Научная статья на тему 'Исследование морфологии и распределения α - нафтилбутиратэстеразы и нафтол-as-d-хлор ацетат-эстеразы в нормальных предшественниках лейкоцитов миелоидного ростка с помощью клеточного биочипа'

Исследование морфологии и распределения α - нафтилбутиратэстеразы и нафтол-as-d-хлор ацетат-эстеразы в нормальных предшественниках лейкоцитов миелоидного ростка с помощью клеточного биочипа Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
202
33
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Онкогематология
Scopus
ВАК
Ключевые слова
КЛЕТОЧНЫЙ БИОЧИП / НОРМАЛЬНЫЙ КОСТНЫЙ МОЗГ / МИЕЛОИДНЫЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ / α-НАФТИЛБУТИРАТЭСТЕРАЗА / НАФТОЛ-AS-D-ХЛОРАЦЕТАТЭСТЕРАЗА / CELL MICROARRAY / NORMAL BONE MARROW / MYELOID LINEAGES / α-NAPHTHYL BUTYRATE ESTERASE / NAPHTHOL AS-D CHLOROACETATE ESTERASE

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Федянина О. С., Закирова А. О., Задорожная А. Е., Капранов Н. М., Хвастунова А. Н.

В данной работе описано и количественно охарактеризовано распределение мононуклеаров, выделенных из аспирата костного мозга здоровых доноров и рассортированных по их поверхностным CD-антигенам на клеточном биочипе, по морфологии (для 11 доноров), а также по наличию или отсутствию в клетках активности α-нафтилбутиратэстеразы и нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразы (для 9 доноров). Эти данные могут быть использованы в качестве референсных значений при диагностике острых миелобластных лейкозов с помощью клеточного биочипа.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Федянина О. С., Закирова А. О., Задорожная А. Е., Капранов Н. М., Хвастунова А. Н.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

MORPHOLOGY AND DISTRIBUTION OF Α-NAPHTHYL BUTIRATE ESTERASE AND NAPHTHOL AS-D CHLOROACETATE ESTERASE IN NORMAL MYELOMONOCYTIC PRECURSORS STUDIED BY THE CELL MICROARRAY

Here we describe and qualitatively characterize the distribution of mononuclear cells isolated from bone marrow aspirate of healthy donors and sorted by their surface CD antigens on a cell microarray by morphology (for 11 donors) and by absence or presence of α-naphthyl butyrate esterase and naphthol AS-D chloroacetate esterase (for 9 donors). These data can be used as a reference for the diagnosis of acute myeloid leukemia using the cell microarray.

Текст научной работы на тему «Исследование морфологии и распределения α - нафтилбутиратэстеразы и нафтол-as-d-хлор ацетат-эстеразы в нормальных предшественниках лейкоцитов миелоидного ростка с помощью клеточного биочипа»

: Исследование морфологии и распределения

: а-нафтилбутиратэстеразы и нафтол-ДЭ-й-хлорацетат-р эстеразы в нормальных предшественниках лейкоцитов миелоидного ростка с помощью клеточного биочипа

ев

cv

О.С. Федянина1, 2, А.О. Закирова1, 2, A.Е. Задорожная3, Н.М. Капранов2, 4, А.Н. Хвастунова1, 2, П. А. Ядгарова3, А. В. Филатов5, О. С. Бурова6, Ф.И. Атауллаханов1-3, С. А. Кузнецова1, 2

ФГБУ«Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Саморы Машела, 1; 2ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук»; Россия, 119991 Москва, Ленинский проспект, 38А, корп. 1; 3ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; Россия, 119991 Москва, Ленинские горы, 1;

ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; Россия, 125167Москва, Новый Зыковский проезд, 4а; ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России»; Россия, 115478Москва, Каширское шоссе, 24; ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва,

Каширское шоссе, 23

Контакты: Софья Алексеевна Кузнецова [email protected]

В данной работе описано и количественно охарактеризовано распределение мононуклеаров, выделенных из аспирата костного мозга здоровых доноров и рассортированных по их поверхностным CD-антигенам на клеточном биочипе, по морфологии (для 11 доноров), а также по наличию или отсутствию в клетках активности а-нафтилбутиратэстеразы и нафтол-AS-D-хлорацетат-эстеразы (для 9 доноров). Эти данные могут быть использованы в качествереференсных значений при диагностике острых мие-лобластных лейкозов с помощью клеточного биочипа.

