CC BY
67
4. Кошелев, Д.И. Параметры зрительных вызванных потенциалов и характеристики движений глаза при фиксации у испытуемых с нормальным зрением / Д.И. Кошелев, А.В. Пономарев, И.В. Сироткина // Физиология адаптации: Материалы 1-й Всероссийской науч.-практ. конф. - Волгоград, 2008. - С.23-26.
5. Кошелев, Д.И. Особенности движений глаза при фиксации неподвижного объекта учащихся первых и четвертых классов в норме и при миопии / Д.И. Кошелев, Р.А. Мухамадеев, И.В. Сироткина // Оздоровление средствами образования и экологии: Материалы V Междунар. науч.-практ. конф. - Челябинск, 2008. - С. 146-148.
6. Филин, В.А. Автоматия саккад / В.А. Филин. - М.: Изд-во МГУ, 2002. - 240с.
7. Шагас, Ч. Вызванные потенциалы мозга в норме и патологии / Ч.Шагас. - М., Мир, 1975. С.315.
8. Ярбус, А.Л. Роль движений глаз в процессе зрения / А.Л. Ярбус. - М.: Наука, 1965. - 166с.
УДК 612.018
Елисеева О.С, Киреева Н.А., Першина А.С.,
Буторина О.Л., Бикбулатова С.М., Гарипова М.И.
Башкирский государственный университет
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ИНСУЛИНА С ПОВЕРХНОСТЬЮ ЭРИТРОЦИТОВ И СОСТАВА ГОРМОНТРАНСПОРТИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Показано, что в обеспечении инсулиндепонирующей функции эритрона принимают участие специфические и гидрофобные взаимодействия. Установлено, что транспортирующий гормоны комплекс плазмы крови является общим для гидрофильных и гидрофобных гормонов. Наряду с инсулином в него включаются гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон) и гидрофильные (тиреотропный гормон, пролактин, лютеинизирующий гормон) гормоны, а также триглицериды и холестерол. Ядро комплекса формируют альбумин, a-фетопротеин и трансферин.
Ключевые слова: инсулин, эритроциты, гормоны, плазма крови, гидрофобные взаимодействия.
Впервые предположение об участии эритроцитов в транспорте инсулина в крови человека сформулировано в работах Л.И. Сандуляк и соавторов [1,2]. В работах этих авторов сформулирована гипотеза о инсулиндепонирующей функции эритроцитов. Показано [3,4], что коэффициент распределения инсулина между эрит-роном и плазмой крови в крови здоровых доноров составляет 0,52. Известно, что несмотря на то, что эритроциты не относятся к классическим чувствительным к инсулину клеткам, на их плазматической мембране присутствуют рецепторы к этому гормону [1]. Одна из функций рецепторов к инсулину, локализованных на поверхности эритроцитов, вероятно, заключается в доставке гормона к периферическим тканям. Однако, существует возможность того, что в формировании фракции связанного с эритроцитами инсулина, принимают также гидрофобные взаимодействия. Цель данного исследования - оценить роль гидрофобных взаимодействий во взаимодействии инсулина с эритроцитами, определить состав белков транспортирующего гормоны комплекса плазмы крови человека, а также состава транспортируемых им гормонов.
Объекты и методы исследования
Коэффициент распределение инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови оценивали с использованием ранее описанного метода. Для оценки распределения инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови получен инсулин, меченный перокси-дазой, по методу Fare и Nakane с использованием человеческого генно-инженерного инсулина хумулин Р производства фирмы Lilly France S.A. Предложенный метод определения коэффициента распределения инсулина между рецепторами поверхности эритроцитов и транспортными белками сыворотки крови заключается в определении соотношения пероксидазной активности, связанной с поверхностью эритроцитов, к активности пероксидазы в плазме крови после инкубации с исследуемой пробой крови рабочего разведения коньюгата инсулина с пероксида-зой, выполняющей роль маркерного фермента [4]. В контроле определялось распределение несвязанной с инсулином пероксидазы в пробах крови с использованием как физиологических условий, так и 1,М хлорида натрия рН 4,0. Определение коэффициентов распределения меж-
ду эритроцитами и плазмой крови в пробах крови здоровых доноров проводили в физиологических условиях (0,14М хлорид натрия, забуфе-ренный 0,01М фосфатным буфером рН 7,2). Вклад гидрофобных взаимодействий во взаимодействии инсулина с поверхностью эритроцитов оценивали при торможении специфического связывания меченного пероксидазой инсулина в присутствии немеченого гормона. Для исследования отобраны пробы крови 30 здоровых добровольцев 20-25 лет.
