CC BY
43
дуктах пиролиза: автореф. дис. ...канд. техн. наук. Томск, 2010. 22 с.
17. Сарканен К.В., Людвиг К.Х. Лигнин / пер. с англ. М., 1975. 623 с.
18. Шорыгина Н.Н., Резников В.М., Елкин В.В. Реакционная способность лигнина. М., 1976. 368 с.
19. Елкин В.В., Любавина О.В., Шорыгина Н.Н. Действие карбоната натрия на нитролигнины // Химия древесины. Рига, 1973. №13. С.56-61.
20. Примачева Л.Г., Бугаева Т.Н., Скачков В.М. Нитроокис-ление бисульфитных щелоков от варок лиственных и хвойных пород древесины как метод их модификации // Гидролизная и лесохим. промышленность. 1988. № 5. С.11—12.
УДК 581.19+547.992+ 543.429
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИФЕНОЛЬНОГО КОМПЛЕКСА КОММЕРЧЕСКОГО ХМЕЛЕВОГО ЭКСТРАКТА1
А.Н.Чеснокова2, В.И.Луцкий3, И.А.Ушаков4
Национальный исследовательский Иркутский государственный технический университет, 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83.
Впервые изучен состав фенольных соединений нового вида хмелепродуктов - полифенольного экстракта хмеля. Методом ВЭЖХ идентифицировано восемь фенолкарбоновых кислот и два флаван-3-ола. Выделен и идентифицирован спектральными методами (1H, 13C и 2D ЯМР и МС) 1-[(2-метилпропаноил)флороглюцинил]-р-й-глюкопиранозид. Полученные результаты позволят получить дальнейшую информацию о природе образования коллоидного помутнения пива и разработать комплекс мер по его предотвращению. Ил. 4. Табл. 1. Библиогр. 12 назв.
Ключевые слова: экстракт хмеля; ВЭЖХ (Высокоэффективная жидкостная хроматография); фенолкарбоно-вые кислоты; катехины; гликозид ацилфлороглюцина.
STUDY OF POLYPHENOLIC COMPLEX OF COMMERCIAL HOP EXTRACT A.N. Chesnokova, V.I. Lutsky, I.A. Ushakov
National Research Irkutsk State Technical University, 83, Lermontov St., Irkutsk, 664074.
For the first time the composition of phenolic compounds of a new kind of hop products - the polyphenolic extract of hop - becomes the object of the study. By means of HPLC method the authors identified eight phenol carbonic acids and two flavan-3-ols. The authors isolated and identified 1 - [(2-methylpropanoil) floroglyutsin]-p-D- glucopyronoside with the help of spectral methods (1H, 13C and 2D NMR and MS). The obtained results would provide further information on the formation nature of the colloidal turbidity of beer and work out a series of measures to prevent it. 4 figures. 1 table. 12 sources.
Key words: hop extract; HPLC (High Performance Liquid Chromatography); phenol carbonic acids; catechins; acylflorog-lyutsin glycoside.
Полифенольные соединения, содержащиеся в растительном сырье, оказывают непосредственное влияние на качество напитков, поскольку ответственны за их коллоидную и вкусовую стабильность [1]. В последнее время появилось большое количество работ, показывающих, что потребление продуктов питания и напитков, в том числе и пива, обогащенных полифенолами, способствует профилактике сердечнососудистых и раковых заболеваний, благодаря их ан-тиоксидантным свойствам [2-4].
Известно, что окислительные процессы в ходе производства пива приводят к ухудшению качества напитка. Полифенолы, присутствующие в хмеле -незаменимом сырье для производства пива - являются природными антиоксидантами, способными замедлить или предотвратить окисление, и как следствие
способствуют увеличению сроков хранения напитка. Но, с другой стороны, некоторым полифенольным соединениям, как, например, катехинам, приписывается негативное воздействие на качество пива: считается, что они, взаимодействуя с белками, являются причиной помутнения напитка [5,6].