Ключевые слова: клеточный биочип, нормальный костный мозг, миелоидные предшественники, а-нафтилбутиратэстераза, нафтол -AS-D-хлорацетатэстераза

DOI: 10.17650/1818-8346-2016-11-4-74-79

Morphology and distribution of a-naphthyl butirate esterase and naphthol AS-D chloroacetate esterase in normal

myelomonocytic precursors studied by the cell microarray

O.S. Fedyanina1,2, A.O. Zakirova1,2, A.E. Zadorozhnaya3, N.M. Kapranov2,4, A.N. Khvastunova1,2, P.A. Yadgarova3, A. V. Filatov5, O.S. Burova6, F.I. Ataullakhanov1-3, S.A. Kuznetsova1,2

Federal Research Centre of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology named after Dmitriy Rogachev;

1 Samory Mashela St., Moscow 117997, Russia;

2Center of Theoretical Problems of Physical and Chemical Pharmacology of the Russian Academy of Sciences; Build. 1, 38A Leninskiy Prospekt, Moscow 119991, Russia;

3M.V. Lomonosov Moscow State University; 1 Leninskie Gory, Moscow 119991, Russia;

4Hematological Research Center, Ministry of Health of Russia; 4a Novyy Zykovskiy Proezd, Moscow 125167, Russia;

5National Research Center "Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency of Russia"; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia;

6N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 23 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia

Here we describe and qualitatively characterize the distribution of mononuclear cells isolated from bone marrow aspirate of healthy donors and sorted by their surface CD antigens on a cell microarray by morphology (for 11 donors) and by absence or presence of a-naphthyl butyr-ate esterase and naphthol AS-D chloroacetate esterase (for 9 donors). These data can be used as a reference for the diagnosis of acute myeloid leukemia using the cell microarray.

Key words: cell microarray, normal bone marrow, myeloid lineages, a-naphthyl butyrate esterase, naphthol AS-D chloroacetate esterase

Введение

Диагностика острых лейкозов основывается на обнаружении в костном мозге (КМ) патологических незрелых (бластных) клеток и определении их линей-

ной принадлежности. Анализ бластной популяции в пунктате КМ проводится параллельно с помощью оценки морфологии в мазках и иммунофенотипиро-вания, т. е. определения на поверхности бластных

клеток маркеров дифференцировки (СБ-антигенов) методом проточной цитометрии. При диагностике острых миелобластных лейкозов (ОМЛ) проводится также исследование цитохимической активности в лейкоцитах КМ в мазке, причем для уточнения варианта ОМЛ используются данные о цитохимической активности как опухолевых клеток, так и нормальных лейкоцитов гранулоцитарного и моноцитарного ростков КМ. Одним из перспективных цитохимических методов, применяемых при дифференциальной диагностике ОМЛ, является исследование активности лейкоцитарных эстераз. С.У. Ы и соавт. [1] при разделении экстрактов нормальных и патологических лейкоцитов человека в полиакриламидном геле идентифицировали 9 изотипов эстераз, которые делятся на 2 основные группы: полосы 1, 2, 7, 8 и 9 соответствуют нафтол-ЛБ-Б-хлорацетатэстеразе (так называемой специфической эстеразе), а полосы 3, 4, 5 и 6 — неспецифической, способной расщеплять как а-нафтилбути-рат, так и а-нафтилацетат. При этом а-нафтилбути-рат лучше выявляет активность эстераз полосы 4, а а-нафтилацетат — полосы 5 [1]. В той же работе было показано, что в зрелых и созревающих гранулоцитах наиболее активны эстеразы полос 7 и 9, а в зрелых моноцитах — полос 4 и 5, что позволяет использовать анализ на специфическую и неспецифическую эсте-разы для разделения гранулоцитарного и моноцитар-ного ростка при диагностике ОМЛ [1]. Были также предложены протоколы одновременного (параллельного [2, 3] и последовательного [4]) окрашивания на специфическую и неспецифическую эстеразы. Основным достоинством такого окрашивания по сравнению с традиционно используемыми реакциями на мие-лопероксидазу для определения миелоидных клеток и неспецифическую эстеразу для выявления клеток моноцитарной природы является возможность визуализировать отдельно гранулоцитарный и отдельно мо-ноцитарный компонент одновременно на одном и том же образце.

