CC BY
130
УДК 662.882.502.65+540.4:552.578.2 (571.56)
СПОСОБНОСТЬ КУЛЬТУРЫ CANDIDA SP. К БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЕПРОДУКТОВ
© Н. Д. Рябцева*, В. С. Никитина, А. А. Кадиров, М. И. Абдуллин
Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 228 62 55.
*Email: [email protected] Применение технологий, основанных на деструкции органических соединений биопрепаратами на основе активных штаммов микроорганизмов-нефтедеструкторов, является перспективным способом ликвидации техногенных загрязнений. Поиск новых углеводород - окисляющих штаммов микроорганизмов является актуальным, позволяя решать конкретные задачи по восстановлению природных нефтезагрязненных объектов. Из образцов нефтезагрязненных почв выделена дрожжеподобная культура - нефтедеструктор Candida sp. Исследован процесс накопления биомассы выделенной культурой Candida sp. в ходе биодеградации нефтяных фракции при различных условиях культивирования. Серией полевых испытаний выделенной культуры в условиях, приближенных к природным, в целях ремедиации нефтезагрязненных почв показана ее эффективность. Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать данную культуру для включения в состав микробного биопрепарата для решения проблемы по очистке почв от нефтепродуктов.
Ключевые слова: биоремедиация, микроорганизмы-нефтедеструкторы, биопрепараты, нефтепродукты.
Введение
Применение технологий, основанных на деструкции органических соединений биопрепаратами на основе активных штаммов микроорганизмов-нефтеде-структоров, является перспективным способом ликвидации техногенных загрязнений.
Для ремедиации нефтезагрязненных почв и воды используются как биопрепараты, включающие сообщества микроорганизмов, так и биопрепараты на основе монокультур. Активность микроорганизмов является одним из главных факторов, способствующих естественной очистке почв и водоемов. Способность микроорганизмов к деградации различных загрязнителей, в том числе и углеводородов - основных компонентов нефти, известна давно и интенсивно изучается. Процессам биологической ремедиации природных экосистем уделяется большое внимание. Биоремедиация обеспечивает экономически выгодную, высокоспецифичную и экологически безопасную очистку, приводящую к уменьшению концентрации поллютантов. Однако, как правило, не существует какого-либо одного микроорганизма, способного разложить все компоненты нефти. Ведется постоянное изучение свойств микроорганиз-мов-нефтедеструкторов с целью повышения эффективности очистки нефтезагрязненных территорий [1-5].
Методы
Из образцов нефтезагрязненных почв г. Ишимбай на селективных агаризованных средах с добавлением в качестве единственного источника углерода дизельного топлива, был выделен активный штамм дрожжеподоб-ных микроорганизмов. На агаризованных средах трехсуточная культура в жидкой и на агаризованной питательной среде при увеличении 600 раз представлена овальными, удлиненно-овальными и округлыми клетками. Часть крупных клеток имеет неправильную форму. Штрих на агаризованной среде (возраст 7 суток) сплошной, плоский, кремового цвета, гладкий, пастообразный, края ровные. Колонии на сусло-агаре округлые, диаметр большинства колоний 5 мм, встречаются мелкие колонии диаметром 3 мм. Колонии беловато-кремового цвета, пастообразные, края ровные, центр колоний
приподнят. У большинства колоний поверхность гладкая. Культура аэробная, ассимилирует подсолнечное масло, глюкозу при оптимальном рН для роста 4.0-6.0 и температуре 25-30 °C. Максимальная температура роста культуры 35 °C. При повышении температуры до 37 °С резко замедляются темпы роста. Культура разжижает желатин. Световую микроскопию осуществляли с помощью микроскопа МБС-10. На основе морфологических признаков, данных световой микрожопии, куль-туральных признаков и субстратной специфичности данный штамм был отнесен к роду Candida sp. [6].
Для оценки способности Candida sp. к окислению нефтепродуктов, чистую культуру вносили на аэрируемые жидкие питательные среды с добавлением минеральных солей и нефтепродуктов в количестве 10%, масс. и 20%, масс. В состав питательной среды входили минеральные соли: KH2PO4, MgCl, NH4NO3 (по 0.1% масс). Скорость аэрации составляла 1 л/час. Инкубировали при 25 °С Через равные промежутки времени фиксировали прирост микробной массы с помощью денситометра Den-1, количество жизнеспособных клеток в культуре определяли методом прямого подсчета при росте на агаризованных средах.
