CC BY
144
PEMEOUUM
А.Е. ШАХМАЕВ, АЛ. КАЦАЙ, В.В. ПРОХОРОВ, НТУ «ХПИ», Харьков, Украина, Министерство образования и науки Украины
A.В. СТАДНИЧЕНКО, кфарм.н., В.Ю. БАЛАБАНЬЯН, к.фарм.н., ООО «Технология лекарств», Москва
Ю.М. КРАСНОПОЛЬСКИЙ, д.фарм.н., профессор, НТУ «ХПИ», Харьков, Украина, Министерство образования и науки Украины
B.И. ШВЕЦ, академик РАН, д.хим.н., профессор, МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва, Министерство образования и науки Российской Федерации
Исследование методов включения лекарственных субстанций
В ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ
В статье приведены результаты исследования включения в липидные нано-частицы — липосомы фармацевтически активных субстанций (ириноте-кана, оксалиплатина, цитохрома С, доксорубицина, кверцетина и др.). Рассмотрены основные методы включения субстанций в липосомы: метод липидной пленки, методы градиента и химической связи. Приведены основные условия включения лекарственных веществ в липосомы. Обсуждаются вопросы определения включения в липосомы, получения и контроля готовых лекарственных липосомальных препаратов. Полученные препараты находятся на различных стадиях доклинических и клинических испытаний. Ряд предложенных препаратов зарегистрирован и используется в медицинской практике более 20 лет.
Создание лекарственных препаратов (ПР) на основе наночас-тиц является одним из перспективных направлений современной нанобиотехнологии [1—3]. Применение цитостатиков в наночастицах (антрациклиновые антибиотики, ПР платины, доцетаксел и др.) является перспективным направлением для преодоления лекарственной устойчивости к химио-ПР, а также снижения токсического действия свободных противоопухолевых ПР на органы ткани.
Хорошо известен ряд наноструктур, используемых как носители лекарственных ПР: полимерные наночасти-цы; липосомы (ЛС); нанодисперсии из масла и воды; циклодекстрины; нано-частицы металлов и ряд других [4, 5]. ЛС были открыты Bangham А. 50 лет назад. С этого времени во многих странах мира проводится разноплановое изучение ЛС. Наши исследования начаты с середины 70-х гг. и направлены на разработку ЛС диагностических ПР и изучение иммунохи-мической активности антигенов ли-пидной природы [6, 7]. В предыдущих сообщениях [7—9] нами рассмотрены вопросы производ-
Ключевые слова:
липосомы, липосомальные лекарственные препараты, активные фармацевтические субстанции, методы включения активных фармацевтических субстанций, стандартизация технологии, доклинические исследования, цито-статики, антиоксиданты
ства ЛС-ПР. В настоящее время мировой фармацевтической наукой и промышленностью разработаны, лицензированы и выведены на рынок уже более 40 ЛС-ПР направленного действия. ЛС-ПР, выпускаемые в разных лекарственных формах, используются в клинике внутривенно, внутримышечно, трансдермально, аэрозольно, ингаляторно и в форме глазных капель [2, 8, 10—12]. Использование ЛС-форм уменьшает концентрацию свободных ПР в кровотоке и препятствует их быстрому выведению почечной системой, что, в свою очередь, уменьшает токсичность активной фармацевтической субстанции и увеличивает терапевтический эффект за счет улучшения фармакокинетики и биораспределения. Кроме того, необходимо от-
Keywords: liposomes, liposomal drugs, active pharmaceutical substances, methods to include active pharmaceutical ingredients, standardization of technology, pre-clinical studies, cytotoxic agents, anti-oxidants
The article tells about the results of a study of entrapment in lipid nanoparticles — liposomes — of pharmaceutical active substances (irinotecan, oxaliplatin, cytochrome C, doxorubicin, quercetin, and others.). The basic methods of entrapment of substances in liposomes are considered: lipid film, gradient and chemical binding. The basic conditions for entrapment of drugs into liposomes are described. The questions of defining entrapment into liposomes, preparation and control of finished pharmaceutical liposomal formulations are discussed. The obtained preparations are in various stages of preclinical and clinical trials. A number of the proposed preparations are registered and have been used in medical practice for over 20 years. A.E. SHAKHMAEV, A.L. KATSAY, V.V. PROKHOROV, Kharkov Polytechnical Institute, Kharkov, Ukraine, Ministry of Education and Science of Ukraine, A.V. STADNICHENKO, PhD in pharmaceutics, V.Y. BALABANYAN, PhD in pharmaceutics, JSC «Tekhnologiya Lekarstv», Moscow, Y.M. KRASNOPOLSKIY, D. Pharm., Professor, Kharkov Polytechnical Institute, Kharkov, Ukraine, Ministry of Education and Science of Ukraine, V.I. SHVETS, RAS academician, D.Chem., Professor, Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies, Moscow, Ministry of Education and Science of the RF. A STUDY OF METHODS FOR ENTRAPMENT OF MEDICINAL SUBSTANCES IN LIPOSOMAL NANOPARTICLES.
