Исследование оптического поглощения сенсибилизатора в биологических тканях Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ

Удк 535.34:576.8.097.32:616-006-018

I.G. Meerovich1, A. A. Stratonnikov2, A.V. Ryabova2, G.A. Meerovich2, N.A. Oborotova1,

Z.S. Smirnova1,I. Yu. Kubasova1, A. Brandis3, E.A. Lukyanets4, P. Bendel3, V.B. Loschenov2,

A. Scherz3, A. Yu. Baryshnikov1

INVESTIGATION OF OPTICAL ABSORPTION OF SENSITIZERS IN BIOLOGICAL TISSUE

1 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 1Natural Sciences Center of A.M. Prokhorov General Physics Institute RAS, Moscow

3Weizmam Institute of Science, Israel 4State Research Center “NIOPIK", Moscow

ABSTRACT

The work deals with study of optical absorption of sensitizers in biological tissue. It is shown that absorbance can be used as a tool which allows to study the biodistribution of sensitizers as well as to investigate their interaction with tissue in vivo. Parameters of absorption of the photosensitizer greatly influences the efficiency of using the irradiation for diagnostics and photodynamic therapy of malignancies. The simple technique to characterize the absorptions of biological tissues in vivo is presented. Results of investigation of some sensitizers in tissue of experimental animals are discussed.

Key words: absorption, sensitizer, selectivity of accumulation, efficiency of excitation, tumor

И.Г. Меерович1, А.А. Стратонников2, А.В. Рябова2, Г.А, Мееровт2, H.A. Оборотова1, З.С. Смирнова1, И.Ю. Кубасова1, А. Брандис3, Е.А. Лукъянец4, П. Бенделъ3, В.Б. Лощеное2,

А. Шерц3, А.Ю. Барышников1

ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКОГО ПОГЛОЩЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ

‘ГУРОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, Москва 2Центр естественно-научных исследований Института общей физики им. А. М. Прохорова Российской Академии наук, Москва 3Институт Науки им. Вейцмана, Израиль 4ФГУЛ ‘ТНЦ "тОПИК"", Москва

РЕЗЮМЕ

Рассмотрена роль оптического поглощения сенсибилизаторов в биологической ткани как инструмента, позволяющего исследовать их биораспределение и взаимодействие с организмом in vivo. Обсуждается влияние параметров поглощения сенсибилизаторов на эффективность использования возбуждающего света при флюоресцентной диагностике и фотодинамической терапии новообразований. Приведена методика определения характеристик поглощения in vivo. Анализируются результаты исследований поглощения некоторых сенсибилизаторов в тканях экспериментальных животных.

Ключевые слова: поглощение, сенсибилизатор, селективность накопления, эффективность возбуждения, опухоль

ВВЕДЕНИЕ

Эффективность многих современных методов диагностики и терапии новообразований, например, флюоресцентной диагностики [2], магнитно-резонансной томографии [9], фотодияамической [3] и каталитической [1] терапии, достигается в значительной мере благодаря использованию препаратов-сенсибилизаторов с определенными физико-химическими свойствами и избирательным накоплением в опухоли.

Биораспределение сенсибилизаторов в организме, в частности, селективность их накопления в опухоли по отношению к здоровым тканям, - важнейший фактор, определяющий протекание сенсибилизированных процессов в организме. Для изучения биораспределения сенсибилизаторов в динамике экстрактивным методом необходимо умерщвление большого количества животных. Кроме того, полученная таким образом информация часто оказывается неточной, поскольку забой животных и последующие процедуры экстракции могут существенно изменить состав и состояние изучаемых сенсибилизаторов. Поэтому более целесообразна оценка биораспределения сенсибилизаторов in vivo.