Для сохранения ценных компонентов хмеля и более эффективного его применения в пивоварении стали вырабатывать хмелевые экстракты. По сравнению с шишковым хмелем эти продукты имеют ряд преимуществ: повышается использование горьких веществ на этапах технологии пива и сохраняется неизменным их состав при хранении; хмелевые экстракты имеют большие сроки годности и требуют меньше затрат на транспортировку и хранение, чем шишковый хмель. Благодаря применению хмелевых
Экспериментальная часть работы выполнена в ходе научной стажировки аспиранта А.Н.Чесноковой в Институте биотехнологии Берлинского технического университета (Германия) под руководством профессора Ф.Ю.Метнера.
2Чеснокова Александра Николаевна; аспирант, тел.: (3952) 405122; e-mail:v35@istu.edu Chesnokova Aleksandra, Postgraduate Student, tel.: (3952) 405122; e-mail: v35@istu.edu
2Луцкий Владислав Илларионович; профессор, тел.: (3952) 405122, e-mail:v35@istu.edu Lutsky Vladislav, Professor, tel.: (3952) 405122, e-mail: v35@istu.edu
4Ушаков Игорь Александрович, доцент, тел.: (3952) 405122, e-mail: v35@istu.edu Ushakov Igor, Assistant Professor, tel.: (3952) 405122, e-mail: v35@istu.edu
экстрактов упрощается аппаратурно-технологическая схема процесса и создается возможность автоматического дозирования [7,8].
Наиболее часто используются в пивоваренной промышленности этанольный и СО2-экстракты хмеля [7]. Кроме того, в последнее время на рынке появились новые специфические виды хмелевых экстрактов, как, например, полифенольный экстракт хмеля фирмы Hopsteiner (Германия) - одного из основных мировых поставщиков хмелевого сырья, в том числе и для российских пивоваренных заводов. Однако в литературе не имеется данных по химическому составу этого хмелепродукта.
Изучение полифенольного комплекса хмелевого экстракта и влияния отдельных компонентов на коллоидную стабильность пива в модельных растворах позволит получить дальнейшую информацию о природе образования коллоидного помутнения пива и разработать комплекс мер по его предотвращению. В связи с этим является актуальным охарактеризовать полифенольный комплекс данного экстракта.
Исследование полифенольного комплекса целесообразно начать с изучения его химического состава и идентификации в нем фенольных соединений (гли-козидов фенолов, катехинов, фенолкарбоновых кислот). Этому вопросу и посвящена данная статья.
Экспериментальная часть
Объекты исследования. Полифенольный экстракт хмеля, произведенный в 2010 году, получен от фирмы Hopsteiner (Германия). Раствор регенерации поливи-нилполипирролидона после фильтрации пива и нефильтрованное пиво получены из университетской пивоварни Берлинского технического университета.
Реагенты и материалы. Стандарты индивидуальных соединений для ВЭЖХ: (±)-катехин, (-)-эпикатехин, протокатеховая, п-гидроксибензойная, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая, транс-феруловая и коричная кислоты получены от Sigma-Aldrich (Германия), кофейная кислота - от Fluka (Швейцария), органические растворители - от Merk (Германия), полиамид SC 6.6 (размер пор - 0,05-0,16 мм) - от Macherey-Nagel (Германия), мембранные фильтры (размер пор 0, 45 мкм) - от Sartorius AG (Германия).
1H, 13C и 2D ЯМР-спектры снимали в пятимиллиметровых ампулах на спектрометре Bruker AM400 (400 МГц). Выделенное вещество растворили в дейтероме-таноле (Сй3Ой).
Масс-спектр записывали на приборе HCT Ultra ETD II HPLC-ESI-MS.
УФ-спектры записывали на жидкостном хроматографе Agilent 1100 с диодно-матричным детектором.
Препаративное ВЭЖХ разделение выполняли на хроматографе Agilent 1200, оснащенном программным обеспечением ChemStation. Хроматографирование осуществляли при скорости потока 4 мл/мин на колонке Nucleosil 100-C18-5 (21*250 мм, размер частиц 5 мкм) при температуре 40 °C. Мобильная фаза состояла из воды (элюент А) и ацетонитрила (элюент В). Градиентная программа была следующей: 0-22,5 мин от 10% B до 17,5 % B; 22,5-45 мин от 17,5% B до 25 %
B; 45-68 мин 25% B (изократическое элюирование); 68-68,5 мин от 25% B до 10% B; 68,5-83 мин 10% B (изократическое элюирование). Детектирование осуществлялось одновременно на пяти длинах волн: 210, 250, 290, 310, 360 нм.