метить, что при использовании ЛС возможно создание гидрофильных форм на основе липофильных субстанций, что повышает их биодоступность [7]. Особое значение имеет факт накопления ЛС в опухолях и очагах воспаления, что, прежде всего, связано с измененной структурой формирующейся de novo системы сосудов опухоли и повышенной проницаемости ее эндотелия. Нами предложена технологическая платформа получения ЛС-ПР [7, 13, 14]
ДЕКАБРЬ
56
МЕТОДЫ ВКЛЮЧЕНИЯ СУБСТАНЦИЙ В ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ
РЕмШиим
ДЕКАБРЬ 2 0 15
57
и рассмотрены основные методы их контроля и стандартизации ЛС [15, 16].
В настоящем сообщении мы остановимся на одной из основных критических стадий производства ЛС-ПР, использование которых в медицине является сегодня одним из наиболее перспективных и приоритетных направлений. Одним из важнейших этапов получения лекарственных ЛС-ПР является включение активного фармацевтического ингредиента в ЛС. Сегодня известно несколько методов включения активной субстанции в ЛС: во внутренний объем наночастиц; в гидрофобную область липидного бислоя; путем адсорбции на поверхности ЛС; за счет химического связывания с компонентами бислоя. Включение вещества в ЛС может реализоваться несколькими путями: образованием липидной пленки с введением в нее липофильной лекарственной субстанции с последующей гидратацией в водной среде; гидратацией липид-ной пленки водой или буферным раствором, содержащим активную фармацевтическую субстанцию; методом химического градиента ионов. Одним из способов включения является использование фармацевтической субстанции, которая может взаимодействовать с компонентами мембраны ЛС с образованием комплекса.
• МЕТОД ХИМИЧЕСКОГО ГРАДИЕНТА
Сегодня хорошо известны ЛС-ПР, полученные с использованием химического градиента. Интерес представляют работы по включению в ЛС доксо-рубицина гидрохлорида (ДР), успешно используемого при лечении онкозаболеваний [17, 18]. Метод основан на подкислении внутреннего объема раствора ЛС, вследствие чего проникшие в него нейтральные молекулы субстанции присоединяют протон, приобретая положительный заряд, и уже не могут выйти во внешнюю среду. Чем ниже рН внутри ЛС, тем больше вещества перераспределяется из внешнего объема во внутренний объем. Однако через некоторое время величина рН внутри и снаружи ЛС выравнивается, т. к. протоны довольно
хорошо проникают через мембрану и, следовательно, концентрация вещества внутри и вне ЛС также выравнивается. Также предложено заполнять ЛС не кислым буфером, а раствором аммония сульфата [19, 20]. При гидролизе этой соли образуется аммиак, являющийся молекулой незаряженной, который легко проникает через мембрану и выходит во внешний раствор. ЛС получают путем диспергирования липидной пленки в цитратном или фосфатном буферном растворе с рН 3,5—5,5. Механизм инкапсуляции, например антрациклиновых антибиотиков, в ЛС можно представить следующим образом: при попадании солянокислой формы антибиотика во внешний буферный раствор, содержащий фосфатный буферный раствор с величиной рН 6,5—7,5, создается равновесие, в результате чего часть антибиотика переходит в молекулярную форму и адсорбируется на поверхности ЛС, проходя при этом через ли-пидный бислой мембраны во внутреннее пространство. Внутри ЛС молекула протонируется с помощью протона, полученного в результате диссоциации цитрата натрия или по реакции обмена с ионом аммония. При этом молекула антибиотика теряет способность проходить через липидный бислой и в результате этого происходит процесс накопления ДР внутри ЛС. В другом случае ион аммония, отщепляя протон, превращается в газообразный аммиак в молекулярной форме, который проходит через мембрану ЛС в среду, окружающую ЛС. Включение антибиотика, например ДР в ЛС, составляет 75—85% от исходного количества субстанции [21—23].