В последние годы в качестве сенсибилизаторов активно изучаются производные порфиринов и металло-порфинов, фталоцианинов, нафталоцианинов, хлоринов и бактериохлорофиллов. Многие из них обладают способностью флюоресцировать, и это широко используется для оценки биораспределения в динамике in vivo [10], флюоресцентной диагностики [2] и т.д. Однако некоторые сенсибилизаторы (например, “Визудин”, “Тукад”) не флюоресцируют либо обладают очень слабой фосфоресценцией, что не позволяет использовать флюоресцентный метод для исследования процессов в сенсибилизированных тканях. Другойизвестный метод, связанный с использованием радиоактивных изотопов, требует специального синтеза меченных изотопами сенсибилизаторов, а для проведения опытов нужны специальные условия. Кроме того, этот метод не позволяет обнаружить изменений состояния сенсибилизаторов в организме (например, их агрегации). С другой стороны, соединения, используемые в качестве сенсибилизаторов, имеют, как правило, достаточно интенсивные узкие полосы поглощения в длинноволновом красном или ближнем инфракрасном диапазоне. Интенсивность этого поглощения связана с концентрацией сенсибилизаторов, и, таким образом, измерение его характеристик может помочь оценить биораспределение сенсибилизаторов, в том числе и в динамике.

Изучение поглощения в биологических тканях особенно важно для фотосенсибилизаторов (ФС), которые используются для флюоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ), поскольку именно благодаря поглощению света происходит фотовозбуждение молекул ФС и протекает фотохимическая реакция генерации цитотоксических агентов (син-глетного кислорода или свободных радикалов) при ФДТ либо флюоресцентного излучения при ФД.

Однако несенсибилизированная биологическая ткань также обладает значительным поглощением. Уровень его определяется, в первую очередь, длиной волны поглощаемого излучения. Основными поглотителями света в биологической ткани являются гемог-

лобин крови, определяющий поглощение в видимой области до 700 нм, и вода, поглощающая в ближнем инфракрасном диапазоне (>950 нм). В спектральной области 700-950 нм, называемой также спектральной областью прозрачности биоткани, ее поглощение минимально [5].

Соотношение между собственным поглощением биологической ткани и поглощением сенсибилизатора в ней является одним из важнейших факторов, определяющих эффективность сенсибилизированных фотобиологических процессов. Высокая эффективность использования энергии возбуждающего света, а также максимальная глубина его проникновения в ткань могут быть достигнуты, если возбуждение осуществляется в спектральной области прозрачности биоткани (700-800 нм), соответственно полоса поглощения фотодинамически активного перехода молекул ФС также должна лежать в этой области. Для достижения наибольшей эффективности ФС должен обладать высоким уровнем поглощения, значительно превышающим собственное поглощение биоткани. Наконец, поскольку возбуждение ФС, как правило, осуществляется излучением лазеров или других источников узкополосного излучения, а вызывающее побочную фототоксичность излучение естественного освещения широкополосно, то предпочтительно, чтобы ФС имели узкий спектр поглощения. Целесообразность этого связана еще и с тем, что агрегация молекул ФС, вызывающая уширение спектра, также приводит к снижению его фотодинамической активности.

Высокая селективность накопления сенсибилизатора в опухоли по сравнению с нормальной тканью и кожей также позволяет избежать потерь энергии света на поглощение вне пределов опухоли, если она расположена под кожей или под слизистой.

Целью настоящей работы было рассмотреть метод исследования оптического поглощения сенсибилизаторов in vivo как инструмент для изучения их биораспределения и взаимодействия с биологической тканью, а также обсудить влияние параметров поглощения сенсибилизаторов на эффективность использования возбуждающего света при ФД и ФДТ новообразований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования в работе были использованы сенсибилизаторы “Фталосенс” (безметальныйсульфофта-лоцианин) [11] и тетра-З'фенилтиофталоцианин гвдро-ксиалюминия [3-(PhS)4-PcA10H] [4] (ФГУП “ГНЦ “НИ-ОПИК”, Россия), предназначенные для ФДТ и ФД новообразований, а также марганцевое производное бак-териохлорофилла [6] (Институт Науки им. Вейцмана, Израиль), перспективное для МРТ [9].