Аналитическое ВЭЖХ разделение осуществляли на приборе Agilent 1100 с диодно-матричным детектором, снабженным программным обеспечением ChemStation. Образцы хроматографировались при скорости потока 0,6 мл/мин на колонке Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6x150 мм, размер частиц 5 мкм) при температуре 35 °С. Мобильная фаза состояла из 0,01%-ного водного раствора фосфорной кислоты с pH=3 (элюэнт А) и ацетонитрила (элюент В). Градиентная программа была следующей: 0-15 мин от 0% B до 10 % B; 15-65 мин от10% B до 45 % B; 68-78 мин 0% B (изократическое элюирование). Детектирование производилось одновременно при 260, 280, 325 нм. Объем закола 10 мкл.
Приготовление раствора стандартов. Раствор стандартов, состоящий из смеси (±)-катехина, (-)-эпикатехина, протокатеховой, п-гидроксибензойной, ванилиновой, кофейной, сиреневой, п-кумаровой, транс-феруловой и коричной кислот, растворенных в метаноле, был приготовлен с концентрацией каждого соединения 100 мг/л.
Выделение и идентификация соединения P1. Сорбция полифенольных соединений на полиамиде осуществлялась в сорбционном аппарате, разработанном Ангером [10] (рис. 1). 20 г полиамида суспензировали в дистиллированной воде. Суспензию перенесли в сорбционный аппарат, воду слили.
10 г полифенольного экстракта хмеля растворили в 300 мл дистиллированной воды, отфильтровали под вакуумом через мембранный фильтр и перенесли в аппарат. Аппарат в ходе эксперимента непрерывно продувался азотом. При перемешивании (скорость мешалки 500 об/мин) адсорбировали полифенолы в течение 1 часа. После этого жидкую фазу удалили через сливной кран. При закрытом кране залили в аппарат 300 мл дистиллированной воды, через 15 минут воду слили и просушили оставшийся в аппарате полиамид под вакуумом. В аппарат залили 300 мл смеси ацетон - вода (3:1), % об. При перемешивании десор-бировали полифенолы в течение 1 часа. Элюат слили в круглодонную колбу, органическую часть удалили под вакуумом при 25°С. Дальнейшую работу проводили с водной фракцией.
Водную фракцию экстрагировали гексаном 3 раза по 20 мл в делительной воронке. Остатки гексана из водной фракции удалили при помощи роторного вакуум-испарителя при 40 °С.
Далее проводили очистку водной фракции методом твердофазной экстракции. Для этого использовали картридж Strata C18-E (Phenomenex), заполненный обращенно-фазовым сорбентом.
Перед началом работы картридж кондиционировали 10 мл метанола и 10 мл воды (последовательно). Затем через картридж пропускали исследуемую нами фракцию.
Далее картридж последовательно элюировали
следующими растворителями: 50 мл смеси метанол-вода (30:70) и 50 мл метанола.
Рис. 1. Аппарат для адсорбции полифенольных соединений: 1 - электромотор; 2 - мешалка; 3 - ёмкости для подачи элюентов; 4 - пористая стеклянная перегородка; 5 - сливной кран; 6 - трехходовой кран; 7 - подключение к вакуумному насосу; 8 - подвод инертного газа; 9 - приёмник
Фракцию метанол-вода (30:70) упарили на роторном вакуум-испарителе при температуре 40°С, оставшийся сухой остаток растворили в смеси метанол-вода (50:50). Дальнейшее разделение осуществляли методом препаративной ВЭЖХ. Концентрация и объем вводимого в колонку образца были 1000 мг/мл и 100 мкл соответственно. Фракции, содержащие компонент Р1, объединяли и упаривали. Путем многократного хроматографирования было выделено индивидуальное соединение массой 14 мг, для которого были записаны ЯМР- и масс-спектры.