Опыт, накопленный нами при получении ЛС-формы ДР, позволил получить ЛС-форму противоопухолевого препарата иринотекана (ИТ), который ингибирует фермент ДНК-топоизоме-разу I. ИТ и его активный метаболит SN-38 нарушают синтез ДНК в опухолевых клетках. В качестве мембраны ЛС использовали природный фосфа-тидилхолин (ФХ) и холестерин в установленных соотношениях и концентрациях. Полученную липидную пленку гидратировали буферным рас-
твором с рН около 2,0. ЛС получали методом экструзии по ранее разработанной методике [13, 14]. Были получены ЛС с размерами около 150 нм. Затем внешний кислый буфер заменяют на фосфатный буфер (рН-7,0). Замена наружного буфера проводится методом ультрафильтрации. Определяющими условиями при проведении процесса являются: температура, объемы промываемого раствора и нейтрального буфера, ионная сила растворов. При добавлении к таким ЛС лекарственного средства — водного раствора ИТ в концентрации от 1 до 5 мг/мл — цитостатик за счет диффузии проходит во внутреннее пространство ЛС через холестерин-ФХ мембрану и связывается с компонентами внутреннего буфера. После связывания внутри ЛС иринотекан теряет способность «возвращения» во внешний буфер, тем самым смещая равновесие «вещество внутри ЛС -> вещество снаружи ЛС» в сторону инкапсулированной формы. Определяющими при включении субстанции в ЛС являются температура и величина рН проведения процесса, ионная сила и время взаимодействия компонентов и ряд других факторов. С целью стабилизации продукта его лиофилизи-руют в присутствии криопротектора лактозы или трегалозы в концентрациях от 3 до 8%. Включение ИТ в ЛС составляет от 85 до 95% (до лиофили-зации) и 65—80% после лиофилиза-ции. Особое внимание необходимо уделять процессу регидратации высушенных препаратов — температуре, виду и объему растворителя. Таким образом, используя метод химического градиента, получены ЛС-ПР ДР гидрохлорида (1998 г.), идару-бицина гидрохлорида (2007 г.) и ИТ гидрохлорида (2013 г.). ЛС-ПР стабильны при хранении в лиофилизи-рованной форме, и количество включенного лекарственного вещества было достаточно высоким — не менее 60—85%. Предложенные режимы лио-филизации позволили сохранить наноразмеры в диапазоне 140—170 нм. ЛС-ПР, полученные по данному методу, были изучены в доклинических исследованиях и рекомендованы для проведения клинических испытаний.
ОЦЕНКА МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ
58 |2еКаБР5Ь| РЕМЕОииМ
• МЕТОД ЛИПИДНОЙ ПЛЕНКИ
Принцип метода заключается в получении раствора липидов и липофиль-ной лекарственной субстанции в органических растворителях (этанол, метанол, хлороформ и др.) с последующим образованием пленки, содержащей липиды и лекарственную субстанцию.
