Методологические подходы к диагностике пароксизмальной ночной гемоглобинурии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

HEMAГОLOGY

© коллектив авторов,2016

УДК 616.633.963.42-039

Плеханова О.С., Наумова Е.в., Луговская С.А., Почтарь М.Е., Бугров И.Ю., Долгов Б.Б.

МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ ПАРОКСИЗМАЛЬНОЙ НОЧНОЙ ГЕМОГЛОБИНУРИИ

Кафедра клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава РФ, 123995, г. Москва

Представлена диагностика пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ). ПНГ - орфанное заболевание, характеризующееся отсутствием GPI-якоря на клетках крови в результате мутации гена PIG-A на коротком плече Х-хромосомы. Некоторые белки, связанные с GPI-якорем, выполняют функцию защиты от активации компонентов комплемента и образования мембранатакующего комплекса (МАК). Наиболее подвержены действию МАК эритроциты, подвергающиеся разрушению в кровеносном русле. Поэтому одним из основных признаков ПНГ является комплемент-зависимый внутри-сосудистый гемолиз, показатели которого длительное время играли ключевую роль в диагностике ПНГ. Современным методом диагностики ПНГ является проточная цитометрия. Рекомендовано направлять на исследование ПНГ-клона пациентов с гемолизом неясного генеза, тромбозом церебральных вен и вен живота, тромбоцитопенией и макроцито-зом, а также больных с апластической анемией, миелодиспластическим синдромом, миелофиброзом. Для диагностики ПНГ используется международный протокол, рекомендованный Международным обществом клинической цитометрии (2010 г.). Нами разработан метод оценки ретикулоцитов с целью выявления ПНГ-клона. Доказана высокая корреляция размера ПНГ-клона, измеренного среди ретикулоцитов согласно предложенному способу, с ПНГ-клоном в числе грануло-цитов и моноцитов, определенных согласно международному стандартизованному подходу.

Ключевые слова: пароксизмальная ночная гемоглобинурия; проточная цитометрия; моноклональные антитела.

Для цитирования: Плеханова О.С., Наумова Е.В. , Луговская С.А. , Почтарь М.Е. , Бугров И.Ю., Долгов В.В. Методологические подходы к диагностике пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (3): 151-154, 167,168. DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-3-151-154, 167,168.

Plekhanova O.S., NaumovaE.V., LugovskayaS.A., PotchtarM.E., BugrovI.Yu., Dolgov V.V.

the methodical approaches to diagnostic of night paroxysmal hemoglobinuria

The Russian medical academy of post-graduate education of Minzdrav of Russia, 123995 Moscow, Russia

The article presents diagnostic of night paroxysmal hemoglobinuria. The night paroxysmal hemoglobinuria is an orphan disease characterized by absence of GPI-anchor on blood cells as a result of mutation of PIG-A gene on the .short arm of X-chromosome. The particular proteins bounded with GPI-anchor implement function of defense from activation of components of complement and development of membrane-attacking complex. The erythrocytes exposed to destruction in bloodstream are among the most impacted. Therefore, one of the main signs of night paroxysmal hemoglobinuria is complement-depending intravascular hemolysis which indicators for a long time played a key role in diagnostic of night paroxysmal hemoglobinuria. The actual technique of diagnostic of night paroxysmal hemoglobinuria is flow cytometry. The analysis of night paroxysmal hemoglobinuria clone is recommended to patients with hemolysis of unclear genesis, thrombosis of cerebral and abdominal veins, thrombocytopenia and macrocytosis and also patients with AA, myelodysplastic syndrome, myelofibrosis. The international protocol recommended by the International Society of Clinical Cytometry (2010) is implemented to diagnose night paroxysmal hemoglobinuria. The original technique of evaluation of reticulocytes was developed with purpose to detect night paroxysmal hemoglobinuria clone. The high correlation was substantiated between size of night paroxysmal hemoglobinuria clone measured among reticulocytes according to proposed mode and night paroxysmal hemoglobinuria clone measured among granu-locytes and monocytes detected according international standardized approach.

Keywords: night paroxysmal hemoglobinuria; flow cytometry; monoclonal antibodies

For citation: plekhanova o.s., Naumova E.v., Lugovskaya s.A., potchtar M.E., Bugrov I.Yu., Dolgov W The methodical approaches to diagnostic of night paroxysmal hemoglobinuria. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2016; 61 (3): 151-154, 167,168 (in Russ.) DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-3-151-154, 167,168

For correspondence: NaumovaE.V., candidate of medical sciences, assistant professor of the chair of clinical laboratory diagnostic. e-mail: naum@mail.ru

conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. financing. The study had no sponsor support.

Received 30.11.2015 Accepted 15.12.2015

Для корреспонденции: Наумова Елена Владимировна, канд. мед. наук, доцент каф. клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» МЗ РФ, 123995, г. Москва, e-mail: E_naum@mail.ru

ГЕМАТОЛОГИЯ

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) - редкое приобретенное клональное заболевание, развивающееся в результате экспансии одного или нескольких клонов ге-мопоэтических стволовых клеток с соматической мутацией РЮ-А (phosphatidylinositol glycan-class A) гена, который локализуется на Х-хромосоме [1-4]. Данный генетический дефект приводит к нарушению синтеза гликозилфосфатиди-линнозитолового (GPI) якоря, осуществляющего фиксацию целого ряда молекул на мембране клеток крови [5]. Клинически ПНГ характеризуется хроническим внутрисосудистым комплементопосредованным гемолизом [6-8], рецидивирующими тромбозами, часто с необычными локализациями (печеночные, мезентериальные, нижняя полая, портальная, церебральные вены и др.) [9, 10], развитием недостаточности костного мозга, приводящей к панцитопении, и других редких симптомов [10, 11]. Также для ПНГ характерны анемия, гемоглобинурия, тромботические осложнения, дисфагия, вялость, эректильная дисфункция, хроническая почечная недостаточность, легочная гипертензия.

Патогенез клинических проявлений заболеваний связан с гемолизом эритроцитов в результате атаки системой комплемента через образование мембраноатакующего комплекса (МАК), который в норме инактивируется присутствием на эритроцитах GPI-связанных белков CD55, CD59 [12]. Молекула cD55 является одной из блокаторов постоянной активации (посредством С3- и С5-конвертаз) системы комплемента и защищает клетки от образования на их поверхности МАК и постоянной продукции С5а- и С5Ь-компонентов комплемента. В случае отсутствия CD55 за счет повышенной концентрации С5а происходит активация лейкоцитов и тромбоцитов, возникают воспаление и тромбозы. Важную роль в механизме патогенеза также играет CD59, препятствующий компоненту c9 внедриться в комплекс c5b-c8 с образованием МАК. В результате эритроциты подвергаются компле-ментопосредованному лизису. На эритроцитах при наличии ПНГ-клона можно наблюдать как частичное (ПНГ-клон II типа), так и полное отсутствие (ПНГ-клон III типа) GPI-якоря и соответственно CD55 и CD59.

ПНГ-клон может возникать при апластической анемии (АА), аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА), миело-диспластическом синдроме (МДС), миелофиброзе. Возрастная медиана возникновения ПНГ 30-35 лет. Заболеваемость ПНГ от 1 до 10 на 1 млн человек. Смертность без лечения при ПНГ составляет около 35% в течение 5 лет от начала заболевания, 50% - через 10 лет [13].

В настоящее время выделяют 3 формы ПНГ:

• классическая форма с характерными клиническими признаками, описанными выше;

• ПНГ, развивающаяся при АА (АА/ПНГ), МДС (МДС/ ПНГ), а также миелофиброзе (идиопатический миелофиброз/ ПНГ), в этом случае у больных имеются клинические и /или лабораторные признаки гемолиза, а также обнаруживается ПНГ-клон;

• субклиническая форма ПНГ. В этом случае клинические и лабораторные признаки гемолиза отсутствуют, однако в периферической крови обнаруживается ПНГ-клон, чаще минорный (менее 1%). Таким пациентам рекомендуется проводить повторные исследования с частотой 6-12 мес для мониторинга нарастания размера клона и прогрессии гемолиза [13].

До недавнего времени в терапии ПНГ существовал в основном паллиативный подход. Применялись трансфузия эритроцитарной массы, антикоагулянты, стимуляторы гемо-поэза, а также кортикостероиды и андрогены (в клинической практике не было проведено подтверждающих эффективность клинических исследований). В результате этих подходов есть определенные риски (например, опасность инфицирования и риск перегрузки железом при трансфузиях; повышения риска

кровотечения при приеме антикоагулянтов; усиление кроветворения и как следствие экспансии ПНГ-клона с усилением гемолиза) [10]. Одна из терапевтических опций - трансплантация костного мозга [14]. Однако показаны невысокая выживаемость пациентов и наступление реакции трансплантат против хозяина примерно в половине случаев [15]. Для лечения ПНГ также используют иммуносупрессивные препараты - циклоспорин А и антитимоцитарный глобулин [16].

В 2007 г. в Евросоюзе и США, а в 2011 г. в России был зарегистрирован препарат экулизумаб (компания Alexion) как фармацевтическое средство для лечения пациентов с ПНГ

[17]. Экулизумаб представляет собой гуманизированные моноклональные антитела, связывающиеся специфически с С5-комплемента, препятствующих, таким образом образованию терминального комплекса комплемента (С5Ь-С9 и С5а) и предотвращающих запуск механизма внутрисосудистого гемолиза.

Разработка нового препарата послужила причиной развития более точных методов диагностики, в основном проточной цитометрии, позволяющей выявить наличие ПНГ-клона, его размер и тем самым подтвердить диагноз. Эффективность и адекватность лечения и мониторинга больных зависит от информативности диагностических мероприятий и полноты полученной информации.

Клинико-лабораторными признаками, повышающими возможность выявления ПНГ-клона, принято считать гипоплазию костного мозга, неясную цитопению, МДС, гемо-глобинурию, неясный тромбоз (артериальный, венозный), отрицательную прямую пробу Кумбса. При лабораторной диагностике ПНГ наблюдаются следующие изменения: пан-цитопения (75%), гипохромная анемия (90%), повышение уровня ЛДГ и свободного гемоглобина, снижение гаптогло-бина, гемоглобинурия, гемосидеринурия, ретикулоцитоз. Исторически для диагностики ПНГ использовались такие методы, как тест Хема (1936 г) и сахарозный тест [18, 19]. Оба способа показали повышенную чувствительность ПНГ-клонов эритроцитов к комплементу. Кислотная проба Хема

[18] основана на повышенной чувствительности эритроцитов больных ПНГ к кислой среде. Принцип теста заключается в том, что к сыворотке донора, сопоставимой с сывороткой больного по АВ0-системе антигенов, добавляют 0,2 N раствор НС1, изменятся pH сыворотки и в итоге вызывается активация комплемента.

Далее подкисленную сыворотку смешивают с суспензией отмытых эритроцитов. Результат пробы Хема оценивается визуально. В норме гемолиз не превышает 5% клеток, при ПНГ он достигает более 50%. При этом минимально определяемый размер клона 4,2-5%.

Сахарозная проба Хартмана [19] основана на повышенной чувствительности эритроцитов больного ПНГ к комплементу в присутствии сахарозы. К эритроцитам больного добавляют свежую сыворотку донора, идентичную по группе крови больного, и раствор сахарозы в кислом буфере. После центрифугирования супернатант оценивается на предмет видимого гемолиза. Если он наступает, его степень, выраженная в процентах, высчитывается из концентрации гемоглобина супернатанта, которая определяется цианметгемоглобино-вым методом.

Эти тесты достаточно громоздки и практически не дают конкретных данных. Их недостатками являются невозможность количественной оценки результата и слабая чувствительность [20].

Более специфичным стал метод, позволяющий измерять степень гемолиза при различных концентрациях комплемента [21]; этот анализ показал, что ПНГ-клетки лизируются при более низких концентрациях, чем нормальные. Он также подтвердил, что некоторые пациенты с

ПНГ имеют популяцию клеток с промежуточной чувствительностью к комплементу (тип II) между нормальными эритроцитами (тип I) и самыми аномальными эритроцитами (тип III). Тем не менее проведенный тест тоже оказался трудоемким, сложно стандартизируемым и, применяя его, можно пропустить небольшие популяции аномальных клеток.

Определение мутации гена PIG-A не используется для диагностики ПНГ, несмотря на высокую специфичность.

На сегодняшний день золотым стандартом является проточная цитометрия. Характеристика клеток крови при ПНГ с помощью данного способа была введена в 1986 г, с 1996 г рассматривается как метод выбора для постановки диагноза ПНГ. Анализ клеток на наличие ПНГ-клона, проведенный с использованием проточной цитометрии, имеет в настоящее время важнейшее значение для мониторинга заболеваний с точки зрения прогрессирования, регрессии или ответа на терапию и скрининг малых клонов ПНГ (< 1 %) у пациентов с АА или МДС.