Для изучения способности выделенного штамма снижать содержание углеводородов нефти, использовали образцы почв, отобранные в г. Тобольск с территории завода ООО «Тобольск-Нефтехим» и за территорией завода; в г. Салават с завода ООО «Газпром Нефте-химСалават»; на западной окраине г. Ишимбай; в г. Янаул, вблизи розлива качалки «Башнефть»; лесная почва, отобранная в Алексеевском районе г. Уфы Республики Башкортостан и нефтешлам из разливов вблизи г. Ишимбай.
Результаты и их обсуждение
Поиск новых углеводород - окисляющих штаммов микроорганизмов является актуальным, позволяя решать конкретные задачи по восстановлению природных нефтезагрязненных объектов. Поэтому, представлялось интересным исследовать возможность применения полученного штамма в качестве активного компонента в составе комплексного перспективного биопрепарата
для очистки нефтезагрязненных почв. Вначале выявляли способность выделенной дрожжеподобной культуры к биодеградации углеводородов нефти. Для оценки способности Candida sp. к окислению нефтепродуктов чистую культуру вносили на аэрируемые жидкие питательные среды с добавлением минеральных солей и нефтепродуктов (табл. 1, рис.).
Таблица 1
Динамика роста дрожжей Candida sp. на аэрируемых жидких питательных средах с добавлением нефтепро-_дуктов (10%, масс.)_
Время инкубации, сут. Концентрация клеток, кл- 106/мл
Бензин керосин нефтешлам
0 21 25 22
1 30 40 16
6 50 14 15
8 36 10 15
12 14 9 10
14 11 8 7
16 5 4 7
Согласно полученным данным, чистая культура
показала способность метаболизировать нефтепродукты на аэрируемых жидких питательных средах, образуя жизнеспособные колонии при концентрации загрязнителя как 10%, так и 20% масс. содержания нефтепродуктов.
Штамм Candida sp. проявил способность роста на аэрируемых жидких питательных средах, используя в качестве единственного источника питания разные нефтяные фракции, образуя жизнеспособные колонии при периодическом культивировании. При этом, наибольший прирост микробной биомассы выявлен на 42-е сутки для бензиновой фракции (3 109 кл /мл), в то время как на средах с 20% содержанием нефтешлама, максимальное количество клеток наблюдали на 56 день культивирования. Согласно полученным данным, менее благоприятной для роста культуры является аэрируемая жидкая питательная среда с добавлением нефтешлама.
Определяли содержание нефтепродуктов в нефте-загрязненных почвах после внесения в почву суспензии
дрожжей Candida sp. Суспензию получали путем культивирования на жидких питательных средах с дополнительной аэрацией. В качестве источника углерода использовалась смесь растительное масло - дизельное топливо (1:1). Содержание нефтепродуктов в образцах почв после обработки различными объемами микробной суспензии дрожжей (1%, 5%, 10%) определяли гравиметрическим способом. Длительность эксперимента - 21 день. Концентрация клеток в 1 мл вносимой суспензии составила 1106 кл/мл.
Время инкубации, сут.
Рис. Динамика роста колоний микроорганизмов Candida sp.rn аэрируемой жидкой питательной среде с добавлением нефтепродуктов (20%, масс.).
Для испытания были взяты несколько образцов техногенно-загрязненных почв, отобранных на разных территориях. Навески почв (масса 400 г), увлажняли суспензией дрожжей Candida sp. в концентрации 1%, 5%, 10%, масс соответственно. Длительность эксперимента составила 21 день при температуре 25°С. Эксперименты с каждым образцом почвы проводились в пятикратной повторности. Данные приведены в табл. 2.
Согласно полученным данным, на 21 -е сутки во всех образцах исследуемых почв наблюдалось существенное снижение содержания нефтепродуктов по
Таблица 2
Содержание нефтепродуктов в техногенно - загрязненных образцах почв после обработки культурой дрожжей _Candida sp. (1%, 5%, 10%), мг/кг почвы_
Содержание суммарных нефтепродуктов в исходных образцах Концентрация культуры дрожжей Candida lipolytica
Номер об- Место отбора 1% 5% 10%
разца почвы 7 дней 14 дней 7 дней 14 дней 7 дней 14 дней
1 г. Янаул (с. Иткинеево) 5750 1.869 0.005 2.987 0.002 5.566 0.000
2 г. Ишимбай 450 0.236 0.001 0.178 0.000 0.056 0.000
3 г. Салават г. Тобольск 400 0.272 0.001 0.188 0.000 0.060 0.000
4 (за территорией завода) г. Тобольск 75 0.017 0.000 0.008 0.000 0.000 0.000
5 (территория завода) лесная почва 20 0.008 0.000 0.003 0.000 0.000 0.000
6 (контрольный 2 0.004 0.000 0.000 0.000
образец)
сравнению с их исходным количеством. Исследовалось влияние количества вводимой дрожжевой суспензии на эффективность снижения содержания нефтепродуктов в почвах. Оптимальная концентрация вводимых дрожжей составила 10% масс.