Получение липидной пленки проводят при перемешивании раствора ли-пидов в органическом растворителе при температуре 37—43 °С. При использовании липофильной субстанции ее растворяют в соответствующем органическом растворителе и смешивают с раствором липидов. Липидную пленку или пленку липи-дов с лекарственной субстанцией гид-ратируют в буферном растворе (или воде) для получения мультиламелляр-ных везикул. При использовании гидрофильных субстанций пленку гид-ратируют водой или буферным раствором, содержащим лекарственную субстанцию. Температура в процессе гидратации должна быть выше температуры фазового перехода используемых липидов. При получении везикул необходимо учитывать, кроме температуры, ряд факторов: рН и ионную силу буфера, концентрацию липидов и соотношение липид: лекарственное вещество, физико-химические свойства используемых компонентов. Кроме этого, необходимо в каждом конкретном случае учитывать заряд липида. Для предотвращения процессов окисления липидов эмульсию насыщают инертным газом. После получения мультиламеллярных частиц проводят получение наночас-тиц по методике, разработанной ранее [13, 14]. С использованием этой методики нами были предложены готовые лекарственные формы ПР: Ли-пин — ЛС форма ФХ (1991 г.), Лио-лив — ЛС форма гепатопротектора — Антраля (2003 г.); Липофлавон глазные капли — ЛС форма кверцетина (2006 г.) и Липофлавон (внутривенная форма — ЛС форма кверцетина (2007 г.), используемые в клиниках Украины. По методу липидной пленки получена ЛС-форма цисплатина: препарат прошел успешные доклинические и клинические
исследования (2007—2008). В настоящее время предложена технология получения ЛС-формы противоопухолевого препарата — доцетаксела. Аналогично с использованием липидной пленки предложены ЛС-формы и других препаратов. В качестве криопро-текторов изучены сахара в концентрациях от 3 до 8%. Оптимальные режимы лиофилизации позволили сохранить наноразмеры ЛС в диапазоне 140—200 нм. ЛС-ПР доцетаксела изучен в доклинических исследованиях и рекомендован для проведения клинических испытаний. Используя метод липидной пленки, нами были получены ЛС, содержащие в липидном бислое убихинон ^10) (2012—2014). Q10 проявляет антиок-сидантное, антигипоксическое, кар-диопротективные, кардиотонические иммуностимулирующие действия. В составе бислоя, помимо ФХ, использованы отрицательно заряженные синтетические фосфолипиды (ФЛ). Включение Q10 в ЛС не менее 80%. Размер ЛС после лиофилизации 80— 165 нм. Фармакологическое исследование ЛС-формы Q10 проведены на модели инфаркта миокарда и ишеми-ческой болезни сердца у крыс. Установлена фармакологическая эффективность полученного продукта, что проявилось в нормализации продуктов перекисного окисления сыворотки крови и миокарда. Фармакологическими исследованиями на указанных моделях установлена рациональная концентрация Q10 и ФХ в составе ЛС-формы.
• МЕТОД ХИМИЧЕСКОЙ СВЯЗИ
Метод основан на возможности образования химической связи между компонентом бислоя ЛС и активной фармацевтической субстанции. В качестве примера можно остановиться на водорастворимой субстанции — Цитохроме С (ЦС), который нашел широкое применение в офтальмологии при дистрофии и помутнении роговицы, кератитах, оказывая антиги-поксическое и трофическое действие, стимулируя процессы регенерации и являясь катализатором клеточного дыхания. Механизм действия препа-
рата связан с наличием в простетиче-ской группе железа и его способностью переходить из окисленной формы в восстановленную. В результате ускоряются эндогенные окислительно-восстановительные реакции и обменные процессы в тканях, улучшается утилизация кислорода и снижается гипоксия тканей при различных патологических состояниях. Установлено, что в хрусталике глаза при катаракте концентрация ЦС снижена. Так как ЦС не способен активно проникать в роговицу в целом виде, было решено включить ЦС в ЛС, что позволяет увеличить проникновение ЦС в ткань глаза [24].
