CC BY
72
УДК 612.57:577.352.2:615.277.3:579.873.7
D. A. Bezrukov1, A. I. Koroleva1, A. P. Kaplun , A. V. Lantsova2, O. L. Orlova2, N. A. Oborotova2
OPTIMIZATION OF THE METHOD FOR THERMOSENSITIVE STERICALLY STABILIZED LIPOSOMES OBTAINING WITH ACTIVE DOXORUBICINE LOADING
1M. V. Lomonosov Moscow State Academy of Fine Chemical Technology 2N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
In order to improve loading process manufacturability and doxorubicine payload for further production scaling optimal conditions for thermosensitive sterically stabilized liposomes (DPPC:DSPC:DSPE-PEG-2000:Chol (9:1:0,02:0,2) obtaining were developed. То accomplish active loading transmembrane ammonium sulfate gradients were used. Obtained liposomes (230-250 nm) are stable during more than one day, efficiency of the doxorubicine loading is more then 85%.
Key words: hyperthermia, liposomes, thermoliposomes, doxorubicine, gel-filtration, release kinetic.
Д. А. Безруков1, А. И. Королева1, А. П. Каплун1, А. В. Ланцова , О. Л. Орлова , Н. А. Оборотова
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЛИПОСОМ С АКТИВНОЙ ЗАГРУЗКОЙ ДОКСОРУБИЦИНОМ
1 Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова 2ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
С целью увеличения технологичности процесса загрузки и степени включения доксорубицина в липо-сомы для дальнейшего масштабирования производства отрабатывались оптимальные условия получения стерически стабилизированных липосом (DPPC:DSPC:DSPE-PEG-2000:Chol (9:1:0,02:0,2), активно загруженных препаратом против градиента сульфата аммония. Полученные по разработанной методике липосо-мы агрегационно устойчивы в течение нескольких суток, имеют стабильную степень включения доксору-бицина во внутренний объем везикул не менее 85 % и размер 230-250 нм.
Ключевые слова: гипертермия, липосомы, термолипосомы, доксорубицин, гель-фильтрация, кинетика высвобождения.
ВВЕДЕНИЕ
Липосомы как средства доставки лекарственных веществ обладают целым рядом достоинств и являются перспективной лекарственной формой. Кроме того, модификация липосом, например, полиэтиленглико-левыми цепочками, позволяет делать липосомы «невидимыми» для клеток ретикулоэндотелиальной системы, тем самым значительно продлевая время цир-
куляции везикул в кровотоке и повышая эффективность применения препарата за счет пассивного нацеливания.
Однако при использовании липосом любого типа важно, чтобы лекарственное вещество выходило из липосом только по достижении ткани или органа-мишени. По этой причине активно разрабатываются и исследуются липосомы с механизмами контролируемо-
80 ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТЕРАПИЯ
го высвобождения. Под воздействием определенного гичным образом, за исключением того, что все мани-фактора (например, при гипертермии) эти липосомы пуляции проводили при комнатной температуре. способны с контролируемой скоростью высвобождать вещества, которые были в них загружены. Особенно Определение степени интересны такие липосомы в случае активного нацели- включения доксорубицина вания на опухолевые клетки с неравномерным распре- На колонку NAP-5 наносили 5ÖÖ мкл липосомальной делением мишеней. Клетки, не экспрессирующие или дисперсии, элюировали Ö^yD-mM раствором хлорида экспрессирующие недостаточное количество маркеров- натрия, в первом миллилитре снимали липосомальную мишеней, могут быть уничтожены в результате высво- фракцию. Из двукратно разбавленной (для учитывания бождения лекарственного вещества из липосом, свя- разбавления на колонке) соответствующим буфером ис-завшихся с поверхностью соседних клеток [2]. Еще ходной и отделенной от не включившегося доксорубици-одним преимуществом термочувствительных липосом на дисперсии отбирали аликвоты по lÖÖ мкл, разрушали является обратимость фазового перехода, т.е. при вы- липосомы lÖ-кратным избытком спирта и измеряли опти-ходе липосом из зоны гипертермии высвобождение ческую плотность (D^ и Dconc соответственно) образцов включенного вещества существенно сокращается. на длине волны 48Ö нм, после чего рассчитывали количе- В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН на протя- ство вышедшего доксорубицина. жении многих лет ведутся исследования по поиску новых средств доставки противоопухолевых препаратов. В ранее пр°веденных исследованиях в качестве Степень включения = conc 100% новой лекарственной формы доксорубицина (DOX) ^ Dinit J предложены длительно циркулирующие термочувствительные липосомы с активной загрузкой DOX рН- градиентным методом. Однако по ряду параметров Определение размера липосом более технологичным представляется метод загрузки Размер липосом определяли на спектрометре доксорубицина в липосомы против градиента сульфа- NICOMP-38Ö (Particle Sizing Systems, США), предназна-та аммония [3]. Предметом данного исследования бы- ченном для измерения частиц и распределения дисперги-ла