CC BY
35
УДК 574:57.083.1
Гейдарова Х.Б., Калёнов С.В., Костылева Е.В.
ИССЛЕДОВАНИЕ НЕФТЕДЕСТРУКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОМ, ВЫДЕЛЕННЫМ ИЗ СООБЩЕСТВА ГИПЕРСОЛЁНОГО ОЗ. МАСАЗЫР
Гейдарова Хураман Бахаддин кызы, студентка 1 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии; e-mail: huramas hka1997@mail. ru
Калёнов Сергей Владимирович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии; Костылева Елена Валерьевна, к.х.н., доцент кафедры промышленной экологии. Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия.
Статья посвящена исследованию нефтедеструкции экстремально галофильным биоценозом оз.Масазыр. В результате работы из образцов соленой воды озера Масазыр был выделен и индентифицирован микроорганизм-нефтедеструктор - Haloferax alexandrinus. Исследовано влияние температурного режима, pH и качества воды на процесс очистки от нефти. Установлены оптимальные условия для деструкции нефти.
Ключевые слова: нефтедеструкция, очистка от нефти, микроорганизм-нефтедеструктор, Haloferax alexandrinus, изолят, галоархеи.
THE STUDY OF OIL DESTRUCTION BY A MICROOIRGANISM ISOLATED FROM MASAZYR LAKE
Geydarova Huraman Bahaddin kizi., Kalenov Sergey Vladimirovich., Kostyleva Elena Valerievna D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
The article is devoted to the study of oil destruction by the extremely halophilic biocenosis of Lake Masazyr. As a result of this work was isolated and identified Haloferax alexandrinus - microorganism-oil destructor. The influence of temperature, pH and water quality on the process of oil purification was investigated. The optimal conditions for the destruction of oil are established.
Keywords: oil destruction, oil refining, microorganism-oil destruction, Haloferax alexandrines, isolate, haloarchaea.
Окружающая среда подвергается тяжелейшим воздействиям антропогенного характера, ее способность к самоочищению резко падает. Особенную угрозу для водных объектов представляют загрязнения нефтью и нефтепродуктами как в России, так и за рубежом. Объекты нефтедобычи зачастую располагаются в засушливых районах, где могут встречаться соровые солончаки, которые образуются на дне котловин периодически высыхающих солёных озёр. Поскольку микроорганизмы являются уникальными индикаторами, отображающими любые изменения в состоянии воды, то использование их для очистки объектов, содержащих большое количество соли, от нефтяных загрязнений рационально [1]. Так, можно использовать экстремофилы, обладающие особыми функционал-биологическими свойствами, дающими им способность выживать в условиях повышенного осмотического давления, температуры, рН. Таким образом, была поставлена задача поиска эффективного микроорганизма-нефтедеструктора, функционирующего в условиях высокой солености и широком диапазоне температур, а также разработки подходов к применению этого микроорганизма.
Объектом данного исследования являлось сообщество галофильных микроорганизмов из оз. Масазыр (г. Баку, Азербайджан), расположенного на Апшеронском полуострове, известном добычей углеводородов (рис.1). Являясь важным источником для производства соли, самосадочные озера
отличаются изумительными природными
свойствами. Поскольку соленость очень высокая (300-350 г/л), они необитаемы для рыб и многих других организмов, традиционно населяющих озера. В окрестностях озера ведется добыча нефти.
Рис. 1. Озеро Масазыр, Баку
Для исследования процесса нефтедеструкции были взяты образцы из нескольких слоев озера: поверхностного слоя, глубинного слоя (ил) на глубине 0,5 м и кристаллы соли, используемые для выделения микроорганизма-нефтедеструктора (GPS 40°28'30.3"N 49°44'59.4"E). Выделение
перспективного изолята проводилось методом накопительных культур и методом Коха на среде для галобактерий следующего состава: минеральная среда (г/л)- NaCl-250, KCl-3, MgSO^7H2O-20,
агар-агар - 20; р-р м/э (мг/л)- СиБ04*5Н20 -0,1, Ре804*7Н20-2, 2пБ04*7Ы20-0,1, Ка2Мо04*2^0-0,03.,СоС12 *Н20-0,2, Трилон Б (^ББТА)^, МпС12*4Н20-0,03, №«2*4^0-0,02; р-р А (г/л) -КШз-10, М§804х7Н20-2, СаС^-0,2; р-р В-Ка2НР04х5Н20-15, КН2Р04-0,7; вода
водопроводная, нефть Чаяндинского
нефтегазоконденсатного месторождения (ГОСТ Р 55475-2013) 6 мл/л, в качестве источника углерода.
Метод выделения основан на культивировании в элективных условиях, обеспечивающих
преимущественное развитие определенной группы или вида микроорганизмов. Идентификация, с применением 16Б рРНК-анализа, выявила наиболее активный микроорганизм-нефтедеструктор -Иа1о/егах а1ехап&тш, потребляющий нефть в качестве основного источника углерода, устойчивый к перепадам температур, рН и качеству воды. Впервые Иа1о/егах а1ехап^тш был выделен в г. Александрии (Египет). Данный микроорганизм не способен расти в анаэробных условиях с нитратом. Оптимальный рост происходит при 250 г/л ЫаС1 с высокой потребностью в MgSO4 (40 г / л). Диапазон температур составляет 20-55°С [2].