Для получения ЛС, содержащих ЦС, нами использована способность образования комплекса между ЦС и отрицательно заряженными ФЛ (например, дифосфатидилглицерин, фо-сфатидилглицерин, фосфатидная кислота и др.). В связи с этим включение в состав ЛС отрицательно заряженного ФЛ и ФХ как основного мембрано-образуюего липида позволило получить ЛС-ПР. Причем степень включения ЦС зависит от соотношения используемых липидных компонентов и количества взятого ЦС. В этих условиях положительно заряженные аминогруппы на молекулах ЦС вступают во взаимодействие с отрицательно заряженными группами на молекуле ФЛ. Установлены основные закономерности получение ЛС-формы ЦС: получение липидной пленки, образование комплекса липид-цитохром С, получение ЛС и условий лиофилизации препарата. В результате получен лекарственный препарат, содержащий 90—95% включенного ЦС с размером частиц 120—170 нм. Установлена стабильность лиофилизированного препарата при хранении. Проведены доклинические исследования определения безопасности и специфической активности на модели проникающей травмы роговицы, позволившие рекомендовать препарат для соответствующих клинических испытаний. Лекарственный препарат способствует ускорению регенеративных процессов, уменьшает выраженность клинических проявлений повреждения ткани глаза, нивелиру-
МЕТОДЫ ВКЛЮЧЕНИЯ СУБСТАНЦИЙ В ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ
PEMfOUUM
ДЕКАБРЬ 2 0 15
59
ет остаточные явления в процессе заживления.
Нами начаты работы по созданию ЛС-формы оксалиплатина (ОП). Для получения ЛС-формы ОП также была использована возможность образования комплекса между цитостатиком и отрицательно заряженными липидами мембраны ЛС. Изучено влияние липид-ного состава ЛС на эффективность включения в наночастицу ОП. В состав ЛС был введен холестерин, который сам по себе не образует бислоя, но приводит к конденсации и загустению ФЛ бислоев выше температуры фазового перехода. Определен оптимальный
состав ЛС, соотношение компонентов мембраны и изучены условия, оптимизирующие включение ОП в ЛС. В этих условиях положительно заряженные аминогруппы на молекулах ОП вступают во взаимодействие с отрицательно заряженными группами на молекуле отрицательно заряженного ФЛ — ди-пальмитоилфосфатидилглицерина. Обнаружено, что гидратация лиофили-зированного ПР сопровождалась увеличением включением ОП в ЛС. В результате получен ЛС-ПР, содержащий не менее 50—60% включенного ОП. В лиофилизированном ПР сохранены наноразмеры частиц (100—150 нм).
Таким образом, в данных исследованиях разработаны и успешно применены три различных метода включения лекарственной субстанции в ЛС. Изучено влияние состава липидов, их соотношения и заряда на включение в ЛС активных фармацевтических субстанций. Получен ряд лекарственных ЛС-ПР, содержащих гидрофильные и липофильные компоненты [25], одни из которых широко используются в клинике, другие прошли доклиническое изучение, и получены разрешения для проведения их клинических испытаний.
ИСТОЧНИКИ
1. Gregoriadis G. Liposome Technology. Volume 1 Liposome preparation and related techniques / G. Gregoriadis — London: Healtheare, 2007.— Volume 1-324 p. Volume 2-307 р. Volume 3 — 434.
2. Дудниченко А.С., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомаль-ные лекарственные препараты в эксперименте и клинике. Харьков: РФ-Каравелла. 2001.143 с.
3. Баллюзек Ф.В. Нанотехнологии для медицины / Ф.В. Баллюзек, А.С. Куркаев, Л. Сенте. Санкт-Петербург, 2008. — 103 с.
4. Гельперина С.Э., Швец В.И. Системы доставки лекарственных веществ на основе полимерных наночастиц. Биотехнология, 2009, 3: 8-23.
5. Alving CR. Vaccine adjuvant. In: Vaccines for Biodefense and Emerging and Neglected Diseases / C.R. Alving, A. Barrett, L. Stanberry — Academic Press, Amsterdam, 2009. P. 115-129.
6. Степанов А.Е., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Физиологически активные липиды. М.: Наука. 1991. 136 с.
7. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Липидная технологическая платформа для создания новых лекарственных форм и транспорта фармацевтических субстанций. Биофармацевтический журнал, 2011, 3(2): 10-18.
8. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Технологические аспекты получения липосомальных препаратов в условиях GMP. Биофармацевтический журнал, 2009, 1(3): 18-29.