Исторически сложилось отсутствие единообразия в выборе моноклональных антител (МКА) различными лабораториями. Это может быть в значительной степени связано с существованием МКА против различных GPI-якорных белков, использование которых может определить в той или иной степени ПНГ-клон, особенно при классической форме ПНГ, где такие клетки преобладают.

Протокол по диагностике ПНГ на основе определения дефицита экспрессии CD55 и CD59 на эритроцитах был разработан в 2001 г [22]. Этот способ нашел широкое применение среди лабораторий. Однако в дальнейшем стало очевидно, что оценка содержания эритроцитов с недостаточностью этих белков не позволяет судить об истинных размерах ПНГ-клона, поскольку эритроциты подвергаются гемолизу, после гемотрансфузий изменяется соотношение нормальных и ПНГ-позитивных эритроцитов [23]. Помимо этого было показано, что определение экспрессии cD55 не позволяет четко разделить эритроциты II и III типов (частично или полностью лишенные GPI-якоря). В дальнейшем принцип диагностики был построен на детекции GPI-связанных белков на гранулоцитах, моноцитах, эритроцитах.

По мере исследования GPI-связанных молекул лабораториями предлагались различные комбинации антител для обнаружения ПНГ-клона [24, 25]. Кроме того, все более широкое использование проточной цитометрии для обнаружения малых клонов увеличило различия между реагентами, так как некоторые из них, эффективно выявляющие большие ПНГ-популяции, не обладают высокой чувствительностью для малых клонов.

Одним из реагентов, доступных для изучения GPI-связанных антигенов на лейкоцитах на данный момент, является люминесцентный aerolysin или FlAER (fluorescently labeled inactive toxin aerolysin). FLAER - бактериальный токсин аэролизин, меченный флуоресцентными метками, связывающийся непосредственно с GPI-якорем [26, 27]. Он секретируется как неактивный протоксин, проаэролизин, конвертируемый в активную форму путем протеолитическо-го расщепления С-терминального пептида. Аэролизин связывается со структурами клеточной поверхности и образует олигомеры, формируя каналы и приводя к клеточному лизису. Изначально этот реагент был использован для демонстрации резистентности ПНГ-эритроцитов к аэролизину. Для создания реагента, связывающего GPI, но с подавленной литиче-ской активностью, были проведены две точечные мутации. Путем объединения мутантного проаэролизина с флуоресцентной меткой (Alexa Fluor 488), получен реагент (FLAER), метящий клетки, содержащие GPI-связанные белки. Так как FLAER выявляет непосредственно GPI-якорь, он может быть использован для исследования всех типов клеток перифери-

HEMATOLOGY

ческой крови кроме эритроцитов, которые не экспрессируют необходимые активирующие протеазы [27].

Преимуществом этого метода является возможность тестирования гранулоцитов и моноцитов в одной пробе, недостатком - невозможность проведения теста при очень низком количестве гранулоцитов, что наблюдается при апластиче-ской анемии [28]. В отличие от антител против многих GPI-связанных антигенов его связывание является менее чувствительным к этапам созревания клеток.

После появления ПАЕК выявление ПНГ-клона стало рутинным тестом во многих лабораториях. Сравнение различных клонов антител разных фирм-производителей позволило определить наиболее эффективные, по итогам чего создан протокол, который в настоящее время рекомендован Международным обществом клинической цитометрии (ICCS) как основной протокол диагностики ПНГ (2010 г) [11].

Согласно этому подходу исследуется наличие GPI-связанных белков среди гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов. Для оценки ПНГ-клона среди эритроцитов предложено использовать CD235а (ИТС) - панэритроцитарный маркер и СD59 (РЕ) - GPI-связанный белок, экспрессия которого оценивается на гистограмме эритроцитов. Для оценки ПНГ-клона среди гранулоцитов и моноцитов используются комбинации:

1) комбинация МКА для определения ПНГ-клона среди нейтрофилов ПАЕК ^ТС)^15 (РЕ)/^24 (РегСР)^45 (РЕ-Су7) GРI-связанные маркеры в данной комбинации -ПАЕК и CD24, гейтирующие - CD45 и СD15;

2) комбинация МКА для определения ПНГ-клона среди моноцитов ПАЕК ^ТС)^14РЕ^64РегСР^45РЕ-Су7, где GРI-связанные маркеры - ПАЕК и CD14, гейтирующие маркеры - CD45 и СD64.

В данном случае для стандартного исследования оценивается 5 тыс. гранулоцитов, для исследования ПНГ-клона методом высокочувствительной цитометрии - не менее 500 тыс. клеток.

Отсутствие GРI-связанных маркеров на клетках указывает на принадлежность их к ПНГ-клону. Согласно протоколу ICCS при дефекте GРI-связанных белков необходимо выявить:

• среди нейтрофилов - отсутствие экспрессии ПАЕК/ СD24, анализируя не менее 5 тыс. клеток;

• среди моноцитов - отсутствие экспрессии FLАЕR/СD14, количество анализируемых клеток варьирует;

• среди эритроцитов - отсутствие экспрессии CD59, при этом анализируя не менее 50 тыс. клеток. Клетки без дефицита CD59 - это нормальные эритроциты (I тип), клетки с частичным дефицитом экспрессии CD59 - ПНГ-клон II типа, клетки, не экспрессирующие CD59, т. е. эритроциты с полным дефицитом CD59 - это ПНГ-клон III типа.

Размер ПНГ-клона оценивается по проценту клеток (гра-нулоцитов, моноцитов, эритроцитов), среди которых наблюдается отсутствие GРI-связанных якорных белков.

Однако методика, предложенная ICCS, является достаточно дорогостоящей и трудоемкой, а анализ гранулоцитов наиболее информативен в течение 48 ч после взятия материала, так как далее происходит их дегрануляция. Согласно ICCS, проводить ПНГ-диагностику только по анализу экспрессии CD59 среди эритроцитов нельзя, так как они подвергаются комплементзависимому лизису, и истинный размер ПНГ-клона определить невозможно.

В результате последних исследований ряд авторов предлагают использовать для диагностики ПНГ, МКА к CD157 [30]. CD157 - GРI-связанный белок, экспрессируется как на моноцитах, так и на гранулоцитах. Это рецептор, который способствует реорганизации цитоскелета и значительных изменений формы клетки. Точкой приложения сигнала, проходящего в клетку, является изменение концентрации Са2+ в цитозоле клетки. Показано, что значения размеров ПНГ-

ГЕМАТОЛОГИЯ

клонов у пациентов разных групп (МДС, АА-ПНГ, ПНГ и т. д.), получившихся при использовании этого маркера с помощью 4- и 5-цветной проточной цитометрии, сопоставимы с таковыми при использовании реагента FLAER. При этом его связывание является достаточно чувствительным к этапам созревания клеток. В подобных работах для упрощения схемы анализа предложено заменить им cD14 и cD24 [31].

Достаточно часто у больных ПНГ выявляется большой размер клона среди гранулоцитов и моноцитов и минорный клон среди эритроцитов, что объясняется хроническим различной степени выраженности гемолизом, проведением трансфузион-ной терапии, снижением продолжительности жизни эритроцитов. В связи с тем что определение размера ПНГ-клона среди моноцитов и гранулоцитов представляется довольно трудоемким и дорогостоящим, было выдвинуто предположение о возможности выявления ПНГ-клона среди незрелых эритроцитов, которые не успели подвергнуться гемолизу ретикулоцитах.

В литературе описаны методы определения ПНГ-клона среди ретикулоцитов. В поисках флуоресцентного красителя для ретикулоцитов был предложен тиазол оранжевый [32]. Ретикулоциты можно отличить от зрелых эритроцитов по наличию в них остатков РНК, но ядросодержащие клетки при этом ошибочно будут тоже дифференцированы как ретику-лоциты. Также в литературе описан метод выявления рети-кулоцитов с помощью СD71 [33]. СD71 - трансмембранный гликопротеин, состоящий из двух идентичных мономеров (молекулярная масса 90-95 кДа), соединенных дисульфид-ной связью, рецептор к трансферрину.

В работе N.J. Tsagarakis и соавт. [33] у 15 больных с ПНГ и АА проведена оценка ПНГ-клона на ретикулоцитах, выделенных с использованием CD71 и CD59, и сопоставлена со значениями ПНГ-клона среди гранулоцитов, выделенных с помощью CD66b/CD16/CD45 и CD59/CD24/CD45. Оценка ре-

зультатов проводится на однопараметрических гистограммах. Согласно данному методу минимальный размер определяемого ПНГ-клона среди гранулоцитов составляет 1%, а среди ретикулоцитов - 5%. Предложенный метод протестирован на небольшом количестве пациентов с ПНГ (п = 8) и пациентов с ПНГ-клоном менее 1% (п = 7) (при его оценке на гранулоцитах и менее 5% при определении на ретикулоцитах). При этом среди образцов крови пациентов с подозрением на ПНГ не было таковых с размером клона от 1 до 24%, что не дает полной картины о корреляции значений в этом диапазоне. Предложенный авторами подход затрудняет гейтирование ретикулоцитов из-за отсутствия в панели панэритроцитарного маркера (CD235a), что особенно необходимо для выделения чистой популяции и отсечки дебриса и дуплетов. Кроме того, для объективной оценки ПНГ-клона необходимо оценивать десятки тысяч клеток. В протоколе данного анализа использовались 6 видов моноклональных антител (МКА), причем некоторые из них используются дважды, что в результате отражается на увеличении стоимости используемой панели МКА. Этот способ не решает задачи достоверного выявления минорных ПНГ-клонов и не является доказательным в плане высокой чувствительности метода.

В связи с тем что ПНГ относится к редким заболеваниям, большая часть пациентов, направленных для ее диагностики, как правило, не будут являться ПНГ-позитивными. Следовательно, встала актуальная задача разработки скринингового теста для выявления ПНГ-клона с использованием минимальной панели МКА, который обладает высокой достоверностью, точностью и чувствительностью, сопоставимой с международной стандартизованной методикой. Этот метод должен определять наличие ПНГ-клона как значительного размера у пациентов с истинной ПНГ, так и минорных клонов - (до 1%), у пациентов с АА и МДС.

Предлагаемый протокол для оценки ПНГ-клона среди эритроцитов (а-d) [11]; схема проведения анализа ПНГ-клона среди ретикулоцитов, выделенных по CD71 (a, b, e-h). На представленном графике ПНГ-клон присутствует среди эритроцитов в размере 0,8% (II + III тип) и среди ретикулоцитов в размере 3,6% (II + III тип). PNHret (g, й)-гейт, в котором отображен ПНГ-клон на ретикулоцитах.

Продолжение см. на 167 стр.

REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDUCATiON

ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

© титов в.н., шойбонов б.б., 2016 УДК 577.115.3

Титов В.Н.1, Шойбонов Б.Б.2

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОГЛОЩЕНИЯ КЛЕТКАМИ НЕЭТЕРИФИЦИРОВАННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ; АЛЬБУМИН, КАВЕОЛИН, КЛАТРИН И ЛИПИДСВЯЗУЮЩИЕ БЕЛКИ ЦИТОПЛАЗМЫ (ЛЕКЦИЯ)

1ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России, Москва; 2ФГБНУ «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина» РАН, Москва

С позиций филогенетической теории общей патологии ожирение и метаболический синдром являются патологией жировых клеток, однако первое - это патология филогенетически ранних висцеральным жировыгх клеток (ВЖК) сальника; они обеспечивают субстратами энергии реализацию биологических функций трофологии, гомеостаза, эндоэкологии и адаптации. ВЖК сальника не имеют рецепторов к инсулину, адаптивно синтезируют лептин и для них не характерна биологическая реакция пролиферации. Ожирение - патология поздних в филогенезе подкожных адипоцитов; они инсу-линзависимы и обеспечивают субстратами энергии реализацию одной биологической функции локомоции - движения за счет сокращения поперечнополосатый: миоцитов. Адипоциты в плане адаптации синтезируют гуморальный медиатор адипонектин и активно реализуют биологическую реакцию пролиферации. При обоих афизиологичных состояниях возрастает пассивное, по градиенту концентрации поглощение клетками не связанных с альбумином свободных жирных кислот (СЖК) в неионизированной форме в составе мицелл. Пассивное, афизиологичное поглощение клетками СЖК, которые при внутриклеточной компартментализации не окисляют митохондрии, приводит к синтезу, накоплению три-глицеридов (ТГ) в цитоплазме клеток, которые физиологично этого не делают. Афизиологичное поглощение клетками СЖК, этерификация их в ТГ, в частности в филогенетически поздних в-клетках островков и столь же поздних кардио-миоцитах, которые жирные кислоты de novo не синтезируют, приводит к формированию афизиалогичныи: процессов и нарушению функции. С позиций биологии эти клетки in vivo подвержены гибели по типу апоптоза. Образование телец апоптоза нарушает биологическую функцию эндоэкологии, активируя биологическую реакцию воспаления.