Для исследования поглощения и флюоресценции сенсибилизированных биологических тканей препараты вводились мышам-гибридам первого поколения F, (С5?В1/6 х DBA/2)c опухолью Эрлиха. Ввиду гидрофоб-ности [3-(PhS)4-PcA10H] этот препарат вводился лабораторным животным в липосомальной форме.

Контрастирование магнитно-резонансной томографии с использованием марганцевого производного бактериохлорофилла изучалось на бестимусных мышах CD1 с глиомой Сб.

Рис. 1. Схема применения спектроанализатора LESA-Ol-BIOSPEC для неинвазивного измерения поглощения биологической ткани in vivo:

1 - компьютер; 2 - спектр поглощения; 3 - спектроанализатор с оптоволоконным входом; 4 - приемный световод; 5 - подающий световод; 6 - источник света; 7 - зондируемая область

Аппаратура и методики

Спектры поглощения и флюоресценции в биологических тканях in vivo исследовались с помощью волоконно-оптического спектроанализатора ЛЭСА-01-Биоспек. Для исследования спектров поглощения использовался метод спектроскопии диффузного отражения [12; 13]. Схема исследования поглощения и геометрия зондируемой области представлены на рис. 1. Дистальные концы приемного и подающего световодов закреплены параллельно друг другу на расстоянии d. При исследовании поглощения излучение с непрерывным спектром от галогенной лампы через подающий световод падало на поверхность ткани. Часть вошедшего в ткань излучения, рассеянная по направлению к поверхности, после прохождения через зондируемую область попадала в приемный световод и поступала на вход спектроанализатора. Оба световода при измерении контактировали с поверхностью ткани по нормали к ней.

Зондируемая область, т.е. область, в которой находится большая часть траекторий фотонов, дающих вклад в измеряемый сигнал, имеет “бананообразную” форму с концами у торцов подающего и приемного световодов. Для определения глубины зондирования Z были использованы следующие простые аналитические выражения [12]:

при d « 8 (слабое поглощение);

(1)

4

dSV/2 2

при d»S (сильное поглощение)

ределяется через безразмерный коэффициент дифференциальной длины пути р:

<Х>= (М. (2)

В диффузионном приближении, когда рассеяние превалирует над поглощением и расстояние между световодами больше длины рассеяния (1/(х'5), коэффициент дифференциальной длины пути определяется следующим выражением:

Г , V"

Ь_43 d 2 d+8

(3)

Для количественного определения интегрального поглощения сенсибилизированной ткани на пути <Ь> использовался логарифм обратного отражения:

АжОь) =1п

rJL-L

I-L

(4)

где 8=[3^а(|ха+|д.'8)]'1И - глубина проникновения света в ткань (диффузионная длина);

)х'8 и - редуцированный (транспортный) коэффициент рассеяния и коэффициент поглощения.

Средняя дайна пути фотонов через ткань <1> между приемным и подающим световодами (так называемая дифференциальная длина пути) из-за рассеяния значительно превышает расстояние между ними и оп-

где I - сигнал, измеряемый в эксперименте;

1СТ - сигнал отражения от стандартного образца на основе BaS04, имеющего коэффициент отражения, близкий к единице;

1т-темновой сигнал детектораспектроанализатора.

В исследованиях использовалось расстояние между подающим и приемным световодами 6 мм. Глубина проникновения света в ткань в использованном диапазоне длин волн (650-800 нм) составляет 5-8 мм. Таким образом, глубина измерения может быть оценена значениями 3-4 мм. Получаемая информация усредняется по измеряемому объему (объему, в котором происходит миграция фотона).

