CC BY
69
УДК 615.345:616.345:537.63]-092.9
ВЛИЯНИЕ ЛИКОПИДА НА СОСТАВ ПРИСТЕНОЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА И ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ МЫШЕЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЛЕКАРСТВЕННОМ ДИСБИОЗЕ В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ МАГНИТНОГО ПОЛЯ ПОВЫШЕННОЙ НАПРЯЖЁННОСТИ
© Медведева О.А., Калуцкий П.В.
Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: kaf.dermatolo [email protected]
Изучено влияние иммуномодулятора ликопида на пристеночную микрофлору толстого кишечника и функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови мышей при дисбиозе, индуцированном гентамицином, в условиях воздействия магнитных полей различной напряжённости. Установлено выраженное влияние ликопида не только на функционально-метаболическую активность нейтрофилов, но и на состав пристеночной микрофлоры толстого кишечника. Причём направленность изменений исследованных показателей фагоцитарного процесса в определённой степени коррелирует с характером изменений представителей нормальной микрофлоры.
Ключевые слова: дисбиоз, магнитные поля, микрофлора кишечника, нейтрофилы, ликопид.
EFFECT OF LICOPID IMMUNOMODULATOR ON MUCIN LARGE INTESTINE MICROFLORA AND BLOOD NEUTROPHIL FUNCTIONAL-METABOLIC ACTIVITY OF MICE WITH EXPERIMENTAL DRUG DYSBIOSIS UNDER THE CONDITIONS OF MAGNETIC FIELD INTENSITY Medvedeva O.A., Kalutsky P. V.
Microbiology, Virology, Immunology Department of the Kursk State Medical University, Kursk
The effect of licopid immunomodulator on mucin large intestine micro flora and blood neutrophil functional-metabolic activity indicators of mice with gentamicin - inducing dysbiosis under the influence of varying magnetic field intensity was studied. It has been established that the application of licopid promotes the marked influence not only on the neutrophils functional-metabolic activity, but also on the composition of the mucin large intestine microflora. Moreover, the direction of the investigated indicators of the phagocytal process changes to a certain extent correlates with the character of the normal micro flora changes.
Keywords: dysbiosis, magnetic fields, intestine micro flora, neutrophils, licopid.
В настоящее время обязательным и важнейшим при нарушениях микроэкологии кишечника является устранение причин их возникновения и эффективная терапия основного заболевания [1]. Коррекция нарушенного микробиоценоза включает элиминацию условно-патогенных микроорганизмов, коррекцию питания, введение пищевых добавок и субстратов [15, 16, 17, 19], способствующих колонизации кишечника облигатной микрофлорой, препаратов, содержащих нормальную микрофлору и конкурирующую с условно -патогенной, стимуляцию иммунитета, регуляцию скорости транзита кишечного содержимого [18, 20].
С целью проведения иммунотерапии используются препараты, представляющие собой класс синтетических, биотехнологических и природных веществ, способных влиять на функционирование как всей иммунной системы, так и отдельных её звеньев и вследствие этого изменять силу, характер и направленность иммунных реакций организма.
Сегодня арсенал иммуностимулирующих препаратов достаточно велик. В России зареги-
стрировано более 300 препаратов данной группы. В последнее время достаточно широко применяется отечественный иммуномодулятор ликопид, который является аналогом естественного компонента стенок бактерий, отвечающим за иммуномодулирующий эффект. Действие ликопида в наибольшей степени приближено к процессу естественной иммунорегуляции. С этим связана хорошая переносимость препарата больными.