Ключевые слова: жирные кислоты; неэтерифицированные жирные кислоты; свободные жирные кислоты; альбумин; кавеолины; клатрин.

Для цитирования: Титов В.Н., Шойбонов Б.Б. Физико-химические, биологические основы поглощения клетками неэте-рифицированных жирных кислот; альбумин, кавеолин, клатрин и липидсвязующие белки цитоплазмы (лекция). Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (3): 155-166. DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-3-155-166. Titov V.N.1, Shoibonov B.B.2

the physical chemical, biological basics of cells absorption of unesterified fatty acids; albumin, caveolin, clathrin and lipid-binding proteins of cytoplasm (the lecture)

1The Russian cardiologic R&D production complex of Minzdrav of Russia, 121552 Moscow, Russia; 2The P.K. Anokhin research institute of normal physiology of the Russian academy of sciences, Moscow

From a position of phylogenetic theory of general pathology, obesity and metabolic syndrome are pathology of fatty cells. However, the first is a pathology ofphylogenetically early visceral fatty cells ofomentum. They supply with substratum ofenergy realization of biologic function of trnphology, homeostasis, endoecology and adaptation. The visceral fatty cells of omentum have no receptors to insulin and synthesize adaptively insulin and they are not characterized by biologic reaction of proliferation. The obesity is a pathology of late in phylogenesis subcutaneous adipocytes. They ate insulin-dependent and supply with substratum of energy realization of one biologic function of locomotion - movement at the expense of constriction of cross-striated miocytes. The adipocytes in terms of adaptation synthesize humoral mediator adiponectin and actively implement biologic function of proliferation. Under both aphysiologic conditions increases passive by gradient of concentration, absorption by cells albumin-unbound free fatty acids in unionized form in micellae's composition. The passive aphysiologic absorption of free fatty acids by cells which under intracellular compartmentalization don't oxidize mitochondria results in synthesis, accumulation of triglycerides in cytoplasm of cells which don't implement it physiologically. The aphysiologic absorption of free fatty acids by cells, their etherification in triglyceride, in particular, in phylogenetically late в-cells of islets and either late cardiomyocytes which fatty acids don't synthesize de novo results in development of aphysiologic processes and disorder of function. From position of biology, these cells in vivo are subjected to loss similar to apoptosis. The formation of corpuscles of apoptosis compromise biologic function of endoecology activating biologic reaction of inflammation.

Keywords: fatty acids; unesterified fatty acids; free fatty acids; albumin; caveolin; clatrin

Для корреспонденции: Титов Владимир Николаевич, д-р мед. наук, проф., руководитель лаборатории клинической биохимии липопротеинов Института клинической кардиологии ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ, 121552, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15-а, e-mail: vn_titov@mail.ru

3AOHHAA AKAflEMMfl nOCAEfll/irTOMHOro O6PA3OBAHMfl

For citation: Titov V.N., Shoibonov B.B. The physical chemical, biological basics of cells absorption of unesterified fatty acids; albumin, caveolin, clathrin and lipid-binding proteins of cytoplasm (the lecture). Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2016; 61 (3): 155-166. (in Russ.)

DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-3-155-166.

For correspondence: Titov V.N., doctor of medical sciences, professor, head of laboratory of clinical cardiology of Institute of clinical cardiology of The Russian cardiologic R&D production complex of Minzdrav of Russia. e-mail: vn_titov@mail.ru Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Financing. The study had no .sponsor support.

Received 19.11.2015 Accepted 15.12.2015

Согласно предложенной нами филогенетической теории общей патологии, биологическая реакция эндоцитоза, сформированная на самых ранних ступенях филогенеза, на аутокринном (клеточном) уровне, явилась далее основой реализации клетками, паракринно регулируемыми сообществами клеток, органами и организмом многих биологических функций: трофологии (питания), биологической функции гомеостаза, биологической функции эндоэкологии и функции адаптации. У клеток-экзотрофов, начиная с древних архей, биологическая реакция эндоцитоза (поглощение из внеклеточной среды) является основой обеспечения их как субстанциями для построения клеточных структур, так и субстратами для наработки клетками биологически трансформируемой энергии в форме аденозинтрифосфа-та, в реакции АТФ ^ АДФ ^ АТФ. Трудно представить, что столь ранние в филогенезе биологические реакции, как внеклеточное пищеварение, составляют основу патогенеза афизиологичных процессов in vivo у высших животных, приматов и вида Homo sapiens. Нарушение биологической функции трофологии, функции питания является основой формирования всех «метаболических пандемий», болезней цивилизации. И если частота неинфекционного заболевания в популяции превышает 5-7%, основой патогенеза таких процессов (нозологических форм заболеваний) является нарушение биологических функций и биологических реакций, которые сформировались на ранних ступенях филогенеза. Это в полной мере относится ко всем «метаболическим пандемиям», болезням цивилизации.

Трудно составить представление о последовательности всех вариантов эндоцитоза, которые реализованы клетками последовательно на ступенях филогенеза в течение миллионов лет. Согласно методологическому приему общей биологии - преемственности становления биологических

функций и биологических реакций, основное внимание уделено совершенствованию того, что сформировано на более ранних ступенях филогенеза. Наиболее ранним субстратом, который начали поглощать самые древние клетки археи с целью наработки энергии, можно полагать, стала уксусная кислота - неорганический ацетат, циклический диацетат и в конечном итоге в клетке - ацетил-КоА. Позже на ступенях филогенеза субстратом для наработки энергии в митохондриях архей стали гидрофильные метаболиты масляной кислоты - кетоновые тела (ацетоацетат и Р-гидроксибутират). В то же время уже С4 масляная кислота является гидрофобной, не говоря о коротко-, средне- и длинноцепочечных жирных кислотах (ЖК), для переноса которых в гидрофильной, межклеточной среде необходимы белки-переносчики. Они доставляют ЖК к клеткам; преодолеть же бислой полярных фосфолипидов (ФЛ) плазматической мембраны клеток ЖК помогают белки-транспортеры. Все биохимические и физико-химические реакции in vivo в полной мере определены индивидуальными параметрами каждой из ЖК. На самых ранних ступенях филогенеза, на уровне древних архей, полных экзотрофов, «речи» о глюкозе еще многие миллионы лет не было.

Какими бы ни были варианты поглощения клетками ЖК в полярный форме неэтерифицированных ЖК (НЭЖК), в ионизированном или неионизированном состоянии, алгоритм поглощения и окисления ЖК митохондриями является единым. 1. Белки-переносчики в межклеточной (внешней) среде доставляют НЭЖК к плазматической мембране клеток, связывая ЖК с мембраной. 2. Белок-транспортер формирует переход ионизированной НЭЖК через бислой полярных ФЛ в цитоплазму клеток. 3. Белки-переносчики доставляют НЭЖК в клетках от плазматической мембраны к митохондриям. 4. Индивидуальные ЖК с разной константой скорости реакции, физико-химически и с биохимической активацией, проходят внутреннюю мембрану митохондрий.

Эти параметры индивидуальные физико-химические особенности каждой из ЖК и определяют производительность, эффективность, количество наработанного в цикле Кребса и дыхательной цепи макроэргического АТФ. Различают 3 типа эндоцитоза: а) жидкофазный, жидкостный; б) неспецифичный сорбционный и в) специфичный рецептор-ный. Согласно филогенетической теории общей патологии, для преодоления бислоя полярных ФЛ плазматической мембраны первой на ступенях филогенеза последовательно отработана: а) система эндоцитоза - фагоцитоза - пиноцитоза (рис. 1); б) позже - система кавеолинами опосредованного эндоцитоза и в) миллионами лет позже - специфичный, высокоэффективный рецепторный эндоцитоз; обусловлен он функцией филогенетически позднего белка клеток клатри-на. При жидкофазном эндоцитозе в кавеоле и эндосоме находилась межклеточная среда с растворенными (взвешен-

REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDUCATiON

Рис. 1. Биологическая реакция эндоцитоза.

а - эндоцитоз с переходом ферментов из лизосом в образованные вакуоли с поглощенными частицами; б - эндоцитоз и слияние эндосом с лизосомами. 1 - связывание липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) с плазматической мембраной гепатоцитов; 2 - погружение в цитоплазму; 3 - первичные лизосомы.

ными) макромолекулами; со стенками «впячивания» они не взаимодействовали. При кавеолярном эндоцитозе субстраты связывались с внутренней поверхностью эндосомы силами гидрофобного взаимодействия и при рецепторном, клатринзависимом эндоцитозе это стало взаимодействием лиганд - рецептор.

Филогенетически ранний кавеолярный, дорецепторный эндоцитоз. Кавеолины - группа белков, ассоциированная с мембраной клеток, которая обеспечивает ранний в филогенезе не рецепторный, не столь специфичный, но все-таки эффективный эндоцитоз. У позвоночных животных выявлены 3 типа кавеолина со сходной структурой: кавеолин-1, кавеолин-2 и кавеолин-3. В мембране клеток кавеолин, не будучи интегральным протеином, собирается в олигомеры, связывает спирт холестерин (ХС) и гидрофобные ФЛ (сфинголипиды) в локальных участках клеточной мембраны, в структуре рафтов, плотов. Это фрагменты плазматической мембраны, которые бактериальные клетки в процессе симбиотического слияния «приватизировали» от древних архей. На ранних ступенях филогенеза одновременно произошла «приватизация» бактериальными клетками: а) фрагментов плазматической мембраны митохондрий - выраженно гидрофобных рафтов с системами поглощения ЖК, как СБ36; б) митохондрий с биохимическими реакциями цикла Кребса и физико-химическими реакциями дыхательной цепи вместе с митохондриальным геномом и в) семейства белков - переносчиков ЖК в цитоплазме клеток. Выраженно гидрофобные плоты, рафты в клеточной мембране располагаются между наружным и внутренним монослоями полярных ФЛ.

У филогенетически ранних кавеол белки кавеолины обеспечивают инвагинацию плазматической мембраны, «захват» переносимых субстратов путем изменения состава липидов в мембране, а не путем специфичного окружения протеинами; это характерно для более позднего в филогенезе клатринового эндоцитоза. Вероятно, кавеолины принимают участие в оптимизации структуры липидов в составе ранних рафтов от архей при взаимодействии с функци-

ональными липидами мембран - фосфатидилхолином (ФХ) и полярным спиртом ХС. «Отшнуровывание» кавеосомы от плазматической мембраны производит белок динамин. После этого кавеолы доставляют содержимое в кавеосому, сходную с эндосомой, либо путем трансцитоза переносят на противоположный конец функционально полярной клетки. Кавеосома может далее сливаться с другой кавеосомой или с первичной эндосомой. Таким эндо+экзо в итоге трансцито-зом происходит, к примеру: а) перенос альбумина в эпителии проксимальных канальцев нефрона и б) интернализация рецепторов к инсулину в подкожных адипоцитах.

Кавеолы формируют плазматические везикулы на мембране всех клеток. Изменение кривизны кавеол отражает разные этапы инвагинации эндосом. Кавеолы - динамичные структуры мембраны, которые изменяют форму в ответ на связывание субстрата и формируют в итоге жидкостный эн-доцитоз. Кавеолы осуществляют эндоцитоз макромолекул белка, гликопротеинов и ионов. Пока не найдено маркеров, которые позволили бы специфично охарактеризовать этот филогенетически ранний вариант жидкостного эндоцитоза. Кавеолы при эндоцитозе позволяют клеткам поглощать и низкомолекулярные вещества, в частности витамины, тоже часто ассоциированные с альбумином. Кавеолы задействованы и в функции АТФ-зависимых, рециркуляторных кассетных АВС-транспортеров.

Кавеолы транспортируют в клетки малые молекулы и ионы; действие кавеолина можно нарушить, если сорбировать полярный спирт ХС из наружного монослоя мембраны. Это доказывает важную роль ХС в формировании гидрофобного стриарного (исчерченного) покрытия - белков кавеолинов. Инкубация клеток с филлипином или нистатином приводит

Рис. 2. Схема основных путей эндоцитоза.

1 - клатринзависимый эндоцитоз (Кла); 2 - макропиноцитоз (МП), фагоцитоз с участием нитей актина; 3 - кавеолинзависимый эндоцитоз (Кав) - альтернативный вариант поглощения субстратов. Кавеолы - гидрофобные домены мембраны при действии белка кла-трина. ОВ - окаймленные клатриновые везикулы. ЯП - поры в мембране ядра. Лизос. - лизосомы.

ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Рис. 3. Строение кавеолы, «впячивание» плазматической мембраны и расположение специфичного белка клатрина. гаЬ - комплекс протеинов с неясной функцией и микротрубочек.

к полной деструкции кавеол на поверхности плазматической мембраны. Одновременно в этих условиях ни клатриновое покрытие, ни актин, ни другие структуры клеточной мембраны при сорбции ХС из мембраны структуры не меняют. В кавеолах располагаются специфичные, заякоренные в раф-тах плазматической мембраны белки, которые функционально связаны с трансмембранными протеинами и реализуют специфичные функции (рис. 2).

Кавеолы формируются в структуре более гидрофобных, филогенетически ранних доменов (рафтов, плотов), от архей, которые содержат кавеолин. Этот вид эндоцитоза является менее изученным; функциональной особенностью кавеол является то, что они не «зациклены» на переносе поглощенных клеткой субстратов только в лизосомы. Вероятно, сочетанно это функциональные пути поглощения, формирования филогенетически ранних структур в клетках, которые призваны исполнять и ранние физиологичные функции трофологии, гомеостаза, реализовать биологическую функцию эндоэ-кологии и адаптации, в частности биологическую реакцию внеклеточного пищеварения.

Кавеолы связывают, поглощают и эндосомы, которые иные клетки путем экзоцитоза выводят (секретируют) в кровоток. Подобные экзо-эндосомы могут переносить и ре-гуляторную информацию для иных клеток; эндосомы могут содержать гуморальные, гормональные медиаторы, как это происходит в синапсах вегетативной нервной системы, а также микроформы ДНК. Эндосомы рассматривают как один из возможных, наиболее ранних вариантов общения клеток в рамках паракринно регулируемых сообществ. Некоторые авторы именуют такую гипотетичную регуляторную функцию эндосом термином «бутылочная почта».

Филогенетически поздний клатриновый, рецепторный эндоцитоз. Клатрин - консервативный фибриллярный белок (мол. масса 180 кД), который вместе с другим полипептидом (мол. масса 35 кД) формирует по сути многогранный «че-

хол» на поверхности окаймленных везикул. Основным структурным компонентом его служит трехвалентный белковый комплекс (трискелион); состоит он из трех цепей полипептида клатрина и трех меньших по размеру полипептидов. Трискелионы образуют на поверхности окаймленных пузырьков сетки из шести- и пятиугольников. Остальные белки, входящие в состав мембраны окаймленных пузырьков, видимо, отвечают за связывание клатриновой оболочкой разных специфичных рецепторов на окаймленных ямках и эндосомах из клеточной мембраны (рис. 3).

Филогенетически более поздний, кла-тринзависимый эндоцитоз характеризует то, что связующими субстраты компонентами при формировании кавеол и действии кла-тринов являются специфичные рецепторы, которые связывают столь же специфичные лиганды. Начинается процесс эндоцитоза с инвагинацией плазматической мембраны, формирования окаймленных клатрином ямок и последующего обособления окаймленных клатриновых везикул при действии белка динамина. В эндоцитозе задействованы и нити фибриллярного белка актина. Ма-кропиноцитоз характеризует формирование впячиваний мембраны с активным участием нитей фибрина. После инвагинации плазматической мембраны поглощенные везикулы переносят субстраты к первичным эндосомам. После этого поглощенный субстрат может быть: а) выведен в межклеточную среду при действии рециркулирумых эндо-сом или б) перенесен в поздние эндосомы и далее лизосо-мы для утилизации. Направленное перемещение субстратов в цитоплазме обеспечивают микротрубочки цитоплазмы и вспомогательные протеины (рис. 4).

Несмотря на изложение многих сведений, до сих пор не описаны функционально-кинетические свойства ни для одного из белков плазматической мембраны, которые связывают ЖК. Все полученные сведения относятся к характеристике структур, а не функции. Белки-транспортеры реально связывают ЖК, но не катализируют химические изменения в молекуле; они обеспечивают необходимую стабильность гидрофобных веществ во вне- и внутриклеточном пространствах и перемещение их между органеллами клеток. Большинство транспортных систем подвержены адаптивной регуляции: гормоны регулируют транспорт субстратов через мембрану, в частности аминокислот, путем экспрессии синтеза переносчиков с большей мерой специфичности и аффинности. Гормоны изменяют интенсивность транспорта субстратов при гиперполяризации мембран - повышение проницаемости для К+ и снижение - для №+. Такой же результат проявляется при воздействии на активность клеточной помпы - №+, К+-АТФазы. Часть экзогенных субстратов и медиаторов попадает в клетки в заряженной форме. Распределение их между клеткой и средой зависит от величины трансмембранного потенциала. Приведенные данные указывают и на транспорт в клетки ксенобиотиков путем пассивной облегченной диффузии. Эти системы наиболее чувствительны к действию ингибиторов биохимических реакций.

Транспорт ЖК через плазматическую мембрану перво-

REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDUCATiON

начально рассматривали как пассивную диффузию. Однако измерение кинетических параметров прояснило, что транспорт длинноцепочечных ЖК в клетках осуществляют белки-транспортеры. Выделены и охарактеризованы 5 белков плазматической мембраны, которые с высокой аффинностью связывают ЖК. Полагают, что эти белки участвуют и в транспорте ЖК через мембрану; из них удалось клонировать: а) белок плазматической мембраны, связывающий ЖК; б) интегральную транслоказу ЖК и в) белок, переносящий ЖК в цитоплазме.

СБ36-транслоказа ЖК состоит из двух доменов: один - с короткой цепью, расположен в цитоплазме, второй - с большим гликированным, внеклеточным доменом в форме петли; вероятно, он «втягивает» ЖК в мембрану «как бы петлей». Этот интегральный белок плазматической мембраны связывает длинноцепочечные ЖК с высоким сродством, перенося их через плазматические мембраны; однако это не активный, а только активированный транспортоблегченная диффузия. Последовательность остатков аминокислот белка в рецепторах к липопротеинам (ЛП) частично гомологична СБ36; поэтому он может быть и рецептором для ЛП, а также медиатором адгезии и агрегации тромбоцитов. Аминокислотная последовательность его идентична аспартатаминотрансферазе митохондрий. Это, вероятно, пример того, как один белок на разных ступенях филогенеза может быть задействован в реализацию разных функций в зависимости от его локализации в разных компартментах клеток. Белки - переносчики ЖК имеют разные №концы, среди которых выделяют 5 групп и единый консервативный домен, обращенный в цитоплазму.

Белки, переносящие ЖК в форме полярных НЭЖК в межклеточной среде. Структурное сходство альбумина, который с высокой аффинностью связывает в межклеточной среде насыщенные ЖК (НЖК) и мононенасыщенные ЖК (МЖК), а-фетопротеина, который более активно ассоциирует ненасыщенные ЖК (ННЖК) и полиненасыщенные ЖК (ПНЖК) и витамин Б-связывающего белка, а в равной мере и их ге-

Рис. 4. Рецепторное поглощение клетками лигандов с образованием последовательно окаймленной ямки, пузырька и эндосомы. Образование структуры триске-лиона и функция белка динамина. ГТФ - гуанозинтрифосфат.

нов, которые экспрессируют синтез, указывает, что они члены одного семейства функциональных протеинов. Витамин D-связывающий белок взаимодействует с мембраной клеток, включая субпопуляции Т- и В-лимфоцитов. Во всех трех белках тиоэфирные связи (S-S) расположены почти одинаково. У крыс при генетически обусловленном отсутствии альбумина в крови постоянно высок уровень спиртов - ХС, три-глицеридов (ТГ) и ЛПВП; содержание в плазме крови апоВ-100 также повышено. На ступенях филогенеза становление функциональной активности этих протеинов произошло со-четанно.

При анальбуминемии в крови увеличивается содержание ТГ и ЭХС - эфиров ЖК со спиртом глицерином и спиртом ХС. У крыс линии Nagase при отсутствии альбумина основную массу ЖК к клеткам в форме полярных НЭЖК переносят ЛП, включая апоЕ/А-I ЛПВП у части видов животных. Одновременно при врожденной гипоальбуминемии синтез и секреция гепатоцитами секретируемого фермента - лецитинхолестеринацилтрансферазы (ЛХАТ) повышена. Не исключено, что в афизиологичных условиях в переносе ЖК к клеткам компенсаторно вовлечены и полярные ФЛ фосфатидилхолины (ФХ) с образованием лизофосфатидил-холинов.

У крыс линии Nagase при отсутствии in vivo инсулина перенос в крови НЖК и МЖК блокирован на уровне гидролиза ТГ, на этапе липолиза. Содержание в плазме крови ТГ повышено в 7 раз, ХС - в 4 раза, ФЛ - в 7 раз; в большей мере это выражено у самок. Одновременно в несколько раз повышена в плазме крови концентрация аполипопротеина апоА-I, апоЕ и апоВ-100. Особенно велико в крови содержание ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП); физиологично в ЛП низкой плотности (ЛПНП) превращается лишь небольшая часть апоВ-100 ЛПОНП. Если физиологично отношение ХС/ТГ в ЛПНП составляет 16-18, при гипоальбуминемии - только 4-6. Это следствие нарушения переноса к клеткам НЖК+МЖК в составе ЛПОНП при блокаде действия, в первую очередь, постгепариновой липопротеинлипазы (ЛПЛ). При этом уровень фракционного катаболизма ЛПОНП не нарушен; активность ЛПЛ сохранена, но нет акцептора продуктов реакции; некому связывать НЭЖК, что физиологично и осуществляет альбумин. При этом способность апоЕ/В-100-рецепторов на плазматической мембране инсулинзависимых клеток также сохранена. Причиной накопления в крови пальмитиновых и олеиновых ЛПОНП и гипертриглицеридемии является только ан- или гипоальбуминемия (рис. 4).

Отсутствие белка создает определенные проблемы и со связыванием ли-зоФХ, акцептором которого тоже является альбумин. Потенциально он является активным детергентом с выраженным гемолитическим действием; высокое содержание лизоФХ в крови инициирует гемолитическую анемию. При анальбу-минемии снижено в крови количество эритроцитов; отсутствие альбумина -причина анемии и повышения у крыс проницаемости эритроцитов для К+. Выраженного гемолиза все-таки не проис-

ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ходит; полярный лизоФХ, образуемый при действии ЛХАТ при синтезе моноэфиров ХС (моно-ЭХС), компенсаторно связывают ЛПВП.

Важно оценивать одновременно весь комплекс нарушений переноса НЖК+МЖК и ННЖК при отсутствии в крови альбумина. Повышение в крови ТГ указывает на нарушение переноса НЖК+МЖК в составе ЛПОНП, а гиперхолесте-ринемия - на блокаду поглощения клетками и накопление в крови пальмитиновых ЛПНП, которых в крови физиологично не бывает. Этерификация холестерином ПНЖК, как и перенос их из ЛПВП в состав ЛПОНП, не нарушена. Физиологично этерифицированные спиртом ХС полиеновые ЖК (поли-ЭХС) переходят в линолевые и линоленовые ЛПОНП. При этом большое количество НЭЖК связываются с ЛПНП. Добавление альбумина увеличивает перенос поли-ЭХС из ЛПВП в состав ЛПНП более значительно, чем у контрольных животных.

В отсутствие альбумина ЖК встраиваются и в поверхностный монослой ФЛ + ХС в ЛПОНП. Увеличение заряда ЛПОНП способствует формированию тройственного ассо-циата (ЛПВП + белок, переносящий полиеновые эфиры ХС, + ЛПОНП) и переходу поли-ЭХС по градиенту концентрации из ЛПВП в линолевые и линоленовые ЛПОНП. При анальбу-минемии содержание поли-ЭХС в ЛПНП увеличено. Спонтанная модель анальбуминемии раскрывает биологический вариант компенсаторного переноса ЖК в условиях дефекта генов. Несмотря на то что в межклеточной среде нет альбумина, гидролиз ТГ все-таки происходит. Освобожденные НЭЖК встраиваются в монослой полярных липидов в составе ЛП, а образованные диглицериды переходят в полярные по структуре ЛПВП. В составе ЛПВП диглицериды гидролизует диглицеролгидролаза. В составе ЛПВП раздельно (компар-тментализованно) происходит этерификация: а) экзогенных ПНЖК с образованием неполярной их формы - поли-ЭХС и б) эндогенного спирта ХС с образованием неполярной его формы - моно-ЭХС; этерификации ННЖК со спиртом ХС в ЛПВП не происходит.