Выделение транспортирующего гормоны комплекса плазмы крови человека проводили методом аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным инсулином по ранее описанному методу [5]. Концентрацию гормонов в пробах определяли на автоматическом анализаторе АтеЛат с использованием наборов АтегШе (Амерлайт) конкурентным методом по инструкции, прилагаемой к набору реактивов. Определение содержания в пробах а1-кислого гликопротеина и трансферина проводили методом иммунонефелометрии при помощи диагностических наборов фирмы Иммуно-тех (Россия) по прилагаемой инструкции. Им-муноферментное определение человеческого альбумина и а-фетопротеина в выделенных аффинно пробах проволили с использованием диагностических наборов фирмы Иммунотех (г.Москва) по прилагаемой инструкции. Гельх-роматографию на Сефадексе G-75 проводили по стандартной методике [6].
Результаты и обсуждение
Установлено, что при конкурентном торможении связывания меченного пероксидазой инсулина со специфическими рецепторами плазматической мембраны эритроцитов свободным гормоном, с поверхностью эритроцитов связывается 14±1,32% меченного пероксидазой инсулина, соответственно коэффициент распределения инсулина в этих условиях составил 0,16. Вероятно, уровень связывания инсулина эритроцитами в этих условиях отражает вклад гидрофобных взаимодействий в формировании фракции инсулина, связанной с плазматической мембраной эритроцитов. Таким образом, установлено, что в формировании инсулинде-понирующей емкости эритрона принимают участие гидрофобные взаимодействия.
Ранее показано, что в крови человека инсулин транспортируется в составе комплекса, ядро которого формируют белки крови [3]. Методом иммуноферментного анализа установлено, что в состав белков, формирующих транспортирующий гормоны комплекс в крови здоровых доноров входит 0,015±0,0007 мг/мл альбумина. Методом иммунонефелометрии в пробах обнаружен трансферин - транспортный белок крови с подвижностью Ь-глобулинов, что согласуется с результатами Н.К. Грачевой и соавторов [7]. Трансферин, согласно современным представлениям, относится к классу липокали-нов и принимает участие в транспорте широкого спектра биологически активных соединений [8]. По данным иммуноферментного анализа, в состав транспортного комплекса также входят гликопротеин с доказанной транспортной, иммуномодулирующей и детоксицирующей функцией а-фетопротеин (6,7±0,3 нг/мл).
Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что в крови здоровых доноров в состав связывающего инсулин комплекса входят транспортные белки, в том числе, альбумин, а-фетопротеин и трансферин.
Наличие в составе гормонтранспортиру-ющего комплекса трансферина, относящегося к липокалинам, послужило основанием для изучения содержания в полученных фракциях липидов. В полученных аффинно гормон-транспортирующих фракциях проведено определение холестерола и триглицеридов. В пробах здоровых доноров содержание холес-терола составило 0,07±0,0004 ммоль/л, содержание триглицеридов - 0,1010±0,003 ммоль/ л. Вероятно, полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемый комплекс транспортирует широкий спектр гидрофобных биологически активных соединений.