До недавнего времени не существовало метода, позволяющего совместить определение поверхностных СБ-антигенов лейкоцитов с полноценным исследованием морфологии или активности линиеспецифич-ных ферментов. Нашей группой разработан клеточный биочип, позволяющий рассортировать лейкоциты по их поверхностным СБ-антигенам и затем провести на рассортированных клетках морфологическое или цитохимическое исследование [5, 6]. Клеточный биочип представляет собой прозрачную подложку с областями иммобилизованных моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным СБ-антигенам лейкоцитов [5]. При инкубации биочипа с суспензией лейкоцитов человека клетки, несущие определенный поверхностный антиген, связываются только с соответствующими антителами. После отмывки несвязав-шихся клеток на подложке остаются области, заполненные лейкоцитами, несущими разные поверхностные

антигены. Связавшиеся с антителами клетки затем фиксируют и окрашивают для дальнейшего морфологического или цитохимического исследования. Та -ким образом, клетки оказываются рассортированы в зависимости от присутствующих на их поверхности CD-антигенов, что позволяет определить степень их зрелости и принадлежность к той или иной линии не только по морфологии, но и по иммунофенотипу [5].

В ряде работ качественно описаны результаты окрашивания на двойную эстеразу мазков КМ пациентов с различными вариантами ОМЛ [2—4, 7]. Показано, что в норме специфическая эстераза активна в части миелобластов, присутствует во всех созревающих нейтрофилах начиная со стадии промиелоцита и практически отсутствует в других лейкоцитах КМ [4]. Неспецифическая эстераза, напротив, активна в мегакариоцитах и моноцитах, но зависимость активности ферментов данного типа от зрелости клеток не исследовалась [4]. Однако количественного анализа распределения активности специфической и неспецифической эстераз среди лейкоцитов нормального КМ не проводилось.

Целью данной работы было исследование морфологических особенностей и цитохимической активности специфической и неспецифической эстераз для нормальных лейкоцитов КМ, несущих тот или иной CD-антиген, с помощью клеточного биочипа.

Материалы и методы

Изготовление биочипов

Биочипы изготавливали в соответствии с ранее опубликованным протоколом [5, 6]. В панель биочипа входили антитела к CD2, СD3, CD5, СD7, CD8, CD10, CD16, CD19, CD38, CD45, HLA-DR (ООО «Сорбент», Россия) и СD4, СD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD33, CD41a, CD61, CD45RA, CD45RO, CD64, CD117, CD123 (eBioscience, США).

Выделение лейкоцитов и их анализ

Выделение лейкоцитов из пунктата КМ и их последующий анализ c помощью клеточного биочипа были выполнены, как описано в [5], с использованием окраски по Паппенгейму.

Цитохимическое окрашивание лейкоцитов

на биочипе

В работе использовали протокол последовательного окрашивания на а-нафтилбутиратэстеразу и нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразу [8] с небольшими модификациями. Чип фиксировали 30 с в охлажденном до 4 °С формол-ацетоновом фиксаторе (20 мг Na2HPO4 (Sigma), 100 мг KH2PO4 (Serva), 45 мл ацетона, 25 мл 40 % формалина, 30 мл воды), отмывали в проточной воде и высушивали. В 20 мл фосфатного буфера (100 мМ, pH 8,0) растворяли 18 мг соли прочного синего BB (Sigma). Далее добавляли 0,4 мл а-нафтилбутирата (4 мг/мл) в ацетоне. Чип инкубировали в полученном растворе

CV 4

ев

cv

4

сч

4

ев

сч

4

в течение 45 мин в темноте при комнатной температуре, отмывали в проточной воде и высушивали на воздухе. Для определения активности нафтол-АБ^-хлораце-татэстеразы 10 мг соли прочного синего BB растворяли в 19 мл фосфатного буфера (66 мМ, pH 7,4), добавляли 1 мл раствора нафтол-АБ^-хлорацетата (Sigma) в N-диметилформамиде (2,5 мг/мл). Этим раствором заливали тот же чип и инкубировали 30 мин в темноте, отмывали в проточной воде, высушивали на воздухе и анализировали.