В межклеточной среде основную массу экзогенных эссен-циальных ПНЖК ко всем клеткам переносят вначале ЛПВП, а далее у большинства видов животных ЛПНП; у некоторых видов животных ЛПВП. Усиление встраивания НЭЖК в состав ЛПНП изменяет их заряд, создавая условия более быстрого передвижения ЛП в электрическом поле. Одновременно отсутствие альбумина in vivo приводит к афизиологич-ным изменениям: развиваются отеки, явления миопатии и остеомаляции как симптомы врожденной патологии. У части пациентов с анальбуминемией формируется роговичная дуга - свидетельство сниженной активности ЛХАТ и нарушения оттока от клеток спирта ХС.

Для альбумина характерен полиморфизм генов: описано более 100 вариантов врожденно обусловленных изменений в первичной структуре. По частоте мутаций альбумин занимает 2-е место in vivo вслед за гемоглобином. Позитивно заряженные аминокислоты электростатически взаимодействуют с отрицательным зарядом карбоксильных групп ЖК. Формируются фракции афизиологичного альбумина и при воздействии двухвалентных катионов кадмия; это, как действие «химического оружия пищепрома», обусловливает развитие «пивной» гиперлипопротеинемии (ГЛП) типа V по Д. Фредриксону. Гетерогенность альбумина, которую выявляют при зональном электрофорезе на разных поддерживающих средах, происходит по причине: а) ассоциации альбумина с небелковыми компонентами двухвалентными катионами; б)

таутомерии в молекуле альбумина при наличии третичной структуры и в) полимеризации белка, формирования ди- и тримеров.

Поступление в клетку НЖК и МЖК из ассоциатов с альбумином. Взаимодействие альбумина с мембраной является этапом в поглощении клетками НЖК+МЖК; в большей мере это относится к гепатоцитам. Альбумин стимулирует поглощение клетками олеиновой МЖК при всех отношениях ее с белком-переносчиком. Кинетические параметры поглощения клетками олеиновой МЖК зависят от насыщенности ею альбумина и количества олеиновой МЖК, которое не связано с альбумином. При этом одновременно функционируют 2 процесса: активный и пассивный транспорт в клетки полярных НЖК + МЖК: первый - в связи с альбумином и второй - вне связывания. Последний процесс - поступление в клетки ЖК без заряда клетки регулировать не могут; нередко поступление оказывается пассивным и всегда афизиологичным. Меченые ЖК связываются с мембраной насыщаемым и нена-сыщаемым способами. Клетки поглощают олеиновую МЖК в ассоциации с альбумином и в пуле не связанных с альбумином свободных ЖК (СЖК) в форме мицелл.

Поглощение клетками олеиновой ЖК - результат контакта альбумина с белками плазматической мембраны; наружный монослой ФЛ+полярный ХС активируют диссоциацию с альбумином олеиновой МЖК. Кавеолы - место связывания клетками разных лигандов, перед тем как они будут поглощены путем эндоцитоза. Кавеолины связывают и альбумин, в отсутствие кавеолина клетки альбумин не связывают; механизмы этого окончательно не установлены. Связывание альбумина гепатоцитами, кардиомиоцитами, монослоем эндотелия является насыщаемым. «Рецепторы» к альбумину найдены на клетках монослоя эндотелия; они вовлечены в эндоцитоз альбумина + ЖК при взаимодействии его с филогенетически ранними кавеолинами.

Кавеолины обеспечивают преодоление плазматической мембраны при поглощении клетками длинноцепочечных ЖК путем диффузии через бислой полярных ФЛ. Взаимодействие с кавеолином характерно для связанных с альбумином ЖК; это не происходит только при гидрофобной ассоциации с мембраной мицелл СЖК. Взаимодействие альбумина с кавеолином не нарушает ни целостность, ни свойства мембраны; процесс характерен для поглощения МЖК+НЖК всеми филогенетически поздними миоцитами. Когда из миокарда морской свинки выделили белок, связывающий ЖК, при электрофорезе в геле агарозы он имел 4 полосы. Белок опосредованно влияет на активность АТФ/АДФ транслоказы митохондрий и микро-сомальной ацил-КоА-синтазы. Все субстраты для наработки энергии, которые поглощены кардиомиоцитами, поступают в митохондрии при функции филогенетически ранних белков цитоплазмы, которые переносят ЖК.

Гепатоциты физиологично поглощают только те ЖК, которые связаны с альбумином. Это происходит при тран-зиторном связывании альбумина с аффинными местами на поверхности кавеол; диссоциация альбумина из ассоциата с филогенетически поздним клартином определена скоростью, с которой гепатоциты поглощают ЖК. Полагают, что синусоиды в печени являются специфичными структурами, в которых происходит быстрое поглощение гепатоцитами ЖК при активированной диссоциации альбумина. Вероятно, в ассоциации альбумин - мембрана и происходит диффузия ЖК в наружный монослой ФЛ. Возможно, в кавеоле диссоциация и преодоление мембраны осуществлены и в более специфичных условиях. Когда кролику одновременно внутри-

венно инъецировали альбумин и витамин D-связывающий белок, второй протеин более быстро покидал плазму крови по сравнению с альбумином; период полувыведения альбумина составляет 5 дней. В отличие от альбумина витамин D-связующий белок более быстро подвергается экскреции с мочой. В моче метка альбумина найдена во фракции низкомолекулярных пептидов. Витамин D-связывающий белок - глобулин с мол. массой 58 кД, он имеет одно высокоаффинное место связывания.

В физиологичных условиях альбумин с высокой аффинностью связывает пальмитиновую, стеариновую НЖК, а также олеиновую МЖК; с ННЖК альбумин взаимодействует с меньшей аффинностью. Повышение в плазме крови уровня НЭЖК происходит при новообразованиях, сахарном диабете, ишемических нарушениях и гипоксии, при активном иммунном ответе и метаболическом синдроме. Повышение содержания в плазме крови НЭЖК ингибирует цитотоксич-ность Т-лимфоцитов. Связываясь с мембраной, альбумин приобретает иную конформацию; это инициирует фазовый, конформационный переход, обеспечивая диссоциацию ЖК с альбумина.

Структурной особенностью эндотелиальных пространств Диссе в печени является наличие специфичного эндотелия с фенестрированной базальной мембраной; эти клетки обеспечивают непосредственный контакт крови с оседлыми, филогенетически поздними, функционально специализированными макрофагами Купфера. Это функционально важная специализация; она ускоряет поглощение макрофагами Куп-фера эндогенных флогогенов (биологического «мусора»), экзогенных инфекционных патогенов и их быструю утилизацию. Надо сказать, что основную массу сформированных в кровотоке афизиологичных безлигандных пальмитиновых ЛПНП утилизируют тоже макрофаги Купфера в печени при реализации биологической функции эндоэкологии - поддержания «чистоты» межклеточной среды in vivo.

В условиях «относительного биологического совершенства» in vivo одновременно функционируют филогенетически поздняя утилизация эндогенных флогогенов специализированными оседлыми макрофагами печени и филогенетически более ранняя, менее совершенная утилизация биологического «мусора» в интиме артерий эластического типа. Ее совместно реализуют филогенетически ранние, немногочисленные специализированные оседлые макрофаги интимы артерий эластического типа и многочисленные филогенетически поздние, функционально слабо специализированные моноциты гематогенного происхождения; они ex tempore in situ в короткие сроки становятся функциональными моноцитами^макрофагами.

Особенности поглощения ЖК филогенетически поздними кардиомиоцитами. На плазматической мембране кар-диомиоцитов функциональные комплексы альбумин + ЖК в кавеолах подвергаются диссоциации. В миокарде альбумин взаимодействует с относительно высокоаффинными местами связывания на сарколемме клеток. Это взаимодействие обеспечивает диссоциацию ЖК с альбумина и поглощение их клетками. Поглощение кардиомиоцитами НЭЖК из комплексов с альбумином (вместе с альбумином) заслуживает особого внимания; обусловлено это тем, что клетки синцития кардиомиоцитов сами ЖК in situ de novo из ацетил-КоА практически не синтезируют, но обеспечение энергией для сокращения происходит за счет образования АТФ при окислении митохондриями главным образом ЖК. Поглощение ЖК клетками определяют многие факторы: а) диффузия

REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDUCATiON

ЖК с альбумина, которая определена потребностью клеток в энергии, АТФ, ЖК; б) содержание семейства белков - переносчиков ЖК в цитоплазме миоцитов; в) параметры диссоциации МЖК и НЖК с альбумина и ассоциации с клатрином кавеол плазматической мембраны; г) соотношение активированной и пассивной диффузии в условиях быстрого связывания мембраной освобожденных НЭЖК; д) ассоциация со специфичным носителем, которым является белоксвязывающий альбумин. Наличие «рецепторов» к альбумину на сарколемме кардиомиоцитов - условие активного поглощения ЖК. Можно полагать, что поглощение клетками ЖК на ступенях филогенеза претерпело несколько этапов биологического совершенства, которое в кардио-миоцитах завершились формированием функциональной системы, во многом сходной с рецепторным поглощением клетками субстратов.

При физиологичной концентрации альбумина и ЖК кар-диомиоциты переносят через плазматическую мембрану только связанные с альбумином ЖК; при низкой концентрации альбумина возможно формирование и афизиологичных вариантов эндоцитоза. В поглощение клетками пальмитиновой НЖК вовлечена ассоциация альбумина со связующими доменами на мембране; во всех случаях это жидкостный эндоцитоз. В экстракте кардиомиоцитов выявлены 2 белка с мол. массой 18 и 31 кД. Альбуминсвязывающий белок взаимодействует с лигандом от разных видов животных и с альбумином, обработанным формальдегидом. Белок кардио-миоцитов, связывающий альбумин с меньшей аффинностью, взаимодействует с а-фетопротеином и белком, переносящим витамин D.

В течение всего пренатального периода в крови плода и ребенка доминирует а-фетопротеин; высокоаффинно переносит он ННЖК; концентрация альбумина невысока. В пренатальном периоде нет проблем с реализацией биологической реакции термогенеза: мама греет. Сразу после рождения ответственность за поддержание температуры тела ложится на ребенка, в то время как аффинность связывания а-фетопротеином НЖК и МЖК невелика. В течение трех недель после рождения гепатоциты новорожденного прекращают синтез секреторного белка а-фетопротеина и начинают экспрессировать синтез альбумина, сродство которого к НЖК и МЖК существенно выше.

На поверхности сарколеммы кардиомиоцитов происходит диссоциация комплекса: ЖК диффундируют через плазматическую мембрану; альбумин уходит в кровоток. В кардиомиоцитах комплекс ЖК + цитоплазматический белок переносящий ЖК, переходит в цитозоль. После связывания комплекса с сарколеммой освобожденные ЖК диффундируют через латеральную мембрану, в цитоплазме их связывают белки-переносчики, которые доставляют их к митохондриям. Окисление ЖК на 70% обеспечивает энергетические потребности миокарда; образование ацетил-КоА из глюкозы, из пирувата происходит в основном при гипоксии и недостаточном количестве О2 для окисления ЖК.

Важно понять механизмы, которыми филогенетически поздние кардиомиоциты раздельно поглощают коротко- и длинноцепочечные МЖК и НЖК и доносят их до митохондрий. Какие факторы приводят к формированию дилатаци-онной кардиомиопатии при хроническом дефиците в клетках субстрата для наработки энергии, к дефициту биоэнергети-чески обратимого АТФ и недостаточности кровообращения. На сарколемме кардиомициты связывают альбумин с существенно большей мерой аффинности по сравнению с гепа-

ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

тоцитами. Возможно, что за ассоциацией комплекса ЖК + альбумин с мембраной следует облегченная диффузия освобожденной ЖК в цитоплазму кардиомиоцитов.

Физико-химические аспекты действия альбумина на мембране клеток. Миоциты поглощают ЖК и в отсутствие альбумина; это подтверждено на модели диффузии. При этом действие ЖК как биологического детергента изменяет физико-химические свойства мембраны, увеличивая ее жидкостность. Олеиновая МЖК в форме СЖК в концентрации 20 мкМ в межклеточной среде нарушает функцию кардиомиоцитов. С14:0 миристиновая и С12:0 лауриновая НЖК в концентрации 5 и 10 мкМ in vitro усиливают окисление ЖК в митохондриях. Создается впечатление, что биологическая потребность в альбумине в первую очередь обусловлена тем, чтобы при переносе через мембрану большого количества ЖК постоянно предотвращать реально деструктивное действие полярных НЭЖК как эндогенных детергентов на полярную, бислойную структуру плазматической мембраны.

В поздних в филогенезе кардиомиоцитах не происходит ни элонгации, ни десатурации ЖК. Миристиновая ЖК в кон-центации 5 мкМ на четверть ингибирует окисление миоцита-ми глюкозы. Вероятно, альбумин доносит ЖК до мембраны эндотелия; далее белок с мол. массой 40 кД проводит ЖК через бислойную мембрану эндотелия и затем белок, связывающий ЖК, переносит ЖК в цитоплазме к митохондриям. В тубулярных везикулах синцития кардиомиоцитов находят много альбумина, но нет иных белков плазмы крови.