9. Стадниченко А.В., Краснопольський Ю.М., Ю.1. Губин, Коваленко С.Н. Отримання лшосомальних форм цитостатиив за технолопею «хiмiчного град1ента». Вюник фармацй, 2010, 2(2): 6-9.
10. Вai Sh, Gupta V, Ansan Е Cationic liposomes carriers for aerosolized formulations of an anionic drug: Safety and efficacy study European J. of Pharmaceutical Sciences, 2009, 38(2): 165-171.
11. Вai Sh, Ansan Е Inhalable Liposomes of Low Molecular Weight Heparin for the Treatment of venous Thromboembolism. J. of Pharmaceutical sciences, 2010, 99(1): 4554-4564.
12. Rangar S, Sirohi P, Verma P, Agarwal V. Nanoparticle — based drug delivery system . Вrazilian Archives of Biology and Technology, 2014, 57(2): 209-222.
13. Краснопольский Ю.М., Балабаньян В.Ю., Шоболов Д.Л., Швец В.И. Перспективы применения в клинической практике наноразмерных форм лекарственных препаратов. Российский Химический журнал (Журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева), 2012, LVI(3-4): 11-32.
14. Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Технологические принципы получения липосомальных лекарственных препаратов и их применение в клинике. Нанотехнология и охрана здоровья, 2013, V(2): 125-135.
15. Борщевский ГИ., Товмасян Е.К., Краснопольский Ю.М., Гризодуб А.И. Стандартизация липосомальных лекарственных средств. Фарма-ком., 2013, 2: 5-12.
16. Krasnopolsky Yu.M., Stepanov A.E., Shvets VI. Analysis of Risk Factors Under Production of Preparation Based on Biotechnology Third Russian Symposium with International Participation BI0PHARMA-2011: from science to industry. May 16-20, 2011. Tel Aviv,Israel. P. 12-13.
17. Стадниченко А.В., Краснопольський Ю.М., Коваленко С.М. Визна-чення ступеня iнкапсуляцii у лшосомах з антрациклиновими анпбютками, отриманими за допомогою методу «хiмiчного градiен-ту». Фармацевтичний журнал, 2008, 5: 98-103.
18. Barentholz Y. Amphipathic Weak loading into preformed Liposomes having a trans-membrane Ammonium Ion Gradient. Liposome Technology Third Edition. V. 2. Entrapment of Drugs and other materials into Liposomes. Edited by Gregoriadis G. "Informa". New York-London.
2007. P 1-25.
19. Chiu G, Abraham S, Ickenstein L et al. Encapsulation of doxorubicin into thermosensitive liposomes via complexation with the transition metal manganese. J. of controlled release, 2005, 194(2): 271-288.
20. Eenske D.B., Cullis P.R. Encapsulation of Drugs Within Liposomes by pH-Gradient Techniques. Liposome Technology. Third Edition. V. 2. Entrapment of Drugs and other materials into Liposomes. Edited by Gregoriadis G. "Informa". New York-London. 2007. P. 27-50.
21. Пономарева О.В., Киндзельский Л.П., Кулик ГИ. Липосомальная форма доксорубицина гидрохлорида «Липодокс» в лечении лимфогранулематоза и неходжкинских лимфом. Врачебное дело, 2001, 1: 112-117.
22. Пономарева О.В., Кулик Г.И., Бондарук О.С. и др. Липосомальная форма доксорубицина («Липодокс») в лечение больных раком молочной железы. Онкология, 2004, 6: 211-214.
23. Barenholz Y. Relevancy of drug loading to liposomal formulation therapeutic efficacy. J. of liposome research, 2003, 13(1): 1-8.
24. Краснопольский Ю.М., Григорьева А.С., Конахович Н.Ф., Степанов А.Е. Швец В.И. Получение комплексного препарата липосом. Материалы конгресса. Часть 1. 2011. «Биотехнология: состояние и перспективы развития» VI Московский международный конгресс. С. 411-414.
25. Швец В.И., Каплун А.П., Краснопольский Ю.М. От липосом 70-х к нанобиотехнологии XXI столетия. Российские нанотехнологии,
2008, 3(11-12): 643-655.