При использовании прочного синего BB в качестве визуализирующего агента продукт реакции неспецифических эстераз с а-нафтилбутиратом выпадает в виде бурого осадка, продукт реакции специфических

Рис. 1. Мононуклеары нормального костного мозга, связавшиеся с иммобилизованным антителом к CD11b, окрашенные по последовательному протоколу на а-нафтилбутиратэстеразу и нафтол-AS-D-хлораце-татэстеразу. Клетка с бурой окраской, несущая а-нафтилбутират-эстеразу, указана коричневой стрелкой; неокрашенная клетка — зеленой стрелкой; клетки с двойной окраской, содержащие обе эстеразы, — фиолетовыми стрелками; клетки с синей или фиолетовой окраской, несущие нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразу, не отмечены. х 1000

эстераз с нафтол-ЛБ-Б-хлорацетатом — в виде синего или фиолетового осадка [8] (рис. 1).

Анализ данных

Морфологию и цитохимическую активность лейкоцитов на биочипе анализировали с помощью светового микроскопа Nikon Eclipse Ni в светлом поле и камеры Nikon DS-Ril. Для каждого пятна анти-CD было выполнено не менее 3 фотографий при увеличении х 400 или 1 фотография при увеличении х 200. Для анализа морфологии рассчитывали относительную плотность связывания лейкоцитов с пятнами антител, при этом за 100 % принимали количество клеток, связавшихся с пятном анти-CD45RA. Затем в пятнах антител к миеломоноцитарным маркерам CDllb, CD13, CD15, CD33, CD64, а также к HLA-DR, CD45, CD45RA при увеличении х 1000 было проанализировано 100 клеток, среди которых морфологически определялось количество миело-/монобластов, промиело-цитов и промоноцитов. Для анализа цитохимической активности в данном исследовании определяли

относительные плотности связывания клеток, положительных только по специфической или только по неспецифической эстеразе, положительных или отрицательных по обеим эстеразам, принимая за 100 % плотность заполнения пятна с анти-СБ45КЛ.

Пациенты

Для исследования морфологии были использованы пунктаты КМ 11 добровольных здоровых доноров (7 — мужского пола, 4 — женского) в возрасте от 4 до 16 лет (медиана 8 лет), а для исследования распределения цитохимической активности 2 эстераз — пунк-таты КМ 9 добровольных здоровых доноров (4 — мужского пола, 5 — женского) в возрасте от 5 до 46 лет (медиана 25,5 года), взятые в процессе подготовки к трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Согласие на забор КМ и будущие биомедицинские исследования было получено.

Результаты и обсуждение

Морфологическая оценка клеточного состава

лейкоцитов костного мозга, связавшихся

с антителами на клеточном биочипе

В работе исследовано относительное содержание миеломоноцитарных предшественников (миело-/мо-нобластов, промиелоцитов и промоноцитов) среди клеток, связавшихся на биочипе с антителами к СБ11Ъ, СБ13, СБ15, СБ33, СБ64, ЫЬЛ-БЯ и СБ45, СБ45ИЛ. Миело-/монобласты (рис. 2а) отличались крупным размером (до 18 мкм), большим ядром, занимающим практически все пространство клетки, узкой полоской цитоплазмы голубого цвета, нежным тонким хроматином, четко различимыми одной или несколькими нуклеолами. Промоноциты (рис. 2б) имели более грубый рисунок хроматина, чем миело-/монобласты, менее различимые 1—2 нуклеолы, цитоплазму серо-голубого цвета. В некоторых клетках выявлялась пылевидная азурофильная зернистость. Промиелоциты (рис. 2в) представляли собой крупные (до 20 мкм) клетки с большим, чем у миелобластов, количеством базофильной цитоплазмы, содержащей крупные хорошо различимые азурофильные гранулы. Ядро про-миелоцита чаще располагалось эксцентрично, хроматин был чуть более конденсирован, чем у миелобласта, но все еще разреженный, ядрышко — менее различимо или отсутствовало.