Установлено, что в состав изучаемого комплекса входят следующие гидрофобные гормоны: тироксин (11,0±0,5 нмоль/л), трийодтиро-нин (1,3 ±0,06 нмоль/л), тестостерон (7,0±0,03 нмоль/л). Достоверного различия в содержании липидов и гидрофобных гормонов во фракциях здоровых доноров и больных сахарным диабетом не выявлено. В то же время, в составе связывающих инсулин фракций выявлены незначительные количества белковых гормонов: 1МЕ/мл лютеинизирующего гормона, 0,03
мкМЕ/мл тиреотропного гормона, 0,5 МЕ/мл пролактина. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что изучаемый комплекс транспортирует не только гидрофобные соединения, но и белковые гормоны.
Проведено разделение белков, принимающих участие в транспорте гормонов, методом гельхроматографии при рН 2,8 и физиологическом значении рН. При рН 2,8 исследуемые белки разделились на два пика, соответствующие молекулярному весу более 100 тысяч Д и около 50 тысяч Д. После плавного доведения рН до физиологических значений при гельхроматографии исследуемого комплекса белков получен один пик, соответствующий молекулярному весу более 100 тысяч Д. Вероятно, это свидетельствует о том, что при физиологических условиях исследуемые белки ассоциируют, формируя ядро гормонтран-спортирующего комплекса.
Таким образом, установлено, что транспортирующие инсулин белки плазмы крови при физиологических значениях рН формируют транспортный комплекс, ядро которого в норме формируют альбумин, a- фетопротеин и трансферин. Выявленный транспортный комплекс является общим для ряда гидрофильных и гидрофобных гормонов. Комплекс, наряду с инсулином, включает примерно 50% всего содержащегося в сыворотке трийодтиронина, зна-
чительный процент тестостерона и других гидрофобных гормонов, а также некоторое количество белковых (пролактина) и гликопротеид-ных (лютеинизирующего и тиреотропного) гормонов. Можно предположить, что транспортный комплекс содержит оптимальное для клеток соотношение гормонов и его биологическое значение заключается в обеспечении дублирующего механизма доставки гормонов за счет клеточных рецепторов к транспортным белкам.
Показано, что в крови здоровых доноров при физиологических условиях инсулин распределяется между поверхностью эритроцитов и плазмой крови с коэффициентом распределения 0,52. В среднем с эритроцитами в крови обследованных здоровых доноров связано 33,03±2,66%.
Показано, что у лиц, занятых на нефтеперерабатывающих производствах, происходит достоверное изменение состава белков ядра транспортирующего гормоны комплекса: в гормонт-ранспортирующих комплексах, выделенных из крови 35 лиц, работающих на предприятиях нефтеперерабатывающей промышленности, обнаружено присутствие 2,6±0,036 нг/мл а1-кислого гликопротеина - белка острой фазы воспалительной реакции. Возможно, изменение состава белков транспортирующего гормоны комплекса может служить причиной нарушений транспорта гормонов в крови обследованных.
Список использованной литературы:
1. Сандуляк Л.И. Эритроциты как депо и система транспорта инсулина // Доклады Академии наук С С С Р.-1974.-т. 219.-№4.-с. 1020 - 1021;
2. Сандуляк Л.И, Ковалев В.П. - Иммунофлуоресцентный метод выявления инсулина в эритроцитах.-Проблемы эндокри-нологии.-1978.-т. 24.-№5.-с. 77 - 78.
3. Гарипова М.И. Транспорт инсулина в крови человека. - Уфа.- РИЦ БашГУ.-2007.-127 С.(б);
4. Першина А.С., Киреева Н.А., Елисеева О.С, Гарипова М.И. Изучение эритроцитарного транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа.- Вестник Оренбургского государственного университета.-В печати.
5. Гарипова М.И.. В.Ю., Умнова, Л.И Штыкова, Пиндюрина Т.Е. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа.//Вестник Баш.гос.ун-та.-2005.-№4.- с.44-46.
6. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука.-1985.-536 С.
7. Грачева Н.К., Харитоненков И.Г. Изучение «связанного инсулина» сывороток крови доноров и больных сахарным диабетом методом кругового дихроизма. // Лабораторное дело.-1977.-стр.8-13.
8. Flower, D.R. the Lipocalin Protein Family: Structure and Function.// Biochem. J. -1996.- v. 318.- p. 1-14.