оптимизация этого метода для повышения степени рованного материала. Определение размера частиц осно-загрузки целевого вещества и разработка легко мас- вано на разнице плотностей между лазерным рассеивани-штабируемой методики получения термочувствитель- ем лучей дифракции и поляризации (метод PCS - Photon ных стерически стабилизированных липосом. Correlation Spectroscopy). Для расчетов использовался поставляемый в комплекте с прибором пакет программного МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ обеспечения. Для получения липосом использовали дипальмито-илфосфатидилхолин (DPPC); дистеароилфосфатидилхо- Оценка термочувствительных свойств лин (DSPC), пегелированный дистеароилфосфатидилэта- полученных липосом ноламин (PEG-2ÖÖÖ-DSPE) фирмы Lipoid; яичный фосфа- Интенсивность флюоресценции доксорубицина из-тидилхолин (ePC) (Биолек, Украина); холестерин (Chol) меряли на спектрофлюориметре Cary Eclipse (Varian, (Sigma); cульфaт аммония (Химмед, Россия). Доксоруби- США). цина гидрохлорид ФСП 42-Ö24Ö-257Ö-Ö2 любезно предос- Из дисперсии моноламеллярных термочувствитель-тавлен ОАО «ОНОПБ» (Россия). Все вещества соответст- ных липосом, полученных по указанной методике, отби-вовали нормативной документации и использовались без рали 5ÖÖ мкл и наносили на колонку NAP-5, в первом мл дополнительной очистки. снимали липосомальную фракцию. Из нее отбирали али-Липосомы отделяли от низкомолекулярных веществ квоту lÖÖ мкл и разбавляли 2 мл Ö,9 %-ного раствора хло-гель-фильтрацией на колонках NAP-5 Sephadex G-25 рида натрия. Полученные образцы в закрытой кювете (Amersham Biosciences). помещали в спектрофлюориметр и фиксировали измене-Моноламелярные липосомы получали экструзией че- ние интенсивности флюоресценции (Ex/Em рез ядерные поликарбонатные фильтры (Whatman, Nucle- 475 нм/590 нм) при нагревании в следующих режимах: pore) с размером пор 2ÖÖ нм на приборе фирмы Avestin. l. Нагревание со скоростью 2 "С/мин до Зб "С; далее - Ö,5 "С/мин до 45 "С. Получение липосом 2. Инкубация при 43 "С в течение lÖ мин. В качестве базовой была выбрана методика за- 3. Инкубация при 37 "С в течение lÖ мин. грузки доксорубицина с использованием градиента Аналогичным образом проводили контрольный сульфата аммония [3]. эксперимент с нетермочувствительными липосомами. Доксорубицин включали в термочувствительные ли-посомы (DPPC:DSPC:DSPE-PEG-2ÖÖÖ:Chol 9:l:Ö,Ö2:Ö,2 Определение степени высвобождения (мольн.)) против градиента сульфата аммония в соотно- доксорубицина из липосом при 43 0С шениях вещество/липид Ö,Ö7-Ö,27. После инкубации при 43 "С в течение lÖ мин ли-Нетермочувствительные липосомы (ePC:DSPE- посомальную дисперсию охлаждали до комнатной PEG-2ÖÖÖ:Chol lÖ:Ö,Ö2:Ö,2 (мольн.)) получали анало- температуры, отбирали из кюветы флюориметра 5ÖÖ
№ 4/том 5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
мкл и разделяли на колонке NAP-5. Из исходной и отделенной от вышедшего из липосом доксоруби-цина дисперсий отбирали аликвоты 200 мкл, разрушали липосомы в 10-кратном избытке спирта и измеряли интенсивность флюоресценции (Itoit и Iconc соответственно) образцов (Ex/Em 475 нм/590 нм) и, учитывая двукратное разбавление на колонке, рассчитывали количество вышедшего доксорубицина.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе данного исследования подбирались оптимальные условия для получения стерически стабилизированных липосом, активно загруженных доксорубицином, причем особое внимание уделялось простоте и технологичности разрабатываемого метода, который позволял бы нарабатывать ли-посомальный препарат в количествах, необходимых для доклинических и клинических испытаний.
В базовой методике загрузки с использованием градиента сульфата аммония использовалась схема, по которой спиртовой раствор липидов смешивается с водным раствором сульфата аммония, после чего спирт удаляется на роторном испарителе, в результате формируется исходная дисперсия мультиламеллярных везикул. Однако недостатком такого подхода является необходимость заранее добавлять некоторый избыток воды, так как спирт испаряется в виде азеотропной смеси. Кроме того, часть спирта при таком методе неизбежно сохраняется в исходной дисперсии, что не контролируемым образом негативно влияет на степень загрузки целевого вещества (степень загрузки док-сорубицина составила от 18 до 60 %). Кроме того, снижается стабильность липосомальной дисперсии в целом - агрегаты, видимые невооруженным глазом, образуются в течение первых сут.
В связи с этим была предложена следующая схема получения исходной дисперсии. Из раствора липидов в хлороформе на роторном испарителе формируется липидная пленка, которая впоследствии высушивается в вакууме (0,04-0,05 мБар) для максимального удаления органического растворителя. Недостаточное высушивание, как и в описанном выше случае, приводит к снижению степени загрузки целевого вещества до значений порядка 40 %.