Для оценки влияния метаболитов на хранение культуры культивирование проводили по методике с внесением и без внесения адсорбента. В качестве адсорбента был взят активированный уголь АГ-3, инкапсулированный в агаризованную оболочку. Подготовку питательной среды проводили следующим образом. В колбы общим объемом 250 мл вносили 1,5 г гранулированного активированного
угля. Для фиксации адсорбента на дно колбы добавляли 16 мл питательной среды. Стерилизацию проводили при 0,7 ати в течение 20 минут, охлаждали до застывания агара. Отдельно готовили питательную среду, состоящую из (г/л): NaCl - 250, MgSÜ4*7H2Ü - 20, KCl - 3, глицерин - 2,5, нефть - 6 мл/л, р-р А и В по 100 мл/л, вода водопроводная, стерилизовали при тех же условиях. После охлаждения питательную среду в количестве 100 мл стерильно заливали в колбы с адсорбентом и засевали клетками выделенной культуры. Посевной материал составлял 10% об. Время экспозиции 7 суток при постоянном перемешивании при 150 об/мин на орбитальной платформе NewBrunswick G10 59 (NewBrunswick, USA), температуре 37-40°С и постоянном освещении лампой PHILIPS TL-D 18W/33-640 (500 Лк).
Основным критерием очистки является степень деструкции нефти, а также прямо пропорционально связанная с ней величина - плотность наработанной биомассы. Для измерения массовой концентрации нефтепродуктов в исследуемых образцах применялся концентратомер нефтепродуктов «ИКН-025». Опыты проводились с заранее наработанной биомассой изолята. Из анализа современных работ был определен температурный диапазон 30-450С, в котором наиболее благоприятно размножаются галоархеи [1]. Для исследования были выбраны три температурных показателя: 330С в качестве наименьшей, 37,50С, как средняя и наиболее свойственная для вод оз. Масазыр, и 40 0С, как максимальная. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Экспериментальные данные по определению оптимального температурного режима
Содержание нефти в воде %,(об.)
№ опыта Температура проведения, С Продолжительность очистки, час Эффективность очистки Э, %
0 168 240 384
1 33 0,60 0,22 0,19 0,08 86,48
2 37,5 0,60 0,19 0,16 0,04 93,01
3 40 0,60 0,21 0,18 0,05 91,67
Из полученных результатов видно, что лучше всего нефть деградирует при 37,50С, поэтому в последующих исследованиях очистка проводилась при этой температуре.
Следующий этап анализа заключался в определении интервала солености загрязненной экосистемы, в котором наиболее эффективно будет работать будущий биопрепарат. Для этого был проанализирован интервал солености с содержанием ЫаС1 от 10 до 250 г/л. Через определенные промежутки времени стерильно отбиралось по 1 мл культуральной суспензии. Оценка роста культуры проводилась путем измерения оптической плотности при длине волны 540 нм на ФЭК. Результаты приведены на рисунке 2.
Рис. 2. Кривые роста изолята в диапазоне солености 10250 г/л
Как видно из представленных данных, штамм-нефтедеструктор Иа1о/егах а1ехапФтш можно отнести к галотолерантным. Данный штамм можно использовать в очистке от нефти водных объектов широкого диапазона солености. Наиболее целесообразно и эффективно использовать данный изолят в интервале засоленности воды от 100 до 250 г/л содержания N00.
Также, по литературным данным известно, что на рост культуры влияют такие ионы, как Си2+, Хп+, М2+ и их концентрация в воде оз. Масазыр составляет 1,72 мг/л, 35,06 мг/л, 6,07 мг/л соответственно [3]. Для того, чтобы оценить, как влияет присутствие ионов Си2+, Хп+, №2+ в воде на деструктивную способность микроорганизма, был проведен ряд опытов. В искусственно созданных условиях путем варьирования концентрациями соответствующих ионов было установлено, что высокое содержание ионов Хп+ и присутствие нитрата калия в среде отрицательно воздействует на степень поглощения нефти изолятом. Параллельно проведен анализ влияния присутствия в среде нитрата калия, как основного источника азота. Выявлено положительное воздействие на рост культуры и на их степень поглощения нефти.
Универсальность биопрепарата на основе микроорганизма-нефтедеструктора Иа1о/егах
аЫхапёппш очевидна. Для понимания устойчивости биопрепарата к водам с различным химическим составом, был проведен ряд экспериментов. Сравнительный анализ деструкции нефти проводился на водопроводной, артезианской и дистиллированной воде. Результаты исследования
г, 2+
показали, что высокое содержание Са в артезианской воде отрицательно сказывается на способности изолята потреблять нефть.
Таким образом, биопрепарат, созданный на основе штамма Haloferax alexandrinus, выделенного из озера Масазыр, продемонстрировал высокие показатели очистки от нефтепродуктов в жидкости. Отличительной особенностью биопрепарата является его эффективность поглощения нефти в гиперсоленых водах (250 г/л NaCl). Также достоинством является высокая степень потребления нефти изолятом: эффективность очистки 93% достигается за 7-10 суток при загрязнении воды 6 г/л нефтью. Главной особенностью использования микроорганизмов в биоремедиации экосистем является то, что после очистки нет необходимости удаления их из среды, поскольку они не патогенные. С другой стороны, можно выделить микроорганизмы и использовать вторично, за счет возобновления и подвода необходимых микроэлементов для их размножения.
Список литературы
1. А.А. Марченко. Ресурсосберегающие технологии безопасной утилизации загрязнителей из нефтесодержащих сточных вод [Текст] /А.А.Марченко// Сборник трудов Международной конференции с элементами научной школы для молодежи «производство. Технология. Экология». 2011г., с.224-228.
2. Aparna Singh.,Anil Kumar Singh. Isolation, characterization and exploring biotechnological potential of halophilic archaea from salterns of western India//3 Biotech. - 2017.-17 p.
3. Мамедов В.А. Пути трансформации соледобычи из самосадочных озер Апшеронского полуострова / В.А.Мамедов, Х.Х.Халилова // Записки Горного института. 2016. Т. 222. С. 809815. DOI 10.18454/PMI.2016.6.809.