Возможность расширения этиопатогенетиче-ской терапии дисбиотических состояний за счёт иммунотропных лекарственных средств в литературе уже освещалась. В литературе представлены результаты комплексного обследования и лечения с использованием препарата ликопид [12, 13] детей с рецидивирующим течением дисбактериоза кишечника, однако цель настоящего исследования состояла в изучении влияния иммуномодулятора ликопид на пристеночную микробиоту толстого кишечника и функциональные характеристики фагоцитов в условиях экспериментального дисбиоза, вызванного введением антибиотика и влиянием магнитного поля аномальных характеристик.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперимент проводили на мышах-самцах линии СВА массой тела 18-20 граммов. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных" [11]. Животные содержались при одинаковых условиях в отношениях температуры, влажности и освещения, а также рациона питания и были разделены на 5 групп. Мыши 1-й группы находились при фоновых значениях геомагнитного поля на территории г. Курска - напряжённость поля 0,45 эрстеда (ГМП-контроль); у животных
2-й, 3-й, 4-й и 5-й опытных групп моделировали дисбиоз. При этом мыши 2-й и 4-й групп находились в аномальном магнитном поле (АМП) с напряжённостью 3 эрстеда при предварительном «омагничивании» до моделирования экспериментального дисбиоза в течение 2 недель, а также всё остальное время эксперимента. Животные 3-й и 5-й групп находились при фоновых значениях геомагнитного поля на территории г. Курска. Экспериментальный лекарственный дисбиоз моделировался путём ежедневного внутрибрюшин-ного введения 0,2 мл раствора гентамицина в течение 5 дней. Затем в опытных группах 2 (АМП-коррекция) и 3 (ГМП-коррекция) проводили
3-недельную коррекцию нормофлоры введением иммуномодулятора ликопида в дозе, рассчитанной согласно инструкции с пересчётом на единицу массы животных (препарат вводили per os при помощи калиброванной канюли). В 4-й (АМП-дисбиоз) и 5-й (ГМП-дисбиоз) опытных группах животные не получали препарат для коррекции нормофлоры.
Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводилось по методике Л.И. Кафарской и
В.М. Коршунова [2, 5] после вывода животных из
эксперимента по окончании опыта при помощи декапитации. Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника освобождались от химуса и взвешивались в стерильных условиях. После этого материал помещался в стерильный раствор фосфатного буфера рН 7,0 в соотношении 1:10 и выдерживался в нём 2 часа для разжижения муцина. Затем из исследуемого материала готовились мазки, которые окрашивались по Граму, и производилось разведение исследуемого материала до концентраций 10-2 - 10-4. Одинаковый объём (0,1 мл) каждого разведения взвеси помещали в соответствующую жидкую питательную среду или на поверхность соответствующей среды и распределяли по поверхности питательной среды стерильным стеклянным шпателем (табл. 1). Посевы инкубировали при температуре 370С и соответствующей концентрации кислорода в атмосфере. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью микробиологического анализатора "Multiskan-Ascent" и коммерческих тест систем: ЭНТЕРОтест-16, СТАФИтест-16, Стреп-тотест-16, Эн-КОККУСтест-16 ("Лахема" (Чехия)); АР1 50 CHL - для идентификации лактобацилл и бифидобактерий ("Биомерье"). Количество бактерий в 1 грамме материала рассчитывали исходя из числа выросших колоний микроорганизмов (КОЕ) при посеве из максимального разведения, где отмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объём посевного материала. Для расчёта использовали формулу: К=Е/к^*п, где К - колониеобразующая единица, Е - общее количество бактерий, к - количество внесённого материала, v - количество чашек Петри, п - разведение. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали как ^ КОЕ/г массы биологического материала [4, 5, 6, 10].
Для оценки функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови у животных на модели фагоцитоза частиц латекса
Таблица 1
Схема посева суспензий биоптатов кишечника мышей для бактериологического исследования пристеночной микрофлоры
Питательные среды Выделяемые микроорганизмы Разведения суспензии пристеночного муцина
МРС агар Лактобактерии 0 1 ; 0 1
Эндо Энтеробактер; Е.соН 0 1 ; 0 1
Среда № 10 Стафилококки 0 1 ; 0 1
Сабуро Дрожжеподобные грибы 0 1 ; 0 1
Висмут-сульфит агар Сальмонеллы; цитробактер 0 1 ; 0 1
Бифидо-агар Бифидобактерии 0 1 ; 0 1
Кровяной агар Стафилококки, стрептококки, энтерококки 0 1 ; 0 1
изучали показатели активности, интенсивности, завершённости фагоцитоза, кислородзависимой и кислороднезависимой активности бактерицидных систем, а также уровень миелопероксидазы.
