobacterium spp. 5,37±0,1343 4,58±0,16* 3,97±0,14*
Примечание. * - p<0,05 по отношению к данным в ГМП.
Однако при увеличении воздействия АМП до двух недель их количество возросло в 1,2 раза в сравнении с контролем и достигло lg 6,12±0,12.
Бактерии рода Citrobacter и представители факультативной флоры рода Streptococcus обнаружились только в контроле и их численность составила lg 6,07±0,15 и lg 4,80±0,1 соответственно.
Среди микроорганизмов, идентифицированных в муциновом слое кишечника мышей, подвергшихся воздействию АМП, определялись стафилококки в количестве lg 5,15±0,3 в АМП-1 и lg 4,18±0,15 в АМП-2.
Микроорганизмы, относящиеся к грибам рода Candida, не были обнаружены среди представителей микрофлоры как в контрольной группе, так и у животных, подвергавшихся воздействию аномального магнитного поля.
При дисбиозе, вызванном введением антибиотика (гентамицина), нам было важно уточнить так же и характер изменений микрофлоры (табл. 3). Число КОЕ эшерихий с нормальной ферментативной активностью при дисбиозе достоверно снижалось уже на 3-и сутки после последней инъекции гентамицина и было практически идентично для животных, находившихся в МП фоновых и аномальных значений. И если к 5-м суткам в МП фоновых значений их численность практически не изменилась, то в АМП концентрация E.coli была незначительной (на границе чувствительности метода). К 7-м суткам в ГМП количество кишечной палочки нормализовалось, а к 10-м и 14-м - даже несколько превышало норму, тогда как в АМП этот показатель так и не стабилизировался к 14-м суткам эксперимента.
Количество микроорганизмов рода энте-робактер при фоновых значениях магнитного поля (в ГМП) снизилось на 3-и сутки и оставалось на этом уровне вплоть до 7-х суток. Именно на 7е сутки отмечено некоторое повышение числа КОЕ, но на 10-й и 14-й день вновь наблюдалось его снижение до уровня 3-5-го дня дисбиоза.
Количество микроорганизмов рода энте-робактер у животных, находившихся в АМП, на 3-й день практически не отличалось от уровня исходных, но к 5-му дню эксперимента они практически полностью исчезли из микрофлоры слизистой. Затем наблюдалось повышение их числа даже выше исходного уровня (на 7-е и 10-е сутки), однако к 14-му дню снизилось до уровня нижней границы чувствительности методики.
Количество бактерий рода сальмонелла в МП фоновых значений было стабильным на протяжении 10 суток, но к 14-му дню оно снизилось вдвое.
В АМП такое снижение отмечалось с 3-го дня опыта, а к 10-м и 14-м суткам оно не обнаруживалось в исследуемом материале.
Бактерии рода Citrobacter при дисбиозе при фоновых значениях геомагнитного поля не определялись в материале до 14-го дня, но при этом их количество было сопоставимо с группой контроля.
При развитии дисбиоза на фоне воздействия АМП бактерии рода Citrobacter не регистрировались с 3-х суток и число КОЕ достигло их максимума к 10-м суткам. Однако на 14-е сутки в составе муцинового слоя кишечника они не определялись.
Количество стафилококков при экспериментальном дисбиозе при фоновых значениях ГМП возрастало с 3-х суток (в норме они отсутствовали в микрофлоре слизистой) и достигало максимальных значений на 7-е сутки, и этот уровень сохранялся до конца эксперимента.
В АМП наблюдались иные результаты. Стафилококки обнаруживались уже у животных контрольной группы, а к 3-м суткам отмечалось некоторое снижение их количества. На 5-е и 7-е сутки они не высевались совсем, а на 10-й и 14-й день стафилококки присутствовали в количествах, не отличающихся от контрольной группы.
Что касается содержания энтерококков в составе микрофлоры кишечника мышей при дисбиозе, то при фоновых значениях ГМП они отсутствовали в муциновом слое кишечника. Однако на 3-и сутки эксперимента они обнаруживались в исследуемом материале, на 5-е сутки не высевались, а на 7-е, 10-е и 14-е сутки присутствовали в количестве, сопоставимом с 3-м днём эксперимента.
У животных, находящихся в условиях воздействия аномальных характеристик ГМП, энтерококки присутствовали изначально, и на 3-и сутки их количество не изменилось. На 5-е и 10-е сутки мы наблюдали снижение числа КОЕ в материале, а на 7-е и 14-е - оно достоверно не отличалось от контрольных показателей.
При экспериментальном медикаментозном дисбиозе бактерии рода стрептококк полностью отсутствовали в пристеночном муциновом слое во всех группах и на всех сроках исследования, тогда как в норме он выделялся в значимых количествах.
Количество лактобактерий в ГМП фоновых значений снизилось к 3-м суткам. Затем отмечалось увеличение их числа с пиком на 7-е сутки (полученные результаты достоверно не отличались от контрольных значений), и такое их количество сохранялось до конца эксперимента.