Наличие высокоаффинных мест связывания для альбумина на плазматической мембране отмечено в филогенетически поздних клетках миокарда, подкожных адипоцитах и перипортальных гепатоцитах. Попытки найти подобные места на мембране эпителия проксимальных канальцев успешными назвать нельзя; в филогенетически ранних клетках нефрона доминирует более ранний кавеолярный эндоцитоз. Пептид на поверхности гепатоцитов может связывать и альбумин, который полимеризован при действии бифункционального реагента - глутарового диаль-дегида. Белок сохраняет способность связывать альбумин после гель-электрофореза с SDS-Na, при электроблоттин-ге на нитрате целлюлозы и в присутствии восстановителей S-S-связей. Ассоциация происходит как с мономером, так и с полимерами альбумина. Поглощение кардиомиоцита-ми ЖК зависит от длины цепи и числа ДС. Поглощение миоцитами ЖК состоит из насыщаемого и ненасыщаемого компонентов. Накопление в миоцитах ЖК является логарифмической функцией их длины. Ингибирование поглощения пальмитиновой НЖК при действии Вг-пальмитата свидетельствует о функции белков-транспортеров. Применение гомолога миристиновой С14:0 НЖК также нарушает поглощение клетками ЖК. Однако температурная зависимость переноса ЖК через мембрану более характерна для пассивной диффузии.

При нефротическом синдроме в составе ЛП происходят в большей мере количественные, чем качественные нарушения; липидурия обусловлена экскрецией с мочой, фильтрацией через базальную мембрану ЛПВП и апоА-1. Уровень гипоальбуминурии коррелирует с нарушением переноса через мембрану ЖК. Кинетические параметры указывают на усиление продукции и ингибирование гидролиза ТГ в ЛПОНП. В модельных экспериментах все ЖК от С12:0 лауриновой НЖК до ф-6 С20:4 арахидоновой ПНЖК (Арахи) в неионизированной форме проникают через бис-

лой ФЛ. ЖК, освобожденные при действии фосфолипазы А2 также быстро переходят из наружного монослоя везикул во внутренний. Поведение ионизированных ЖК меняется в бислое при добавлении валиномицина. В присутствии специфичного антибиотика ЖК могут преодолевать бис-лой ФЛ и в неионизированной форме. Холиевой кислоте преодолеть бислой плазматической мембраны сложнее, чем более гидрофобным дезокси- и хеноксихолевой желчным кислотам. Конъюгаты ЖК с таурином не могут проходить через бислой ФЛ.

Встраиваясь в мембрану клеток, НЭЖК изменяют функцию сигнальных систем, активируют калиевые каналы, повышают активность №+, К+-АТФазы, модифицируют поглощение клетками ЛП. При инфаркте миокарда повышение концентрации ЖК, особенно пула СЖК, нарушает электрофизиологические параметры кардиомиоцитов. ЖК могут проникать путем пассивной диффузии, при действии переносчиков, а возможно, и при функции обеих механизмов. Снижение рН среды активирует проникновение в везикулы НЭЖК в неионизированной форме. В ионизированной форме ЖК проходят бислой быстро; они медленно продвигаются в неионизированной форме. Добавление ЖК в форме калиевых солей быстро приводит к появлению их в везикулах. Арахи-ПНЖК также могут проникать в везикулы, используя вариант флип-флоп (рис. 5).

При действии фосфолипазы А2 освобожденная Арахи оказывается внутри везикул. При ишемии активность фос-фолипаз и проникновение в клетки ЖК возрастает. Быстрое встраивание в наружный монослой мембраны большого количества СЖК в неионизированной форме при ацидозе приводит к градиенту рН на мембране и повреждению клеток. Происходит это путем формирования гидрофильных, длительно существующих пор из СЖК, которые формируются спонтанно и независимо от клеток. Валиномицин можно рассматривать как один из агентов, который одновременно, вероятно сочетанно, активирует поступление в клетки не только К+, но и ЖК.

При клонировании ДНК найден белок (646 аминокислотных остатков, мол. масса 22 кД), который может переносить через мембрану длинноцепочечные ЖК как интегральный протеин. Полагают, что он задействован в транспорте ЖК; возможно, что для ЖК существуют и транспортные системы, как для аминокислот. Это подтверждает быстрое,

Рис. 5. Процессы латеральной диффузии, вращения, флип-флоп-переходов, которые характеризуют преодоление ЖК плазматической мембраны.

REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDUCATiON

Рис. 6. Встраивание (конденсирование) полярного спирта ХС между полярными молекулами ФЛ в бислое плазматической мембраны.

насыщаемое проникновение ЖК в клетки; поток ЖК можно остановить путем преинкубации клеток с проназой. При экспрессии белка, поглощение ЖК клетками возрастает. Возможно, поглощение ЖК филогенетически поздними, дифференцированными и ранними клетками рыхлой соединительной части (РСТ) происходит по-разному. Кардио-миоциты и адипоциты имеют специфичный интегральный белок, который переносит в клетку ЖК. Экспрессия его синтеза происходит при поглощении адипоцитами ЖК и синтезе ТГ. Он же увеличивается в миоцитах при активной мышечной работе. Поглощение миоцитами ЖК нарушено при ишемии, гипертрофии миокарда, сахарном диабете и сердечной недостаточности.

Опосредованный белком транспорт ЖК установлен для гепатоцитов, подкожных адипоцитов, кардиомиоцитов и поперечнополосатых мышц, гладких миоцитов тонкого кишечника. Транспортный белок с мол. массой 43 кД изолирован из всех перечисленных клеток. Зависимое от альбумина поглощение гепатоцитами ЖК показано как при перфузии печени, так на культуре и в суспензии клеток. Поглощение гепатоцитами ЖК включает две составляющие: насыщаемое поглощение и ненасыщаемое. В физиологичных условиях альбуминзависимое поглощение составляет более 90% НЖК и МЖК. При сахарном диабете насыщаемым путем в клетки поступает только половина ЖК: каждая вторая ЖК диффундирует через мембрану вне состояния ионизации, вне ассоциации с альбумином и афизиологично.

Имеется достаточно оснований говорить о двух пулах жировых клеток: а) филогенетически ранние, активные, многофункциональные висцеральные жировые клетки (ВЖК) сальника; рецепторов к инсулину на мембране они не имеют, склонны к гипертрофии и не подвержены пролиферации и б) филогенетически поздние подкожные адипоциты, которые призваны обеспечивать субстратами для наработки энергии клетки при реализации одной биологической функции локомоции, склонны не только к гипертрофии, но активно реализуют и биологическую реакцию пролиферации. Активация синтеза ТГ в жировых клетках происходит: а) при активном поступлении в клетки экзогенных ЖК в форме неполярных ТГ и б) синтезе ЖК in situ de novo из ацетил-

КоА. Эти же адипоциты усиленно поглощают глюкозу и реагируют на регуляторное действие инсулина. Не исключено, что все это может оказывать влияние и на неконтролируемую диффузию в клетки НЖК и МЖК и развитие афизиологичного липоидоза - запасания ЖК в форме ТГ в клетках, которые филогенетически для этого не предназначены.

Используя антитела к белку, переносящему ЖК, можно ингибировать поглощение клетками длинноцепочечных ЖК (С16 и более); на поступление в клетки среднецепочечных ЖК (С10-С14) антитела действия не оказывают. Олеиновая МЖК ингибирует поглощение клеткой аналога, меченного флуорофором, но не оказывает влияния на поглощение С11:0 афизиологичных ЖК. Следовательно, поглощение клетками длинно- и среднецепочечных ЖК происходит по-разному. Вероятно, этими физико-химическими параметрами определено и различие ЖК, которые депонированы в филогенетически ранних ВЖК сальника и в поздних в филогенезе подкожных адипоцитах. У свиней в ВЖК депонированы средне-цепочечные лауриновая и миристиновая НЖК, в то время как в подкожных адипоцитах доминируют длинноцепочечные МЖК и НЖК. Поэтому при реализации филогенетически ранних биологических функций гомеостаза, функции эндоэ-кологии и биологической функции адаптации все клетки in vivo поглощают в первую очередь среднецепочечные ЖК, в то время как при реализации биологической функции локо-моции инсулинзависимые клетки поглощают, а митохондрии окисляют преимущественно длинноцепочечные ЖК.

Функция кавеол в поглощении клетками ЖК. Пятьюдесятью годами ранее при электронной микроскопии выявлены структурные компоненты клеток, названные кавеолами. Исследования показали, что существуют морфологические особенности кавеол в зависимости от типа клеток; количество кавеол в клетках варьирует. Их много в подкожных адипо-цитах, эндотелиоцитах, альвеоцитах, фибробластах, клетках гладкой и поперечнополосатой мускулатуры; некоторые клетки, напротив, практически лишены кавеол: это нейроны центральной нервной системы, лимфоциты. Причины такой вариабельности связывают со специфичными функциями клеток и затратами энергии. Кавеолы - места деформации (вдавления) на мембране клеток; они имеют специфичное покрытие и краевую каемку с морфологически видимой ис-черченностью. Если в инкубационную среду добавить вещества, связывающие ХС, кавеолы уплощаются и происходит деструкция полосатого покрытия, именуемого кавеолином.

Добавленная в инкубационную среду олеиновая МЖК быстро появляется в липосомах из ФХ; так же быстро она встраивается в монослой ФЛ+ХС. Ионизированные ЖК переходят из наружного монослоя липидов во внутренний путем флип-флоп-перемещения. Добавление в среду олеиновой моно-ЖК предотвращает ее дальнейшее встраивание в мембрану. Для транспорта ЖК в модельных системах требуется 2 с, а катиона ЖК с отрицательным зарядом - 30 с.

Важно то, что в кардиомиоцитах митохондрии окисляют только те ЖК, которые клетки поглотили в ассоциации с альбумином. При повышении в плазме крови содержания ЖК в форме НЭЖК активность окисления их в митохондриях зависит от величины отношения альбумин/ЖК. Не найдено корреляции между содержанием в крови СЖК и скоростью окисления ЖК в клетках. Пассивная диффузия ЖК через плазматическую мембрану низкая, и она не может служить способом поглощения их клетками. Если в среде возрастает содержание пальмитиновой НЖК в ассоциации с альбуми-

ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Рис. 7. Участие специфичных протеинов в переносе ЖК при метаболизме.

I - перенос в межклеточной среде; II - транспорт через плазматическую мембрану клеток; III - перенос между субклеточными органеллами.

ном, клетки увеличивают их поглощение. В то же время содержание пальмитиновой НЖК в форме СЖК в крови может длительно оставаться высоким.

Удаление (экстракция) полярного ХС из наружного монослоя мембраны приводит к деструкции кавеол и нарушению жидкостного эндоцитоза. Филлипин ингибирует связывание с клетками инсулина и альбумина в культивируемом монослое клеток эндотелия. Проницаемость эпителия легочных альвеол для альбумина уменьшается при снижении в мембране содержания спирта ХС. Кавеолин формирует и скевенджер-эндоцитоз конформационно измененных молекул альбумина, образование эндосом, их поглощение, слияние с лизосомами и деградацию белка. Нистатин и дигитонин обладают сходным действием. В то же время эндоцитоз и деградация а2-макроглобулина не зависит от содержания ХС в мембране, поскольку поглощение его клетками является клатринзави-симым. При действии филлипина в эндотелиальных клетках нарушается кавеолинзависимый трансцитоз инсулина. Селективное ингибирование кавеолинзависимого поглощения позволяет дифференцировать кавеолярный и клатриновый варианты поглощения клетками субстратов. Уменьшение содержания ХС в плазматической мембране клеток нежелательно (рис. 6).

Кавеолы при эндоцитозе переносят в клетки не только ЖК, но и низкомолекулярные соединения, такие как аминокислоты и дисахариды; этот процесс суммированно именуют потоцитозом. Переход комплекса альбумин + ЖК, инсулина и других субстанций через эндотелий и поглощение клетками происходит путем трансцитоза; основу его составляют кавеолы. Кавеолярное поглощение клетками ЖК происходит во всех миоцитах. При этом ХС является гидрофобным компонентом стриарного покрытия кавеол и необходимым для

формирования везикул и жизнеобеспечения клеток. Вероятно, поэтому наружный монослой клеточной мембраны содержит ~90% всего ХС в клетке.