Активность фагоцитоза рассчитывали как процент нейтрофилов, принимающих участие в фагоцитозе, из общего числа сосчитанных. Интенсивность фагоцитарного процесса характеризовалось фагоцитарным числом (ФЧ), представлявшем среднее число частиц латекса, поглощённых одним фагоцитом из числа сосчитанных полиморфноядерных лейкоцитов. О полноценности процесса фагоцитоза судили по его завершённости (ЗФ) и индексу активности фагоцитов (ИАФ), который определяли как число фагоцитированных частиц латекса, умноженное на процент фагоцитирующих клеток и разделённое на число подсчитанных клеток [7].
Активность кислородзависимых бактерицидных систем нейтрофилов оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия - НСТ-теста [3, 9, 14]. При этом наряду с показателями спонтанного и стимулированного зимозаном НСТ-теста определяли индекс стимуляции нейтрофи-лов, который рассчитывали как отношение диформазан-позитивных клеток в стимулированной реакции к диформазан-позитивным клеткам в спонтанной реакции. Функциональный резерв нейтрофилов определялся как разница между диформазан-позитивными клетками в стимулированной зимозаном реакции и диформазан-позитивными клетками в спонтанной реакции НСТ-теста.
Состояние кислороднезависимых бактерицидных систем нейтрофилов оценивалось по среднему гистохимическому коэффициенту (СГК) при постановке лизосомально-катионного теста [6]. Уровень миелопероксидазы (МП) определялся цитохимически по методу Грехема-Кнолля [8].
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием критериев Вилкоксона, Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса, Фридмана и непараметрического варианта критерия Ньюмена-Кейлса.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
После курса приёма иммуномодулятора лико-пида в двух опытных группах (АМП-коррекция и ГМП-коррекция) количество микроорганизмов, идентифицированных как кишечная палочка, практически достигло уровня контроля (ГМП-контроль) (табл. 2). Значение КОЕ/г в группе животных АМП-коррекция составило ^ 4,7±0,25, что статистически не отличалось от группы кон-
троля (р<0,05). В опытной группе животных ГМП-коррекция, находившихся в условиях воздействия геомагнитного поля фоновых характеристик и экспериментального дисбиоза, этот показатель был ниже и составил lg 4,47±0,2.
Гемолитические варианты кишечных палочек, энтерококков и стафилококков не высевались ни в контрольной, ни в опытных группах. Значение КОЕ/г микроорганизмов рода Enterobacter в группе АМП-коррекция увеличилось на 6% и составило lg 5,72±0,3, а в группе ГМП-коррекция уменьшилось до lg 4,15±0,18.
Представители рода Salmonella выделялись как в контрольной, так и в опытных группах. В группе АМП-коррекция значение показателя составило lg 5,77±0,3, что на 12% превышало значения контроля (lg 5,14±0,25). В группе, находившейся в условиях фонового геомагнитного поля значение КОЕ/г было достоверно ниже показателя контроля и составило lg 3,11±0,14.
Среди микроорганизмов муцинового слоя кишечника мышей в группе ГМП-коррекция цит-робактер был не обнаружен, тогда как в группе АМП-коррекция значение КОЕ/г этих бактерий составило lg 3,98±0,24, что достоверно меньше значений контроля (lg 6,07±0,34).
Негемолитические энтерококки присутствовали как в контрольной, так и в опытных группах коррекции. Содержание негемолитических энтерококков в группе АМП-коррекция установлено на уровне lg 5,32±0,31, что не только больше, чем в группе ГМП-коррекция (lg 4,58±0,23), но и достоверно превышает показатели контроля (lg 3,83±0,18).
Стрептококки в опытных группах не были выделены, тогда как значение КОЕ/г этих бактерий в контрольной группе составляло lg 4,8±0,2.
Негемолитические стафилококки не определялись в составе нормофлоры животных контрольной (ГМП-контроль) и опытной (АМП-коррекция) групп. Однако в группе животных, находившихся в условиях воздействия магнитного поля фоновых характеристик, значение КОЕ составило lg 4,13±0,2.
Представители дрожжеподобных грибов рода кандида не входили в состав флоры муцинового слоя толстого кишечника мышей контрольной группы и группы АМП-коррекция. В опытной группе ГМП-коррекция отмечено появление данных микробов, их значение показателя КОЕ/г составило lg 3,41±0,18.