Таблица 3
Десятичный логарифм численности мукозной микрофлоры кишечника экспериментальных животных, подвергавшихся воздействию магнитного поля различной напряженности при лекарственном дисбиозе
Виды микроорганизмов Характер магнитного поля Результаты на разных сроках исследования
Контроль M±m 3-е сутки M±m 5-е сутки M±m 7-е сутки M±m 10-е сутки M±m 14-е сутки M±m
E.coli ГМП 4,85±0,15 4,5±0,41 4,6±1,2 5,2±0,25 5,9±0,1 6,1±0,18
АМП 4,5±0,14* 3,45±0,36* 0* 5,26±0,3 6,22±*0,15 5,61±0,22*
Lactobacillus ГМП 6,38±0,32 4,6±0,22 5,18±0,47 6,03±0,1 5,9±0,1 6,21±0,3
АМП 5,45±0,4* 5,01±0,4* 0* 5,77±0,11* 6,12±0,26 6,14±0,58
Enterobacter ГМП 5,01±0,29 3,98±0,33 3,64±0,35 4,58±0,22 4,1±0,2 3,8±0,4
АМП 3,6±0,45* 3,9±0,25 0* 5,18±0,14* 4,64±0,1* 0*
Salmonella ГМП 4,78±0,32 6,1±0,65 6,2±0,2 6,75±0,5 5,95±0,45 3,4±0,24
АМП 4,91±0,27 4,8±0,54* 0* 3,87±0,36* 0* 0*
Citrobacter ГМП 6,2±0,35 0 0 0 0 6,3±0,5
АМП 0* 3,27±0,13* 0 4,34±,0,85* 4,36±0,1* 0*
Enterococcus ГМП 0 4,85±0,1 0 5,4±0,5 5,6±0,25 5,16±0,1
АМП 4,2±0,39* 5,41±0,25* 0 4,78±0,3* 4,31±0,41* 5,76±0,25*
Streptococcus ГМП 4,87±0,71 0 0 0 0 0
АМП 0* 0 0 0 0 0
Staphylococcus ГМП 0 5,01±0,1 5,33±0,33 5,4±0,4 5,68±0,2 5,89±0,24
АМП 5,15±0,58* 5,12±0,25 0* 0* 4,87±0,14* 5,201±0,2*
Грибы рода Candida ГМП 0 5,63±0,28 5,58±0,85 6,12±0,5 5,8±0,3 0
АМП 0 5,0±0,21* 0* 0* 0* 0
Примечание. * - p<0,05 по отношению к данным в ГМП.
В АМП отмечалось снижение количества лактобактерий на 3-и и 5-е сутки, а к 7-м суткам их число увеличивалось и достигало контрольных значений. На 10-е сутки число КОЕ лактобактерий превышало контрольные показатели.
Важный показатель дисбиотического состояния кишечника - количество грибов рода Candida. У мышей без дисбиоза как в ГМП, так и в АМП они отсутствовали. В ГМП фоновых характеристик отмечалось наличие грибов рода Candida на 3-и, 5-е, 7-е, 10-е сутки экспериментального медикаментозного дисбиоза. Но к 14-м суткам грибы рода Candida уже не определялись. В АМП они регистрировались только на 3-и сутки и отсутствовали на остальных сроках исследования.
Выявленные изменения позволяют сделать вывод о наличии реактивности пристеночной микрофлоры кишечника мышей на воздействие аномального магнитного поля. Эти изменения, по
мнению ряда авторов [5, 6, 11], обусловлены изменением четвертичной структуры энзимов и белков цитоплазматической мембраны микробов, а следовательно, и их функции. Но, учитывая неоднородный характер полученных результатов (что, по всей видимости, связано с различной исходной биохимической активностью, и возможно, разной способностью к адаптации), мы можем предположить, что в реализации эффектов АМП были задействованы не только собственно сами обменные системы микробов, но и иммунная составляющая слизистой кишечника [10], которая, как доказано в литературе, является одной из первых систем рецепции и реализации эффектов магнитных полей. Это, безусловно, важно для понимания процессов развития дисбиоза в системе «макро-микроорганизм» и требует дальнейшего изучения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактери-
оз кишечника. - СПб.: ПИТЕР, 2007. - 240 с.
2. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журн. микробиологии - 2004. - № 1. - С. 84-87.
3. Бондаренко В.М., Боев Б.В., Лыкова Е.А., Воробьев А.А. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. -1999. - № 1. - С. 66-70.
4. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс // Журн. микробиологии. - 2005. - № 6 -С. 3-7.
5. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Буданова Е.В., Зуденков А.Е. Сравнительное изучение пристеночной микрофлоры толстой кишки в эксперименте на мышах // Журн. микробиологии. -
2001. - № 1. - С. 62-67.
6. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М. и др. Дисбактериоз - актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. - 1997. - № 3. - С. 4-7.
7. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта у человека в норме
и патологии // Вестн. РАМН. - 2004. - № 2. -С. 43-47.
8. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Исследования пристеночной микрофлоры кишечника человека // Журн. микробиологии. -2003. - № 1. - С. 60-63.
9. Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Современные методы оценки качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища // Журн. микробиологии. -
2002. - № 4. - С. 72-78.
10. Митрохин С.Д. Дисбактериоз: современные представления. Диагностика. Возможности лечения // Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - Т. 49. -№ 7. - С. 22-33.
11. Митрохин С.Д., Никушкин Е.В. Современная система мониторинга за микробной экологией кишечника человека // Практикующий врач. -1998. - № 13. - С. 42-48.
12. Несвижский Ю.В., Богданов Е.А., Зверев В.В., Воробьев А.А. Микробиоценоз пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс с индуцированным дисбиозом // Журн. микробиологии. -2007. - № 3. - С. 57-60.
13. Парфенов А.И., Осипов Г.А., Ручкина И.Н. Теоретические вопросы дисбактериоза кишечника // Consilium Medicum. - 2003. - № 6. - С. 328-330.