Таким образом, из образцов нефтезагрязненных почв была выделена дрожжеподобная культура. На основе морфологических признаков, данных световой микроскопии, культуральных признаков и субстратной специфичности культура отнесена к роду Candida sp. Исследован процесс накопления биомассы выделенной культурой Candida sp. в ходе биодеградации нефтяных фракции при различных условиях культивирования. Серией полевых испытаний выделенной культуры в условиях, приближенных к природным, в целях ремедиации нефтезагрязненных почв показана ее эффективность. Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать данную культуру для включения в состав
микробного биопрепарата для решения проблемы по
очистке почв от нефтепродуктов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Коронелли Т. В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. №>6. C. 579-585.
2. Гольдберг В. М., Зверев В. П., Арбузов А. И. Техногенное загрязнение природных вод углеводородами и его экологические последствия. Москва, Наука, 2001. 125 с.
3. Колесниченко А. В. Марченко А. И., Побежимова Т. П., Зыкова В. В. Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах. Москва, Промэкобезопасность, 2004. 194 с.
4. Вельков В. В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. 1995. №3. C. 20-27.
5. Новоселова Е. И., Киреева Н. А., Гарипова М. И. Роль ферментативной активности почв в осуществлении ею трофической функции в условиях нефтяного загрязнения // Вестник Башкирского университета. 2014. Т.10. №2. С. 474-478.
6. Бабьева И. П., Голубев В. И. Методы выделения и идентификации дрожжей. Москва: Пищевая промышленность, 1979. 340 с.
Поступила в редакцию 03.12.2015 г.
THE ABILITY OF CULTURE CANDIDA SP. TO DECOMPOSE OIL © N. D. Ryabtseva*, V. S. Nikitina, A. A. Kadirov, M. I. Abdullin
Bashkir State University 32 Z. Validi St., 450076 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: +7 (347) 228 62 55.
*Email: [email protected]
The use of technologies based on biological products of degradation of organic compounds on the basis of active strains of microorganisms-oil destructors, is a perspective way to eliminate technogenic pollution. The search for new hydrocarbon-oxidizing microorganisms strains is still of current interest, allowing to solve specific problems of reduction of natural oil-contaminated objects. For the remediation of contaminated soils and water, microbial communities and monocultures of microorganisms are used. The activity of microorganisms is one of the main factors that contribute to the natural purification of soil and water. The ability of microorganisms to decompose various pollutants including hydrocarbons, the main components of oil, has been extensively studied for a long time. Much attention is paid to the process of biological remediation of natural ecosystems. Bioremediation provides a cost-effective highly specific and environmentally safe cleaning leading to a decrease in the concentration of pollutants. However, as a rule, there is no one of a microorganism capable to destruct all of oil components. The properties of oil-destructing microorganisms are constantly studied in order to increase the efficiency of purification of oil-contaminated areas. Yeast-culture of Candida sp. was separated from samples of contaminated soils. Accumulation of biomass by Candida sp. was studied in the process of the biodegradation of petroleum fractions under various culture conditions. Experiments of the remediation of oil-contaminated soil show its effectiveness. On the basis of the experimental data, this culture can be recommended as a microbial part for solving the problem of cleaning soil from oil products.
Keywords: bioremediation, oil destruction, oil destructors, biological products, petroleum products.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at [email protected] if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Koronelli T. V. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 1996. Vol. 32. No. 6. Pp. 579-585.
2. Gol'dberg V. M., Zverev V. P., Arbuzov A. I. Tekhnogennoe zagryaznenie prirodnykh vod uglevodorodami i ego ekologicheskie posledstviya [Technogenic pollution of natural waters by hydrocarbons and its environmental impacts]. Moscow: Nauka, 2001.
3. Kolesnichenko A. V. Marchenko A. I., Pobezhimova T. P., Zykova V. V. Protsessy biodegradatsii v neftezagryaznennykh pochvakh [Biodegradation processes in oil-contaminated soils]. Moscow: Promekobezopasnost', 2004.
4. Vel'kov V. V. Biotekhnologiya. 1995. No. 3. Pp. 20-27.
5. Novoselova E. I., Kireeva N. A., Garipova M. I. Vestnik Bashkirskogo universiteta. 2014. Vol. 10. No. 2. Pp. 474-478.
6. Bab'eva I. P., Golubev V. I. Metody vydeleniya i identifikatsii drozhzhei [Methods of isolation and identification of yeast]. Moscow: Pishchevaya promyshlennost', 1979.
Received 03.12.2015.