В нашем случае d < 8, и наблюдается слабая зависимость <L> от ца. Видно, что как при слабом, так и при сильном поглощении дифференциальный оптический путь значительно превышает расстояние между подающим и приемным световодами. Из диффузионного приближения можно оценить, что для рассматриваемого спектрального диапазона значение <L> составит 2,5-3,5 d.

МРТ-исследования проводили на томографе BioSpec 47/30, управляемом с компьютера программой ParaVision (“Bruker”, Германия) с использованием протоколов “инверсии-восстановления” и Т1-взве-шенного спин-эха.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве примера реализации предлагаемого подхода рассмотрим результаты наших исследований некоторых сенсибилизаторов, в которых изучались характеристики и особенности их поглощения in vivo. По ним оценивались уровень и селективность накопления сенсибилизатора в опухоли по отношению к нормальной ткани, а также динамика их изменения.

Спектр поглощения [3-(PhS)4-PcA10H] в биологической ткани представляет.собой достаточно узкий интенсивный пик со спектральным максимумом вблизи 720 нм, где собственное поглощение биологической ткани невелико (рис. 2). Поглощение ФС в опухоли значительно (примерно в 4 раза) превышает поглощение в нормальной ткани, из чего можно сделать вывод, во-первых, о высокой селективности накопления

Длин* волны, нм

Рис. 2. Спектр поглощения тетра-3-фенилтиофталоци-анина гидроксиалюминия in vivo в опухоли (1) и нормальной ткани (2) мыши:

ФС введен внутривенно в дозе 4 мг/кг за 24 ч до исследования

Длина волны, нм

Рис. 5. Спектры поглощения “Фталосенса” через 3 часа после введения в дозе 4 мг/кг:

1 - опухоль; 2 - нормальная ткань; 3 - поглощение в опухоли перед введением “Фталосенса”

1 ■

о 4----------,------------,----------,-----------г-

0,1 i 10 100 1000 Время, часы

Рис. 3. Зависимость поглощения тетра-3-фенилтио-фталоцианина гидроксиалюминия in vivo в опухоли мыши от времени после введения ФС в яипосомальной форме в дозе 4 мг/кг

Рис. 6. Спектры поглощения Мп(П) (А) и Мп(ГО) (В) форм сенсибилизатора в фетальной сыворотке

Время, часы

Рис, 4. Зависимость интенсивности флюоресценции тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия от времени после введения в форме в дозе 4 мг/кг:

—и— - опухоль;

_о_ - нормальная ткань

Длила волны, ни

Рис. 7. Спектр поглощения Мп(Ш)-производного бак-териохлорофилла и его метаболитов in vivo в опухоли в различные моменты времени после его внутривенного введения в дозе 8 мг/кг:

1-9 мин;

2 - .25 мин;

3-60 мин;

4 - 3 ч

ФС в опухоли по сравнению с нормальной тканью и, во-вторых, что не менее 80 % энергии света поглощается фотосенсибилизатором и идет на его фотовозбуждение. По изменению интенсивности основного пика поглощения ФС in vivo изучена динамика его накопления в опухоли (рис. 3).

Высокая селективность накопления ФС в опухоли по отношению к нормальной ткани была подтверждена результатами исследований уровня его накопления флюоресцентным методом (рис. 4). Высокая эффективность фотовозбуждения [3-(PhS)4-PcA10H] в сочетании с высокой селективностью его накопления обеспечили возможность достижения высокой эффективности ФДТ [4].

Рассмотрим другой ФС - Фталосенс, представляющий собой безметальный сульфофталоцианин [11]. Исследования показали (рис. 5), что спектр поглощения Фталосенса в биоткани имеет значительную спектральную ширину (более 60 нм) и достаточно низкую интенсивность даже при введении его в дозе 10 мг/кг (поглощение препарата in vivo не превышает собственного поглощения биологаческой ткани), что, по-види-мому, связано с агрегацией этого ФС при его введении в водном растворе.