На диаграмме (рис. 2г) представлена плотность связывания этих морфологических типов клеток с антителами на биочипе, нормированная на плотность связывания клеток с анти-СБ45ИЛ.

Поскольку маркер СБ11Ъ начинает экспрессиро-ваться на поверхности созревающих гранулоцитов лишь на стадии миелоцитов, а его экспрессия на про-моноцитах невысока [9, 10], на биочипе предшественники миелоидного ряда не связывались с антителами к СБ11Ъ. Поэтому наличие на биочипе миеломоноци-тарных предшественников, положительных по СБ11Ъ,

10

<

сс

ип ^

О

и

О с с

Промоноциты Промиелоциты

■ Миело-/монобласты

СР11Ь СР13 СР15 СРЗЗ Сйб4 СР45 045ВД Н1_А-ОВ

Рис. 2. Морфология нормальных миеломоноцитарных предшественников на клеточном биочипе: а — миело-/монобласт; б — промоноцит; в — промиелоцит; г — диаграмма плотностей связывания миеломоноцитарных предшественников с различными антителами на биочипе, нормированная на плотность связывания лейкоцитов с анти-СВ45ЯЛ

может служить указанием на нарушение гемопоэза. Наибольшее количество промиелоцитов связывается с анти-СБ15 (9 % промиелоцитов от СБ45ЯЛ), поскольку из всех исследованных миелоидных маркеров плотность экспрессии именно СБ15 на них максимальна [9]. Также в небольшом количестве промиело-циты были найдены на пятнах анти-СБ33 и анти-НЬЛ-БЯ (0,5 и 1,0 % соответственно). Промоноциты связывались с антителами к СБ64, СБ45, СБ45ЯЛ, НЬЛ-БЯ с плотностью до 2 % от максимального заполнения, что соответствует данным о наличии этих маркеров на поверхности клеток моноцитарного ряда [8]. В группу миело-/монобластов были включены морфологически неразличимые ранние предшественники обоих ростков лейкоцитарного гемопоэза. Хотя опухолевые миело-/монобласты активно экспресси-руют СБ13 и СБ33 на своей поверхности, в КМ здоровых доноров на биочипе эти клетки были найдены только на пятне анти-НЬЛ-БЯ в количестве 0,7 %. Отсутствие связывания нормальных миело-/монобла-стов с анти-СБ13 и анти-СБ33 на биочипе может быть объяснено низкой экспрессией данных маркеров на их поверхности (менее 100 на 1 клетку) [9—11].

Полученные данные о морфологическом составе миелоидных предшественников, несущих определенный антиген, могут быть использованы при постанов-

ке диагноза ОМЛ по БЛВ-классификации с помощью биочипа.