Идентификация катехинов и фенолкарбоновых кислот в полифенольном экстракте хмеля. 1г хмелевого экстракта растворили в 20 мл дистиллирован-
ной воды, подкисленной соляной кислотой до рН=2. Полученный раствор экстрагировали 3 раза по 5 мл диэтилового эфира. Эфирную фракцию объединили, эфир отогнали. Оставшийся сухой остаток растворили в 0,5 мл метанола и исследовали методом ВЭЖХ.
Обсуждение результатов
Полифенольный экстракт хмеля, согласно информации производителя, представляет собой водорастворимую фракцию этанольного экстракта хмеля.
Для изучения химического состава полифенольно-го комплекса исследуемого экстракта мы провели его предварительное разделение, включающее адсорбцию полифенольных соединений на полиамиде, десорбцию полифенольной фракции с полиамида смесью ацетон - вода (3:1), экстракцию водной фракции гексаном и последующую твердофазную экстракцию на картридже, заполненном обращенно-фазовым сорбентом.
Полиамид широко применяется для адсорбции фенольных соединений. Считается, что механизм действия сорбента заключается в образовании обратимых водородных связей между протоном феноль-ной гидроксильной группы и центром сорбции - атомом кислорода карбонильного фрагмента амидного звена полиамидной цепочки. Десорбция с полиамида рассматривается как результат действия систем растворителей, которые либо проявляют способность образовывать с амидной группой полиамида прочный водородный мостик типа ОН-Н и при этом конкурируют с фенолом, либо действуют преимущественно как протоноакцепторы (ацетон) и сами проявляют сродство к фенолу [9].
В нашем эксперименте мы проводили сорбцию фенольных соединений на полиамиде из водного раствора исследуемого экстракта по методике, предложенной Ангером [10]. Для последующей десорбции полифенольной фракции с полиамида применяли систему ацетон-вода (3:1).
Водная фракция, оставшаяся после удаления ацетона, содержала большое количество хмелевых смол, мешающих дальнейшему разделению. Для их удаления провели экстракцию водной фракции гекса-ном.
Дальнейшую очистку фракции от балластных веществ осуществляли методом твердофазной экстракции на картридже, заполненном обращенно-фазовым сорбентом. После пропускания исследуемой фракции картридж элюировали системой метанол-вода (30:70), а затем метанолом.
Метанольно-водная фракция показала положительный результат при тестировании на образование обратимого коллоидного помутнения в модельных растворах. На хроматограмме данной фракции (рис. 2) имеется доминантный пик (Р1), принадлежащий соединению, которое мы не смогли идентифицировать при помощи имеющихся у нас свидетелей катехинов и фенолкарбоновых кислот. Данное соединение было также обнаружено нами в пробах раствора регенерации поливинилполипирролидона (ПВПП), используемого для фильтрации пива, и в нефильтрованном пиве. Поскольку ПВПП применяется в пивоварении для
повышения коллоидной стойкости напитка путем сорбции полифенолов, исследуемое соединение может иметь влияние на образование коллоидного помутнения пива. Дополнительным подтверждением этого является и присутствие вышеуказанного компонента в нефильтрованном пиве, которое, как известно, характеризуется мутностью из-за присутствия в нем коллоидов. Поэтому дальнейшей задачей было провести препаративное выделение и идентификацию этого соединения. После многократного хроматогра-фирования на препаративном жидкостном хроматографе мы выделили индивидуальное соединение P1, идентификацию которого провели методами 1Н, 13С и 2D ЯМР и МС.
Идентификация соединения P1. В Н-спектре в слабом поле в области ароматических протонов при 5,94 и 6,17 м.д. (таблица) находятся два дублета (J = 2,3 Гц) интенсивностью каждый в один протон. Исходя из величины КССВ эти сигналы принадлежат двум протонам, находящимся в ароматическом кольце в мета-положении по отношению друг к другу. Следовательно, бензольное кольцо является тетразамещен-ным.