Белки, которые присутствуют в стриарных структурах кавеол и которые активно связывают альбумин, именуют албондином. Антитела, специфичные к албондину, инги-бируют связывание клетками комплекса альбумин + ЖК, но не оказывают влияния на альбумин, молекулы которого имеют иную конформацию. Только ассоциация с ЖК позволяет альбумину запустить процесс эндоцитоза. После поглощения клетками комплекса альбумин + коллоидное золото более 90% альбумина покинуло клетку путем эк-зоцитоза без золота в форме свободного белка. Вероятно, поглощения НЭЖК в ассоциатах с альбумином является классической филогенетически ранней технологией АТФ-зависимого кассетного транспортера - АВС-транспортера. Технология проста: альбумин с ЖК заходит в клетку; оставляет ЖК и уходит пустым, готовым к следующему циклу переноса.

Возможно кавеолин- и клатринопосредованные варианты эндоцитоза, который реализуют клетки, реально имеют функциональное большее значение, чем мы полагаем. Используя вариант АВС-транспортеров, клетки переносят разные субстраты не только через плазматическую мембрану, но и через моно- и бислойные мембраны внутриклеточных органелл при кавеолинреализуемом эндо-цитозе. Возможно, эндоцитоз включает челночный механизм переноса от одной мембраны к другой. Инвагинация мембраны, образование везикул могут происходить и на внутриклеточных мембранах. Этот процесс может быть задействован в эндоцитозе, экзоцитозе, трансцитозе и в синаптической передаче сигнала; все это происходит по-

разному, на ступенях филогенеза на основании единого механизма.

Функциональное различие белков-переносчиков и транспортеров ЖК. Белки, связывающие ЖК, можно обоснованно разделить на 3 группы: а) апобелки внеклеточной среды, которые переносят ЖК; б) белки, которые транспортируют ЖК через мембраны; в) цитоплазматическое белки, которые переносят ЖК между внутриклеточными органеллами (рис. 7).

НЭЖК в комплексе с альбумином или в форме СЖК - мицелл контактируют с клеточной мембраной. После прохождения через мембрану ЖК связывают внутриклеточные белки-переносчики и доставляются к местам метаболизма. Внутриклеточные белки-переносчики также участвуют в переносе в цитозоле промежуточных продуктов метаболизма ЖК - неполярных КоА-эфиров ЖК. Белки мембраны, связывающие ЖК, участвуют и в поглощении ЖК клетками. В настоящее время белки - переносчики ЖК исследуют как регуляторы метаболизма липидов в организме и как маркеры развития in vivo афизиологичных процессов. Так, присутствие определенных белков-переносчиков в плазме крови и моче служит маркером, в частности ишемической болезни сердца.

Внутриклеточные белки - переносчики ЖК найдены около 30 лет назад в тканях крысы и человека при гель-фильтрации протеинов цитоплазмы, которые предварительно инкубированы с [14С]ЖК. Охарактеризованы как минимум 6 разных по структуре типов внутриклеточных белков-переносчиков. Известны цитоплазматические белки-переносчики в печени, кишечнике, сердце, почках и жировой ткани. Все они имеют сравнительно низкую мол. массу (14-16 кД) и состоят из 127-133 остатков аминокислот. Они связывают в основном длинноцепочечные ЖК и присутствуют в клетках в ощутимых количествах; в миокарде на их долю приходится ~5% всех белков цитоплазмы. Эти белки рассматривают как составную часть ЖК в депо, которые может поставлять в субклеточные органеллы.

Анализ первичной структуры белков выявляет высокую гомологичность (> 80 %) белков из одного и того же органа у разных млекопитающих. Сравнение же белков печени и кишечника, к примеру, выявляет 25-30% гомологии. В то же время не удалось выявить гомологию между внутриклеточными белками-переносчиками и белками, переносящими ЖК во внеклеточном пространстве (альбумин и а-фетопротеин). Это указывает, что на ступенях филогенеза внутриклеточные белки - переносчики ЖК стали функционировать на значительно более ранних ступенях филогенеза, чем стал происходить перенос ЖК в межклеточной среде между клетками в паракринно регулируемых сообществах. Внутриклеточные белки-переносчики специфичны в отношении отдельных ЖК; имеют они, как правило, один домен связывания.

На модельных системах присутствие белков-переносчиков внутри клетки может увеличить скорость метаболизма тех ЖК, которые они переносят. Так, скорость метаболизма ЖК в присутствии белков-переносчиков увеличивается на порядок. Наличие белка-переносчика в кардиомиоцитах увеличивает доступность ЖК в 700 раз и увеличивает скорость переноса ЖК в митохондриях к сарколемме (внутренней мембране митохондрий) в 17 раз по сравнению с физиологичным уровнем. В целом количество белков - переносчиков ЖК в тканях животных соответствует скорости их метаболизма.

Пища с высоким содержанием жиров увеличивает количество белков - переносчиков ЖК в печени, в сердце по принципу индукции субстратом; прием тестостерона снижает содержание переносчиков в печени, но увеличивает

REMOTE ACADEMY OF POST-GRADUATE EDUCATiON

их концентрацию в сердце и скелетных миоцитах. Внутриклеточные белки-переносчики моделируют включение ЖК в состав ФЛ, перенос ЖК в митохондрии для р-окисления и в эндоплазматическую сеть для этерификации со спиртами -глицерином и ХС. Экспрессия белков в фибробластах увеличивает содержание ТГ и эфиров ЖК со спиртом ХС; содержание ФЛ же остается неизменным. Это указывает на специфичное участие в процесс формирования внутриклеточных белков-переносчиков в переносе ЖК, функциональное предназначение которых является разным. И самое главное - становление этих процессов произошло на разных ступенях филогенеза.

И ожирение, и метаболический синдром являются патологией жировых клеток, однако метаболический синдром -это патология филогенетически ранних ВЖК сальника с нарушением биологических функций трофологии, гомеостаза, биологических функций эндоэкологии и адаптации. Ранние в филогенезе ВЖК сальника не имеют рецепторов к инсулину и адаптивно синтезируют лептин, и для них не характерна биологическая реакция пролиферации.

Ожирение является патологией поздних в филогенезе подкожных адипоцитов; они инсулинзависимы и предназначены для реализации одной биологической функции локомоции - движения за счет сокращения поперечнополосатых скелетных миоцитов. Адипоциты в плане адаптации синтезируют гуморальный медиатор адипонектин и обладают выраженной способностью активировать биологическую реакцию пролиферации - увеличивать число подкожных адипоцитов.

Однако при афизиологичных состояниях в разной мере возрастает пассивное, по градиенту концентрации поглощение всеми клетками in vivo не связанных с альбумином СЖК в неионизированной форме в составе мицелл; формируются они в плазме крови и межклеточной среде. Пассивное, афизиологичное поглощение клетками СЖК, которые в силу особенностей внутриклеточной компартментализации не окисляют митохондрии, приводит к синтезу, депонированию ТГ в цитоплазме клеток, которые функционально для этого не предназначены; они не имеют активных гормонзависи-мых липаз и избавиться от ТГ не могут.

Афизиологичное пассивное поглощение клетками СЖК, этерификация их в ТГ, в частности в филогенетически поздних р-клетках островков и столь же поздних кардиомиоцитах, которые ЖК de novo не синтезируют, ТГ не образуют и не депонируют, приводит к формированию афизиологич-ных процессов, при которых функциональная активность независимо от аутокринной регуляции клеток оказывается нарушенной. Такие клетки in vivo с позиций биологии подвержены запрограммированной гибели по типу апоптоза; in vivo это и происходит. Образование телец апоптоза нарушает биологическую функцию эндоэкологии, активируя биологическую реакцию воспаления. Казалось бы, поврежденные клетки убрали и все в порядке, но способность филогенетически поздних клеток к пролиферации является низкой. Поэтому постепенно при высоком содержании в крови СЖК, не ассоциированных с альбумином, формируется дилатационная кардиомиопатия и медленно развивается сахарный диабет 1-го типа, инсулинзависимый диабет.

Вопросы для самоконтроля

1. В чем состоит специфичная роль альбумина в переносе насыщенных и мононенасыщенных ЖК в форме полярных НЭЖК к клеткам в межклеточной среде и в крови?

2. Какие факторы определяют соотношение в плазме кро-

ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ви НЭЖК, физиологично ассоциированных с альбумином, и НЭЖК в афизиологичной форме свободных ЖК в составе мицелл?

3. В силу каких условий кардиомиоциты в митохондриях окисляют только те НЖК и МЖК, которые клетки поглотили в форме ассоциатов с альбумином; какова роль альбумина как транспортера ЖК в клатриновом эндоцитозе?

4. Каково различие филогенетически ранней кавеоляр-ной формы эндоцитоза от филогенетически более позднего клатринового варианта поглощения клетками ЖК в форме НЭЖК? Каковы те условия in vivo, которые инициировали превращение на ступенях филогенеза кавеолярного эндоци-тоза в клатриновый?

5. Каковы те изменения метаболизма, которые происходят in vivo при врожденном состоянии анальбуминемии; чем обусловлена гетерогенность фракции альбумина на электро-фореграмме белков плазмы крови?

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Ткачук В.А., ред. Клиническая биохимия: Учебное пособие для вузов. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2002.

2. Титов В.Н., ред. Лабораторные и инструментальные исследования в диагностике. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2004.

3. Титов В.Н. Клиническая биохимия жирных кислот, липидов и липопротеинов. Москва-Тверь: ООО «Издательство «Триада»; 2008.

4. Шойбонов Б.Б., Кравченко М.А., Баронец В.Ю., Толпыго С.М., Костырева М.В., Шабалина А.А. и др. Определение атерогенно-сти иммунных комплексов, содержащих модифицированные ли-попротеины, в тесте связывания комплемента. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2014; 58 (4): 133-8.

5. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: Издательство «Мир»; 1997.

Поступила 19.10.15

REFERENCES

1. Tkachuk V. A., Ed. Clinical Biochemistry: Textbook for High Schools. [Klinicheskaya biokhimiya: Uchebnoe posobie dlya vuzov]. Moscow: GEOTAR-Media; 2002. (in Russian)

2. Titov V.N., Ed. Laboratory and Instrumental Tests in Diagnostics. [Laboratornye i instrumental'nye issledovaniya v diagnostike]. Moscow: GEoTAR-Media; 2004. (in Russian)

3. Titov V.N. Clinical Chemistry Fatty Acids, Lipids and Lipoproteins. [Klinicheskaya biokhimiya zhirnykh kislot, lipidov i lipoproteinov]. Moscow-Tver': OOO «Izdatel'stvo «Triada»; 2008. (in Russian)

4. Shoybonov B.B., Kravchenko M.A., Baronets V.Yu., Tolpygo S.M., Kostyreva M.V., Shabalina A.A. et al. Determination atherogenic immune complexes containing modified lipoproteins in complement fixation test. Patologicheskaya fiziologiya i eksperimental'naya terapiya. 2014; 58 (4): 133-8. (in Russian)

5. Gennis R. Biomembranes. The Molecular Structure and Function. [Biomembrany. Molekulyarnaya struktura i funktsii]. Moscow: Izdatel'stvo «Mir»; 1997. (in Russian)

Received 19.10.15

Нами проведена диагностика ПНГ методом проточной цитометрии у 1925 пациентов, из них 1125 женщин, 800 мужчин, в возрасте от 1 года до 88 лет. Всем пациентам диагностика проводилась согласно международному стандартизованному протоколу [11] и предлагаемому нами подходу. В качестве объекта исследования выбраны ретикулоциты, выделенные с помощью CD235a и CD71.

Для окрашивания образца применяли трехцветную комбинацию МКА - CD235a (FITC, клон 11Е4В-7-6, BC)/CD59 (РЕ, клон МЕМ-43, Invitrogen)/CD71 (АРС, клон OKT9, eBio-science). Измерения проводились на проточном цитометре BD FACSCanto™ II Becton-Dickinson (США).

Для оценки ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоци-тов использовали точечный график - FSC (log) vs SSC (log), с помощью логического ограничения выделяли область эритроцитов, исключая дебрис и дуплеты (см. рисунок, а). Затем на графике FSC (log) vs CD235a (см. рисунок, b) выделяется гейт по CD235a+-клеткам, тем самым исключая дебрис и клетки, не относящиеся к популяции CD235a+. События, вошедшие в гейт CD235а+, анализируются на графике CD71 vs FSC (log) (см. рисунок, e), на котором выделяется популяция позитивная по CD71. Для объективной оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собирается не менее 20 тыс. событий. В зависимости от гейта CD71+ строится график FSC (log) vs SSC (log) (см. рисунок, f), на котором при помощи дополнительного гейта CD71str выделяются ретику-лоциты, и, таким образом, методом последовательного гей-тирования популяция ретикулоцитов окончательно очищается от дебриса и дуплетов.