Распределение предшественников лейкоцитов

на биочипе по содержанию а-нафтилбутират-

эстеразы и/или нафтол-Л8-Б-хлорацетатэстеразы

в нормальном костном мозге

На рис. 1 представлены характерные результаты последовательной окраски на а-нафтилбутиратэстеразу и нафтол-ЛБ-Б-хлорацетатэстеразу нормальных мо-нонуклеаров КМ, связавшихся на биочипе с антителами к СБ11Ь. Диаграмма распределения лейкоцитов в пятнах биочипа по наличию в них а-нафтилбути-ратэстеразы и нафтол-ЛБ-Б-хлорацетатэстеразы показана на рис. 3. Мононуклеары нормального КМ, положительные по СБ3, СБ5, СБ7 и СБ19, отрицательны по обеим эстеразам; среди клеток, положительных по СБ2 и СБ4, 7 ± 5 и 27 ± 11 % соответственно положительны по а-нафтилбутиратэстеразе, что соответствует субпопуляции зрелых моноцитов, экспрессирующих данные маркеры [12]. Небольшое вариабельное количество (7 ± 6 % от плотности заполнения анти-СБ45ЯЛ) СБ10+ клеток, положительных по нафтол-ЛБ-Б-хлорацетатэстеразе, соответствует сегментоядерным нейтрофилам, оставшимся после их удаления из суспензии центрифугированием в градиенте плотности [12]. Среди всех СБ38+ нормальных мононуклеаров КМ 12 ± 8 % положительны по а-нафтилбутиратэстеразе и 12 ± 11 % — по нафтол-ЛБ-Б-хло-рацетатэстеразе, что согласуется с данными литературы по экспрессии данного маркера на подгруппе моноцитов и части зрелых и незрелых миелоидных клеток [12]. Клетки, положительные по СБ123, отрицательны по обеим эстеразам в соответствии с данными литературы [11], и небольшое количество СБ123+ клеток, положительных по неспецифической эстеразе (до 2 % от максимального заполнения), отражает неспецифическое связывание моноцитов с анти-СБ123 на биочипе. Поскольку в 79 % случаев бластные клетки при ОМЛ экспрессируют СБ123 с уровнем экспрессии, в десятки раз превышающим экспрессию данного маркера на нормальных миелоидных предшественниках [11], появление значительного количества СБ123+ клеток, положительных по специфической или неспецифической эстеразе, является указанием на нарушения гемопоэза. Среди НЬЛ-БЯ+ клеток встречается небольшая подгруппа а-нафтилбутиратсодержа-щих клеток (9 ± 6 % от плотности заполнения анти-СБ45ЯЛ), соответствующая моноцитам с высоким уровнем экспрессии НЬЛ-БЯ [12]. По данным литературы, СБ13 и СБ33 присутствуют с постоянной, но невысокой плотностью с самых ранних этапов дифференцировки как моноцитов, так и гранулоци-тов, но их экспрессия невысока [11]. Поэтому СБ13+ и СБ33+ клетки содержат как а-нафтилбутиратэсте-разу, так и нафтол-ЛБ-Б-хлорацетатэстеразу, но плотность их связывания с антителами к этим маркерам

сч

4

ев

сч

г

8

б

4

2

0

100

CV 4

CS

CV 4

о

и

80

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

70

# 60 о

ш 50

40

о с с

30

20

10

Бурая Синяя Двойная Нет

J

же

У

L

ki

IL

ш

OOOOOjr^^

и и

m ^ LT Ю № m 00<— Ln< О ^i^rocr

t— t— t— t— t— гм Q

00000000001лЙ0;г;:г;£

О О U U =f!

Рис. 3. Диаграмма распределения предшественников лейкоцитов в пятнах биочипа по наличию в них а-нафтилбутиратэстеразы и нафтол-ЛЯ-В-хлорацетатэстеразы. Представлены усредненные значения по 9 донорам, в качестве ошибки взято стандартное отклонение. Подсчет и окрашивание выполнены как описано в разделе «Материалы и методы»

на биочипе невелика. Поверхностный СБ11с характерен для клеток моноцитарной природы. Пренебрежимо малое количество СБ11с-клеток, положительных по специфической эстеразе (4 ± 3 % от плотности заполнения положительного контроля), может отражать небольшое количество СБ11с+ созревающих грану-лоцитов, начиная со стадии миелоцита [12]. СБ11Ъ и СБ15 появляются на созревающих гранулоцитах на уровне миелоцитов с высокой плотностью, а СБ16 — при переходе от палочкоядерных к сегментоядерным нейтрофилам [9, 10]. Поэтому с антителами к данным маркерам связываются с высокой плотностью клетки, положительные по нафтол-ЛБ-Б-хлорацетатэстеразе. Небольшое количество СБ15+ клеток, положительных по а-нафтилбутиратэстеразе, объясняется промежуточной экспрессией СБ15 на промоноцитах до стадии, экспрессирующей СБ14, что хорошо согласуется с представленными выше морфологическими данными о связывании промоноцитов с анти-СБ15 на биочипе (см. рис. 2). Плотность клеток, содержащих неспецифическую эстеразу, примерно одинакова (6—12 % от максимальной плотности связывания) на антителах ко всем антигенам, характерным для моноцитов (СБ11Ъ, СБ11с, СБ13, СБ14, СБ33, СБ64), и положительном контроле анти-СБ45 и соответствует примерно 1—8 % нормы моноцитов в здоровом КМ [10].