Следовательно, на возбуждение Фталосенса расходуется не более половины энергии возбуждающего света. Для повышения эффективности возбуждения этого ФС можно рекомендовать создание его лекарственной формы, предотвращающей агрегацию, например, с использованием липосомальной технологии.

Нами также исследовалось in vivo марганцевое производное бактериохлорофилпа, которое имеет две формы, отличающиеся степенью окисления иона марганца - Мп(Ш) и Мп(И). Они заметно отличаются по форме спектра поглощения, а длины волн характеристических максимумов их поглощения в инфракрасной области лежат в диапазонах 825-835 нм и 770-780 нм соответственно. Спектры поглощения обеих форм со-единенияв фетальной сыворотке приведены на рис. 6.

Используя предлагаемую методику, мы изучали особенности спектров поглощения этого соединения в тканях при внутривенном введении его Мп(1П)-формы в водном растворе мышам Ft с опухолью Эрлиха. Эти исследования позволили оценить уровень и селективность его накопления в тканях, динамику их изменения, а также обнаружить признаки биохимических превращений этого соединения в организме. Оказалось, что после введения Мп(И1)-формы соединения в спектрах поглощения сенсибилизированных тканей присутствуют полосы поглощения с максимумами около 835,780 и 680 нм, имеющие разную динамику изменения (рис.7).

Первая из них обусловлена поглощением введенной мышам Мп(Ш)-формы исследуемого соединения. Полоса со спектральным максимумом 680 нм, по-видимому, обусловлена появлением и накоплением продукта биохимической деградации (гидролиза и окисления) производных бактериохлорофилпа - хлорина; ее интенсивность в течение опыта монотонно возрастала.

Появление полосы поглощения со спектральным максимумом 780 нм, по нашему предположению, связано с образованием Мп(П)-формы исследуемого соединения при восстановлении его вводимой Mn(III)-

0.10-,

Время, часы

Рис. 8. Динамика изменения содержания Мп(П1>про-изводного in vivo в опухоли (1) и нормальной ткани (2) мыши.

Рис. 9. Увеличение МРТ-контраста между опухолью и нормальной тканью при использовании Мп(П1)-про-изводного бактериохлорофилла в качестве контрастирующего агента.

формы аскорбиновой кислотой, эндогенно синтезируемой и присутствующей в большом количестве в организме животных [8].

Накопление Мп(1П)-формы сенсибилизатора оценивалось по площади спектрального пика ее поглощения. Показано, что уровень сенсибилизатора в опухоли достаточно быстро (через 10-20 мин после введения) достигает максимального значения, после чего медленно снижается (рис.8). При этом достигается высокая селективность накопления в опухоли (индекс селективности более 4), которая сохраняется в течение нескольких часов. Накопление Мп(П)-формы имеет подобную же динамику, однако ее сложнее оценить количественно из-за спектрального наложения полосы поглощения дезоксигемоглобина крови (около 760 нм).

Высокая селективность накопления сенсибилизатора в сочетании с выраженными парамагнитными свойствами ионов марганца [9] позволяет предположить у

него способность повышать контраст опухолей при МРТ. Это и было подтверждено при исследованиях на бестимусных мышах с глиомой Сб. Внутривенное введение марганцевого производного бактериохлорофил-ла даже в невысокой дозе (около 10 мг/кг) позволило существенно (на 35-40 %) повысить контраст этой опухоли на фоне окружающей здоровой ткани (рис. 9).

ВЫВОДЫ

Метод спектроскопии диффузного отражения может быть эффективно использован для исследования поглощения сенсибилизаторов in vivo. Результаты этих исследований позволяют оценить динамику и селективность накопления сенсибилизаторов, обнаружить и исследовать биохимические процессы, происходящие при взаимодействии сенсибилизаторов с организмом.