Далее строится график CD235a vs CD59 (см. рисунок, g) в зависимости от гейта CD71str (выделенные ретикулоциты). На этом графике выделяются две области - Norm Ret и PNH Ret (см. рисунок, g), это границы нормальных и ПНГ-позитивных ретикулоцитов соответственно. Статистические данные отражаются в количестве собранных событий и процентах от гейта (см. рисунок, d и h).

Гейт CD235a+ на первом этапе сбора данных является стоп-гейтом, т. е. в нем собирается 1 млн событий. Гейт CD235a+ применяется к графику CD235a vs CD59 (см. рисунок, с). Если в регионах PNH Type II и PNH Type III на графике CD235a vs CD59 суммарно оказывается не более 10 событий, сбор данных прекращается и делается вывод об отсутствии ПНГ-клона. При большем количестве событий суммарно в этих регионах исследование продолжается. На втором этапе исследования CD71 является стоп-гейтом, в котором должно быть собрано 20 тыс. событий.

Данный способ является простым в выполнении и не требует больших материальных затрат по сравнению с международной стандартизованной методикой. В протоколе используется всего три комбинации МКА при скрининге ПНГ (CD235a, CD71, CD59). Исследование выполняется в одной пробирке, использование меньшего количества антител без применения лизирующих растворов делает анализ дешевле примерно на 75% за один раз. При этом сохраняется высокая чувствительность и точность диагностики. ПНГ-клон среди ретикулоцитов отражает истинное значение ПНГ-клона. Нами проведено сравнение полученных значений ПНГ-клона среди ретикулоцитов со значениями, полученными при помощи стандартизованного международного подхода к диагностике ПНГ на гранулоцитах и моноцитах. Процент ПНГ-позитивных эритроцитов согласно предлагаемой методике, измеряется с более высокой чувствительностью, по сравнению с международным стандартизованным подходом, так как с помощью предлагаемого метода исследуются не менее 1 млн эритроцитов, а согласно ICCS - 5 млн.

Среди 1925 обследованных пациентов ПНГ-клон обнаружен у 547 (30,9%). Размер ПНГ-клона среди ретикулоцитов

HEMATOLOGY

варьировали от 0,1 до 99,7% (медиана 70,4%). Минимальные определяемые значения среди популяции гранулоцитов при параллельном определении ПНГ-клона согласно стандартизованному подходу составляли 0,01%, моноцитов - 0,03%, эритроцитов - 0,02%. Корреляция между значением ПНГ-клона среди ретикулоцитов и гранулоцитов составила 0,93%, среди ретикулоцитов и моноцитов 0,95% соответственно. Чувствительность метода составила 99,3%, специфичность - 99,6%.

Таким образом, предложенный нами подход исследования ПНГ-клона среди ретикулоцитов для скрининга ПНГ клона с использованием проточной цитометрии является надежным, быстрым, экономичным методом, доступным для лабораторий медицинских учреждений разного профиля.

Финансирование: Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА (пп. 1, 3-12, 14-17, 20-33 см. REFERENCES)

2. Кулагин А.Д., Лисуков В.А., Козлов В.А. Апластическая Анемия. Новосибирск: Наука; 2008. 13. Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Птушкин В.В., Шилова Е.Р., Цветаева Н.В., Михайлова Е.А. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Онкогематология. 2014; 9 (2): 20-8.

18. Абдулкадыров К.М. Клиническая гематология: Справочник. СПб.: Питер; 2006.

19. Идельсон Л.И., Бенисович В.И., Савина Л.С., Радживиловская Е.Г. Оценка сахарозного теста для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Проблемы гематологии и переливания крови. 1972; 17 (8): 55-7.

Поступила 30.11.15

REFERENCES

1. Josten К.М., Tooze J.A., Borthwick-Clarke C., Gordon-Smith E.C., Rutherford T.R. Acquired aplastic anemia and paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: studies on clonality. Blood. 1991; 12: 3162-7.

2. Kulagin A.D., Lisukov V.A., Kozlov V.A. Aplastic Anemia. [Aplas-ticheskayaAnemiya]. Novosibirsk: Nauka; 2008. (in Russian)

3. Bessler М., Mason P.J., Hillmen P., Miyata T., Yamada N., Takeda J. et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene. EMBO J. 1994; 13 (1): 110-7.

4. Takeda J., Miyata T., Kawagoe K., Iida Y., Endo Y., Fujita T. et al. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cell. 1993; 73 (4): 703-11.

5. Ware R.E., Rosse W.F., Hall S.E. Immunophenotypic Analysis of Re-ticulocytes in Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria. Blood. 1995; 86 (4): 1586-9.

6. Parker C.J. Bone marrow failure syndromes: paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Hematol. Oncol. Clin. North America. 2009; 23 (2): 333-46.

7. Jandl J.H., ed. Blood. Textbook of Hematology. Physiology of red cells. 1-st ed. Boston, Mass: Little Brown and Company; 1987.

8. Lee G.R., Bithell T.C., Foerster J., Athens J.W., Lukens J.N. Granulocytes-neutrophils. In: Wintrobe's Clinical Hematology. 1993; 9: 223.

9. Latour R.P., Mary J.Y., Salanoubat C., Terriou L., Etienne G., Mohty M. et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: Natural history of disease subcategories. Blood. 2008; 112 (8): 3099-106.

10. Parker C., Omine M., Richards S., Nishimura J., Bessler M., Ware R. Diagnosis and management of PNH. Blood. 2005; 106 (12): 3699-709.

11. Borowitz J.M., Craig F.E., DiGiuseppe G.A., Illingworth A.J., Rosse W., Sutherland D.R. et al. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2010; 78B (4): 211-30.

12. Peter Hillmen. The Role of Complement Inhibition in PNH. ASH Education Book. 2008; 1: 116-23.

13. Kulagin A.D., Lisukov I.A., Ptushkin V.V., Shilova E.R., Tsvetaeva N.V., Mikhaylova E.A. National recommendations in PNH diagnostics and treatment. Onkogematologiya. 2014; 9 (2): 20-8. (in Russian)

14. Saso R., Marsh J., Cevreska L., Szer J., Gale R.P., Rowlings P.A. et al. Bone marrow transplants for paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br. J. Haematol. 1999; 104 (2): 392-6.

ГЕМАТОЛОГИЯ

15. De Latour R.P., Schrezenmeier H., Mary J.Y. et al. Stem cell transplantation for paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: an ongoing joint study of the AAWP EBMT Group and the French Society of Haema-tology. In: 35-th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Goteborg, Sweden; 2009: abstract 316.

16. Schrezenmeier H., Shubert J., Luzzatto L. et al. Effects of eculizum-ab therapy in patients with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) receiving concurrent immunosuppressive therapy for bone marrow insufficiency. Blood. 2009; 114: 3012.

17. Soliris Summary of Product Characteristics. Alexion Europe SAS. 2007.

18. Abdulkadyrov K.M. Clinical Hematology: Guidebook. [Kliniches-kaya gematologiya: Spravochnik]. St. Petersburg: Piter; 2006. (in Russian)

19. Idel'son L.I., Benisovich V.I., Savina L.S., Radzhivilovskaya E.G. Sucrose test for PNH diagnostics. Problemy gematologii i pereli-vaniya krovi. 1972; 17 (8): 55-7. (in Russian)

20. Rosse W.F. Dr Ham's test revisited. Blood. 1991; 78 (3): 547-50.

21. Rosse W.F. Variations in the red cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Br. J. Haematol. 1973; 24 (3): 327-42.

22. Oelschlaegel U., Besson I., Arnoulet C., Sainty D., Nowak R., Naumann R. et al. A standardized flow cytometric method for screening paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) measuring CD55 and CD59 expression on erythrocytes and granulocytes. Clin. Lab. Haematol. 2001; 23 (2): 81-90.

23. Sutherland D.R., Kuek N., Azcona-Olivera J., Anderson T. Acton E., Barth D. et al. Use of a FLAER-based WBC assay in the primary screening of PNH clones. Am. J. Clin. Pathol. 2009; 132: 564-72.

24. Diep D.B., Nelson K.L., Raja S.M., Pleshak E.N., Buckley J.T. Gly-cosylphosphatidylinositol anchors of membrane glycoproteins are binding determinants for the channel-forming toxin aerolysin. J. Biol. Chem. 1998; 273: 2355-60.

25. Hall S.E., Rosse W.F. The use of monoclonal antibodies and flow

cytometry in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 1996; 87: 5332-40.

26. Diep D.B., Nelson K.L., Raja S.M., Pleshak E.N., Buckley J.T. Gly-cosylphosphatidylinositol anchors of membrane glycoproteins are binding determinants for the channel-forming toxin aerolysin. J. Biol. Chem. 1998; 273: 2355-60.

27. Sutherland D.R., Kuek N., Davidson J., Barth D., Chang H., Yeo E. et al. Diagnosing PNH with FLAER and multiparameter flow cytometry. Cytometry B. Clin. Cytom. 2007; 72B (3): 167-77.

28. Brodsky R.A., Mukhina G.L., Li S. Nelson K.L., Chiurazzi P.L., Buckley J.T. et al. Improved detection and characterization of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria using fluorescent aerolysin. Am. J. Clin. Pathol. 2000; 114: 459-66.

29. Madkaikar M., Gupta M., Jijina F., Ghosh K. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: diagnostic tests, advantages, & limitations. Eur. J. Haematol. 2009; 83 (6): 503-11.

30. Marinov I., Kohoutova M., Tkacova V., Pesek A., Cermak J., Cetko-vsky P. Clinical relevance of CD157 for rapid and cost-effective simultaneous evaluation of PNH granulocytes and monocytes by flow cytometry. Int. J. Lab. Hematol. 2015; 37 (2): 231-7.

31. Sutherland D.R., Acton E., Keeney M., Davis B.H., Illingworth A. Use of CD157 in FLAER-based assays for high-sensitivity PNH granulocyte and PNH monocyte detection. Cytometry B. Clin. Cytom. 2014; 86 (1): 44-55.

32. Ware R.E., Rosse W.F., Hall S.E. Immunophenotypic analysis of reticulocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 1995; 86 (4): 1586-9.

33. Tsagarakis N.J., Paterakis G. A simple flow cytometric assay for routine paroxysmal nocturnal hemoglobinuria testing based on immature reticulocytes and granulocytes. Cytometry B. Clin. Cytom. 2012; 82 (4): 259-63.

© коллектив авторов, 2016

УДК 616.155.1-055.5/.7-076.5

Кузьминова Ж.А.1, Плясунова С.А.1, Жогов Б.Б.1, Сметанина Н.С.1 2

ЦИТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД СВЯЗЫВАНИЯ ЭОЗИН-5-МАЛЕИМИДА В ДИАГНОСТИКЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО СФЕРОЦИТОЗА

Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, 117997, г. Москва, Российская Федерация; 2Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, 117997, г. Москва, Российская Федерация

Лабораторная диагностика наследственного сфероцитоза (НС) основывается на обнаружении в периферической крови сфероцитов, снижении индекса сферичности (ИС), снижении осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ). Основываясь на молекулярном дефекте, разработан новый тест диагностики НС на основе связывания внеклеточных фрагментов белка полосы 3 с эозин-5-малеимидом (ЭМА-тест). Целью нашей работы было провести сравнительный анализ чувствительности и специфичности методов, используемых для диагностики НС. Было проанализировано 94 пациента с различными формами анемий. Всем пациентам проведено комплексное клинико-лабораторное обследование, включавшее в том числе исследование ОРЭ, эритроцитометрию и ЭМА-тест как специфические методы диагностики НС. Снижение значения ЭМА-теста было выявлено у 51 (54%) из 94 больных, из них 47 с подтвержденным диагнозом НС. Нормальные значения ЭМА-теста обнаружены в 43 (46%) случаях, из них в 12 - с установленным диагнозом НС. Таким образом, чувствительность ЭМА-теста составила 79%%, специфичность - 80%. Наиболее чувствительными методами диагностики остаются ОРЭ (91%) и ИС (до 96%). Но самая высокая специфичность у ЭМА-теста (80%). В настоящее время ни один из используемых методов диагностики НС не может быть использован как универсальный. Для корректной диагностики заболевания необходимо проведение комплексного обследования.

Ключевые слова: наследственный сфероцитоз; ЭМА-тест; лабораторная диагностика; чувствительность; специфичность.

Для цитирования: КузьминоваЖ.А., Плясунова С.А., Жогов В.В., СметанинаН.С. Цитометрический метод связывания эозин-5-малеимида в диагностике наследственного сфероцитоза. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (3): 168-172.

DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-3-168-172.

Для корреспонденции: Кузьминова Жанна Андреевна, науч. сотр. отд. оптимизации лечения гематологических заболеваний ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, E-mail: zhanna.kuzminova@fccho-moscow.ru