Количество таких представителей облигатной флоры, как лактобактерии, в группе АМП-коррекция восстановилось на 92% (lg 5,88±0,4), а в группе ГМП-коррекция - только на 69% (lg 4,38±0,2) по отношению к контролю (lg 6,39±0,34). Аналогичная картина наблюдалась и в
Таблица 2
Десятичный логарифм численности представителей мукозной микрофлоры кишечника экспериментальных и контрольных групп животных в пересчёте на 1 грамм биоптата
Наименование группы Микроорганизмы ГМП- контроль, M±m A]^- дисбиоз, M±m AМП-коррекция, M±m ГМП- дисбиоз, M±m ГМП-коррекция, M±m
Lactobacillus spp. 6,39±0,34 5,01±0,4* 5,88±0,4 4,6±0,22 4,38±G,2*
Bifidobacterium spp. 5,37±0,25 3,84±0,2* 4,1±0,21* 3,25±0,2* 4,8±0,22*
E.coli 4,83±0,28 3,45±0,36* 4,7±0,25 4,5±0,41 4,47±0,2
E.coli hem."+" G G G G G
Enterobacter spp. 5,41±0,26 3,9±0,25* 5,72±0,3 3,98±0,33* 4,1±0,18*
Salmonella spp. 5,14±0,25 4,8±0,54* 5,77±0,3 6,1±0,65* 3,11±0,14*
Citrobacter spp. 6,07±0,34 3,27±0,13* 3,98±0,24* G* G*
Streptococcus spp. 4,8±0,2 G* G* G* G*
Enterococcus spp. 3,83±0,18 5,41±0,25* 5,32±0,31* 4,85±0,1* 4,58±0,23*
Enterococcus spp. hem."+" G G G G G
Staphylococcus spp. G 5,12±0,25* G 5,01±0,1* 4,13±0,2*
Staphylococcus spp. hem."+" G 4,73±0,5* G G G
Candida spp. G 5,0±0,21* G 5,63±0,28* 3,41±0,18*
Примечание: * - р<0,05 по отношению к данным в группе ГМП-контроль.
Таблица 3
Функционально-метаболическая активность нейтрофилов крови экспериментальных и контрольных групп животных
Наименование группы Показатели^\^^ функционально метаболической активности ГМП- контроль A]^- дисбиоз A]^- коррекция ГМП- дисбиоз ГМП- коррекция
Фагоцитарная активность, % 52,2±2,9 62,64±5,G1* 52,96±2,65 52,2±1,04 39,77±1,99*
Фагоцитарное число 1,67±0,1 2,42±0,2* 1,69±0,08 1,67±0,03 1,27±0,06*
Завершённость фагоцитоза, % 78,8±0,4 97,0±8,2* 79,94±4,0 78,8±1,57 60,04±3,0*
Индекс активности фагоцитов 0,87±0,1 1,5±0,1* 0,88±0,04 0,875±0,01 G,66±0,03*
НСТ-спонтанный, % 21,8±0,1 20,88±1,67 15,5±0,76* 17,4±1,34* 14,5±0,73*
НСТ-стимулированный, % 32,4±1,86 26,6±2,1* 32,1±1,61 32,4±0,64 27,6±1,38*
Индекс стимуляции нейтрофилов 2,9±0,14 2,5±0,2* 2,93±1,15 2,89±0,05 2,20±0,11
Функциональный резерв нейтрофилов 18,5±0,98 12,15±0,9* 18,72±0,94 18,45±0,36 14,06±0,70*
МП 55,0±2,9 66,9±2,9* 55,80±2,79 55,2±3,1 41,90±2,10*
СГК 12,5±0,68 16,2±0,9* 12,68±0,63 13,8±0,7* 9,52±0,48*
Примечание: * - p<0,05 по отношению к данным группы ГМП-контроль.
отношении бифидобактерий. Так, в АМП-коррекция количество бифидобактерий восстановилось на 76% (^ 4,1±0,21), а в ГМП-коррекция -на 89,4% (^ 4,8±0,22) по отношению к контролю (^ 5,37±0,25).