В сильном поле при 1,14 м.д. имеется триплет интенсивностью 6 протонов, состоящий из двух дублетов, с КССВ 6,3 Гц. В 13С спектре этим сигналам соответствуют (HSQC) сигналы углеродов при 19,46 и 20,22 м.д. По данным корреляционных спектров HMBC и COSY дублеты при 1,14 м.д. связаны с сигналом при 3,98 м.д. (септет с J=6,3 Гц). Вышеприведенные сигналы доказывают наличие в исследуемом соединении изопропиль-ной группы. Эта группа находится в а-положении (HMBC) к кетогруппе (211,97 м.д.), которая , в свою очередь, присоединена к бензольному кольцу (106,21 м.д.).
Данные 1Н- и 13С-спектров соединения P1 (Рас-
*д. - дублет, дд. - дублет дублетов, т. - триплет, септ. -септет, м. - мультиплет.
13
Судя по положению в С ЯМР спектре сигналов трех оставшихся в бензольном кольце атомов углерода (161,63; 165,61 и 167,50 м.д.), они связаны с атомами кислорода. К одному из них присоединен углеводный остаток, место присоединения которого к бензольному кольцу (161,63 м.д.) следует из корреляци-
творитель - CD3OD, ТМС-0,400 МГц)
Положение б 1H*, м.д. (J, Гц ) б 13С, м.д.
атома число протонов
1 - 161,6 (C)
2 - 106,2 (C)
3 - 167,5 (C)
4 5,95 д. (2,3) 1Н 98,3 (CH)
5 - 165,6 (C)
6 6,17 д. (2,3) 1Н 95,3 (CH)
1' - 212,0 (C)
2' 3,98 септ. (6,3) 1Н 40,5 (CH)
3' 1,14 д. (6,3) 3H 20,2 (CH3)
4' 1,13 д. (6,3) 3H 19,5 (CH3)
1'' 5,04 д. (7,3)1H 101,5 (CH)
2'' 3,50 дд. (9,0/7,3) 1H 74,8 (CH)
3'' 3,44 м. 1H 78,7 (CH)
4'' 3,38 т. 1H 71,2 (CH)
5'' 3,44 м. 1H 78,4 (CH)
6'' 6''а - 3,91 дд. (12,1/2,0) 1H 6"Р - 3,71 дд. (12,1/5,5) 1H 62,5 (CH2)
Рис. 2. Хроматограмма метанольно-водной фракции
онного спектра HMBC, в котором дублет аномерного протона (5,04 м.д., J=7,3 Гц) дает интенсивный кросс-пик с сигналом при 161,63 м.д. и слабые кросс-пики с сигналами при 165,61 и 167,50 м.д. Величина КССВ аномерного протона соответствует в-пиранозной форме углевода. Величины ХС углевода в С ЯМР-спектре (62,46; 71,17; 74,82; 78,38 и 78,68 м.д.) характерны для p-D-глюкопиранозида [11].
Оставшиеся два заместителя бензольного кольца, опираясь на данные ЯМР (1Н и 13С) и масс-спектра, являются двумя гидроксильными группами в мета-положении.
УФ-спектр соединения имеет максимум поглощения при Л=290 нм, что характерно для производных ацилфлороглюцина.
В масс-спектре исследуемого соединения (ESI) имеется молекулярный ион 358 и основной осколочный ион массой 196. Осколочный ион образуется при потере молекулярным ионом 162 единиц массы, соответствующих остатку гексозы.
На основании вышеизложенного следует, что выделенное соединение имеет структуру 1-6-D-глюкопиранозид (2-метилпропаноил)флороглюцина, представленную на рис. 3. Данные ЯМР-спектра ука-
руемых соединений: 260 нм - для производных бензойной кислоты, 280 нм - для катехина, эпикатехина, 325 нм - для производных коричной кислоты. Эфирную фракцию полифенольного экстракта хмеля анализировали методом ВЭЖХ. Хроматограмма эфирной фракции, записанная на длине волны 280 нм, представлена на рис. 4. Идентификация соединений производилась по временам удерживания в сравнении со стандартами и по УФ-спектрам.
HO.