Причина появления клеток, окрашивающихся в использованном нами протоколе как на нафтол-ЛБ-Б-хлорацетатэстеразу, так и на а-нафтилбутиратэсте-

разу (двойная окраска), до конца не известна. Часть этих клеток может представлять собой незрелые мо-ноцитарные предшественники (монобласты и про-моноциты), содержащие оба типа эстераз. Однако по представленным в работе морфологическим данным количество этих клеток недостаточно велико, чтобы полностью объяснить наличие клеток с двойной окраской. По данным C.Y. Li и соавт., эстеразы полосы 2, имеющие активность как в отношении а-нафтилбу-тирата, так и нафтол-ЛБ-Б-хлорацетата, присутствуют в части моноцитов и гранулоцитов, вызывая неспецифическую «перекрестную» окраску [1], что также может объяснять присутствие небольшого (до 10 % от максимальной плотности связывания) количества клеток с двойной окраской.

Заключение

В целом полученное в работе распределение на биочипе клеток, несущих одну или обе эстеразы, хорошо согласуется с данными проточной цитометрии об экспрессии различных CD-антигенов на разных стадиях созревания клеток миелоидного и моноцитарного ряда и может быть использовано в качестве референс-ных значений при диагностике ОМЛ с помощью клеточного биочипа.

Финансирование. Работа была поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 16-34-01030 и № 16-04-00282). А.Н. Хвасту-нова поддержана стипендией президента СП-1929. 2016.4.

0

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Li C.Y., Lam K.W., Yam L.T. Esterases

in human leukocytes. J Histochem Cytochem 1973;21(1):1 —12. PMID: 4694536.

2. Swirsky D.M. Single incubation double esterase cytochemical reaction using a single coupling reagent. J Clin Pathol 1984;37(10):1187—90. PMID: 6593326.

3. Ainoon O., Jabamoney A.J., Cheong S.K. Single incubation double esterase cytochemical reaction using a single coupling reagent. Malays J Pathol 1991;13(1):47-9. PMID: 1724544.

4. Yam L.T., Li C.Y.,

Crosby W.H. Cytochemical identification of monocytes and granulocytes. Am J Clin Pathol 1971;55(3):283-90. PMID: 5549896.

5. Khvastunova A.N., Kuznetsova S.A., Al-Radi L.S. et al. Anti-CD antibody microarray for human leukocyte morphology examination allows analyzing rare cell populations and suggesting preliminary

diagnosis in leukemia. Sci Rep 2015;5:12573. DOI: 10.1038/srep12573. PMID: 26212756.

6. Хвастунова А.Н., Аль-Ради Л.С., Капранов Н.М. и др. Использование клеточного биочипа в диагностике волосато-клеточного лейкоза. Онкогематология 2015;10(1):58—66. [Khvastunova A.N., Al'-Radi L.S., Kapranov N.M. Cell-binding microarray application in diagnosis of hairy cell leukemia. Onkogematologiya = Oncohematology 2015;10(1):58-66.

(In Russ.)].

DOI: 10.17650/1818-8346-2015-1-37-45.

7. Rozenszajn L., Leibovich M., Shoham D., Epstein J. The esterase activity

in megaloblasts, leukemic and normal hematopoietic cells. Br J Hematol 1968;14(6):605-10. PMID: 5241511.

8. Bain B.J., Bates I., Laffan M.A. Dacie and Lewis practical haematology. Elsevier Health Sciences, 2016.

9. Terstappen L.W., Gandour D., Huang S. et al. Assessment of hematopoietic cell differentiation by multidimensional flow cytometry. J Hematother 1993;2(3):431-47. DOI: 10.1089/scd.1.1993.2.431.

PMID: 7522894.

10. van Lochem E.G., van der Velden V.H., Wind H.K. et al. Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: reference patterns for age-related changes and disease-induced shifts. Cytometry

B Clin Cytom 2004;60 (1):1-13.

DOI: 10.1002/cyto.b.20008. PMID: 15221864.

11. Ehninger A., Kramer M., Rollig C. et al. Distribution and levels of cell surface expression of CD33 and CD123 in acute myeloid leukemia. Blood Cancer J 2014;4: e218. DOI: 10.1038/bcj.2014.39. PMID: 24927407.

12. Ortolani C. Flow cytometry of hematological malignancies. John Wiley & Sons, 2011.

cv

4

ев

cv

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.