Иммунологическое обследование мышей с экспериментальным дисбиозом кишечника выявило иммунопатогенетическую основу стойкого нарушения кишечного биоценоза в виде функционального дефицита клеток
фагоцитарного ряда с угнетением резервного бактерицидного потенциала нейтрофилов (табл. 3). Иммунный статус мышей с дисбиотическими состояниями характеризовался уменьшением антигенной стимуляции и коррекцией количественно-функциональных показателей клеток фагоцитарного ряда в условиях как фонового геомагнитного, так и аномального магнитного полей при применении ликопида. При этом изменения
иммунологических показателей коррелировали с улучшением микробиологической картины кишечного пейзажа.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что использование иммуномодулятора ликопида способствует не только устранению иммуносупрессии, вызванной введением антибиотика в условиях воздействия искусственного магнитного поля, но и восстановлению количественного и качественного состава пристеночного микробиоценоза толстого кишечника экспериментальных животных. Кроме того, установлено, что более выраженный эффект иммуномодуляторов наблюдается в условиях воздействия магнитного поля аномальных характеристик.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барановский А.Ю. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. 2-е изд. - СПб: Питер, 2002. - 209 с.
2. Богданова Е.А. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта крыс при пероральном введении пробиотических препаратов // Вест. РАМН. - 2006. - № 2. - С. 6-10.
3. Виксман М.Е. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия (Метод. рек.). - Казань, 1979. - 14 с.
4. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника крыс // Журн. микробиологии. -2005. - № 3. - С. 61-65.
5. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта
крыс // Журн. микробиологии. - 2005. - № 6. - С. 37.
6. Несвижский Ю.В., Богданов Е.А., Зверев В.В., Воробьев А.А. Микробиоценоз пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс с индуцированным дисбиозом // Журн. микробиологии. -2007. - № 3. - С. 57-60.
7. Назаренко Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. - М.: Медицина,
2000. - 650 с.
8. Нарциссов Р.П. Критерии лабораторной диагностики болезней // Лаб. дело. - 1964. - № 3. -
С. 150-151.
9. Бажора Ю.И., Тимошевский В.Н., Протченко П.3., Головченко А.Н. Определение функциональной активности нейтрофилов в тесте восстановления нитросинего тетразолия // Лаб. дело. - 1981. -№ 4. - С. 198-200.
10. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта с соавт. Изд в 2-х томах. - М.: Мир. -1997. - 800 с.
11. Приказ МЗ СССР N 755 от 12.08.77 "О мерах по дальнейшему совершенствованию форм работы с использованием "экспериментальных животных"
12. Чернецова Л.Ф., Костоломова Г.А. Ликопид в лечении дисбактериоза у детей // Terra medica. -
2001. - № 2. - С.38-40.
13. Чернецова Л.Ф., Костоломова Г.А., Орлова М.Д. и др. Эффективность ликопида в коррекции дисбио-тических состояний у детей // Тюменский медицинский журнал. - 2000. - № 3-4. - С. 54.
14. Шубич М.Г. Выявление катионных белков в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология. - 1974. - № 10. - С. 1321 -1322.
15. Bengmark S. Colonic food: pre- and probiotics /
S. Bengmar // Am. J. Gastro-enterol. - 2000. -Vol. 95, № 1. - P. 55-57.
16. Brown A.C., Valiere А. Probiotics and medical nutrition therapy // Nutr. Clin. Care. - 2004. - Apr-Jun. -Vol. 7 (2). - P. 56-68. Review.
17. Camilleri M. Probiotics and irritable bowel syndrome: rationale, mechanisms, and efficacy // J. Clin. Gastroenterol. - 2008. - Sep. - 42. - Suppl 3 Pt 1. - P. 123125.
18. Chou C.C., Hou J.W. Growth of bifidobacteria in soymilk and their survival in the fermented soymilk drink during storage // Int. J. Food Microbiol. 2000. -Vol. 56, N 2-3. - P. 113-121.
19. Gill H.S., Rutherfurd K.J., Gross M.L., Gopal P.K. Enhancement of immunity in the erderly by dietary supplementation with the probiotic Bifidumbacterium lactis HN019 / // Am. J. Clin. Nutr. — 2001. — Vol. 74, № 6. — P. 833-839.
20. Marteau P., SeksikP., Jian R. Probiotics and intestinal health effect: a clinical perspective // Brit. J. Nutr. -
2002. - Vol. 88, N 3(suppl). - P. 430-436.
21. Mercenier A., Pavan S., Pot B. Probiotics as biothera-peutic agents: present knowledge and future prospects // Curr. Pharm. - 2003. - Des. - Vol. 8. - P. 99-110.