OH
HO
Рис. 3. Структурная формула соединения Р1
Выводы, которые можно сделать с учетом изложенного выше, сводятся к следующему:
1. Впервые изучен состав фенольных соедине-
mAU 250
200-
150
100-
50-
4
Рис. 4. Хроматограмма эфирной фракции: 1 - протокатеховая кислота; 2 - п-гидроксибензойная кислота; 3 - (±)-катехин; 4 - ванилиновая кислота; 5 - кофейная кислота; 6 - сиреневая кислота; 7 - (-)-эпикатехин; 8 - п-кумаровая кислота; 9 - транс-феруловая кислота; 10 - коричная кислота; 11 - соединение Р1
занного соединения были опубликованы в 2005 г. [12].
Идентификация фенолкарбоновых кислот и катехинов. Для идентификации фенолкарбоновых кислот и катехинов в полифенольном экстракте хмеля мы провели экстракцию диэтиловым эфиром, т.к. общеизвестно, что он является хорошим экстрагентом данных соединений из растительного сырья.
Детектирование проводили на трех длинах волн, соответствующих максимумам поглощения анализи-
ний коммерческого полифенольного экстракта хмеля.
2. Методом ВЭЖХ идентифицировано: восемь фенолкарбоновых кислот (протокатеховая, п-гидроксибензойная, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая, транс-феруловая, коричная и кофейная) и два флаван-3-ола (катехин, эпикатехин).
3. Выделен и идентифицирован спектральными методами (1Н, 13С и 2й ЯМР и МС) 1-8-й-глюкопиранозид (2-метилпропаноил)флороглюцина.
1. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clinical Nutrition, 79(5):727-747, 2004.
2. Gerhauser C., Alt A., Heiss E., Gamal-Eldeen A., Klimo K., Knauft J., Neumann I., Scherf H.-R., Frank N., Bartsch H., and Becker H. Cancer Chemopreventive Activity of Xanthohumol, a Natural Product Derived from Hop. Molecular Cancer Therapeutics, 1: 959-969, 2002.
3. Miranda, C. L., Stevens, J. F., Ivanov, V., McCall, M., Frei, B., Deinzer, M. L., and Buhler, D. R. Antioxidant and prooxidant actions of prenylated and nonprenylated chalcones and flava-nones in vitro. J. Agric. Food Chem, 48: 3876-3884, 2000.
4. De Keukeleire, D., De Cooman, L., Rong, H., Heyerick, A., Kalita, J., Milligan, S. R. Functional properties of hop polyphenols. Plant Polyphenols 2: Chemistry, Biology, Pharmacology, Ecology; Kluwer Academic, Plennum Publishers: New York, 1999.
5. McMurrought I., Malcoln J. Loughrey and Gerald P. Hennigan. Content of (+)-Catechin and Proanthocyanidins in Barley and Malt Grain / J.Sci/Food Agric. 1983, 34, 62-72.
ский список
6. Papp A., Winnewisser W., Geiger E. and Briem F. Influence of (+)-Catechin and Ferulic Acid on Formation of Beer Haze and Their Removal through different Polyvinylpolypyrollidone Types / Journal of The Institute of Brewing Volume 107, No. 1, 2001. 55-60.
7. Кунце В., Мит Г. Технология солода и пива: пер. с нем. СПб.: Профессия, 2001. 912 с.
8. Тихомиров В.Г. Технология пивоваренного и безалкогольного производств. М.: Колос, 1998. 448 с.
9. Тюкавкина Н.А., Литвиненко В.И., Шостаковский М.В. Хроматография на полиамидных сорбентах в органической химии. Новосибирск: Наука, 1973. 176 с.
10. Anger H.-M. Über die Stabilisierung von Bier unter besonderer Berücksichtigung der Polyphenole. Dissertation, TU Berlin, 1983. 40-41.
11. S.Seo, J.Tomita, K.Tori and Y. Yashimura / J.Am.Chem.Soc. 100, 1978. p. 3331.
12. Bohr G., Gerhäuser C., Knauft J., Zapp J., Becker H. Antiinflammatory Acylphloroglucinol Derivates from Hops (Humulus lupulus). J.Nat Prod. 2005, 68, 1545-1548.