Характеристики поглощения сенсибилизаторов в тканях определяют эффективность их фотовозбуждения и вследствие этого существенно влияют на эффективность процессов, лежащих в основе фотодинами-ческой терапии и флюоресцентной диагностики. Для достижения высокой эффективности целесообразно использовать ФС со спектральным максимумом поглощения в области максимальной прозрачности биологической ткани (700-800 нм), узким спектром и высокой интенсивностью поглощения, превышающей собственное поглощение биологической ткани.

Работа по сенсибилизаторам на основе производных фталоцианинов выполнена в рамках научно-технической программы “Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов диагностики и лечения онкологических и других заболеваний” при финансовой поддержке Правительства г. Москвы и Министерства промышленности, науки и технологий Российской Федерации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Борисенкова С.А., Гиренко Е.Г., Калия О.Л. Механизмы окисления аскорбиновой кислоты и проблемы каталитической терапии // Российский химический журит-1998.-Т. XLII, №5.-С. 111-116.

2. Вакуловская Е.Г., Летягин В. II., Погодит Е.М. Фото-дииамическая терапия и флюоресцентная диагностика у больных раком молочной железы // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2003. - Т. 2, № 4. - С. 57-66.

3. Лукьянец Е.А. Новые фотосенсибилизаторы для фото-динамической терапии // Российский химический журнал. - 1998. - Т. XLII, № 5. - С. 9 - 17.

4. Смирнова 3. С., Меерович И.Г., Лукьянец и др. Фенилти-озамещенные фталоцианины - новые фотосенсибилизаторы ближнего инфракрасного диапазона // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2004. - Т. 3, № 1. -С,55-60.

5. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. - Саратов: Издательство Саратовского университета, 1998.

6. ШерцА., Саломон Й., Гуго Ш. и др. Способ получения металлсодержащих производных бактериохлорофил-ла, новые металлированные производные бактериох-лорофилла, фармацевтическая композиция // Патент РФ № 2193038 от 20.11.2002. Конвенционный приоритет от 24.11.1995.

7. Ashur Brandis A., Greenwald М. et al. Control of redox transitions and oxygen species binding in Mn centers by biologically significant ligands; model studies with [Mn]-bacteriochlorophyll a I! J. Am. Chem. Soc. - 2003. - Vol. 125,N.29.-P. 8852-8861.

8. Liu J., Yeo H.C., IJvervik-Douki E. et al. Chronically and acutely exercised rats: biomarkers of oxidative stress and endogenous antioxidants // J. Appl. Physiol. - 2000, -Vol. 89.-P. 21-28.

9. Lauffer R.B. Paramegnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design// Chem. Rev. -1987. - Vol. 87. - P. 901-927.

10. Loschenov V.B., Luckjanetz E.A., Stratonnikov A.A. et al. The noninvasive evaluation of absolute fluorochrom concentration in various tissues in vivo by means of standard samples with modeled optical properties // Proc. SPIE. -1995. - Vol. 2326. - P. 415-419.

11. Lukyanets E.A., Derkacheva V.M., Chissov V.I. etal. The study of sulphonated metal-free phthalocyanines in vitro and in vivo II Materials of the 9th World Congress of The International Photodynamic Association, Miyazaki, Japan, 20-23 May, 2003.

12. Stratonnikov A.A., Edinac N.E., Klimov D. V. et al. The Control of Photosensitizer in Tissue During Photodynamic Therapy by Means of Absorption Spectroscopy //SPIE. - 1996. - Vol. 2924. - P. 49-60.

13. Stratonnikov A. A., Loschenov V.B. Evaluation of blood oxygen saturation in vivo from diffuse reflectance specta /

/ J. Biomed. Opt. - 2001. - Vol. 6, N. 4. - P. 457-467,-

14. van der Zee P., Cope M„ Arridge S.R. et al. Experimentally measured optical pathlengths for the adult head, calf and forearm and the head of the newborn infant as a function of interoptode spacing //Adv. Exp. Med. Biol. - 1992. -Vol. 316.-P. 143-153.