Использование серии циклов замораживания - оттаивания, хотя и описывается в классических методиках получения липосом, как процедура, увеличивающая монодисперсность и включение [4], но при получении сравнительно больших объемов является достаточно трудоемким и нетехнологичным этапом. Кроме того, в нашем случае влияние данной стадии на величину загрузки и стабильность дисперсии оказалось незначительным, поэтому данную методику не применяли.
Гидратацию липидной пленки проводили 250 мМ раствором сульфата аммония при механическом встряхивании и нагреве до 50 °С. Образующаяся дисперсия достаточно однородна и экструдируется при
50 °С через ядерные поликарбонатные фильтры с размером пор 200 нм.
Следующий этап подготовки липосомальной дисперсии к активной загрузке - создание градиента концентрации сульфата аммония. Как правило, для этого используются методы, основанные на удалении не включившейся в липосомы соли, такие, как гель-фильтрация и диализ, но эти методы имеют ряд ограничений, трудоемки, требуют существенных временных затрат. В данном случае предлагается следующее решение: объем раствора соли для гидратации липи-дов выбирается таким образом, чтобы их концентрация в образующейся дисперсии в 20 раз превышала расчетную концентрацию в целевом препарате, а необходимый для загрузки градиент концентрации сульфата аммония формируется простым 20-кратным разбавлением дисперсии моноламеллярных липосом соответствующим буфером. Степень загрузки при использовании 0,9%-ного раствора хлорида натрия для разбавления (по предлагаемой методике) и элюирования липосом с колонки (при использовании гель-фильтрации для отделения не включившейся соли) составила 69-72 и 64 % соответственно, что позволяет сделать вывод об отсутствии для липосом данного состава преимущества у гель-фильтрации по сравнению с предложенным методом.
С целью повысить степень включения препарата для разбавления дисперсии моноламеллярных везикул и проведения собственно активной загрузки брали слабощелочной буфер (10 мМ НЕРЕБ, доведенный до значения рН 8,2-8,4 3М раствором гидрооксида натрия), так как с уменьшением кислотности буфера увеличивается количество молекул доксорубицина, находящихся в непротонированной форме и как следствие способных к более легкому проникновению через липидный бислой. Однако следует помнить, что не протонированный доксорубицин существенно хуже растворим в воде, поэтому при чрезмерное высоком рН может выпадать в осадок, делая дальнейшую загрузку невозможной. Наиболее стабильные результаты получены для указанного буфера при рН 8,4 (для доксорубицина рКА 8,3 [1], следовательно, при рН 8,4 более 50 % субстанции будет находиться в не ионизированной форме), степень загрузки в серии экспериментов составила от 85 до 92 % при весовом соотношении субстанция/липиды 0,2.
Для стабилизации лекарственной формы в хранении планируется лиофилизация. Обязательное условие целостности везикул при лиофилизации и хранении сухого препарата - наличие криопротектора, который обеспечивает снижение температуры фазового перехода липидов, входящих в состав бислоя, и сохраняет их в жидкокристаллическом состоянии. В качестве криопротектора использовали 5%-ный раствор лактозы в 10 мМ буфере НЕРЕБ.
Выбор температурного режима загрузки диктовался следующими соображениями. Хотя липидный бислой является эффективной преградой на пути ионов и полярных молекул, его проницаемость значи-
82
ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТЕРАПИЯ
тельно увеличивается при температуре фазового перехода (Tm) гелевая-жидкокристаллическая фаза, что делает возможным пассивный переход заряженных и полярных веществ через мембрану [7]. И теоретические соображения, и проведенные ранее исследования указывают, что проницаемость бислоя увеличивается из-за дефектов упаковки молекул, особенно в областях соприкосновения участков гелевой и жидкокристаллической фазы [5]. Хотя проницаемость мембраны, как и некоторые другие величины (например, удельная теплоемкость), максимальны в районе температуры Tm, отмечается, что значительная часть включенного вещества может выходить и при температуре несколько ниже данной, т.е. когда фазовый переход только начинается [6].
Исходя из вышесказанного, представляется целесообразным проводить загрузку при температуре несколько выше температуры фазового перехода, причем нагревать дисперсию моноламеллярных везикул до выбранной температуры следует перед разбавлением, чтобы исключить утечку сульфата аммония из ли-посом в момент прохождения точки максимума проницаемости мембраны. По тем же соображениям соответствующий буфер, применяемый для разбавления, и раствор доксорубицина перед прибавлением к липосомальной дисперсии следует нагреть до температуры, несколько выше температуры фазового перехода липидов (50 °С).
Таким образом, нами разработана следующая методика.
Получение «пустых» термолипосом
Точные навески липидов DPPC - 52,5 мг, DSPC - 6,2 мг, DSPE-PEG-2000 - 0,44 мг и 6 мг холестерина растворяют в 4 мл хлороформа. Ли-пиды помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 мл и упаривают при 30 °С на роторном испарителе под вакуумом до образования пленки липидов. Пленку подсушивают при 50 °С, затем в течение 1 ч досушивают остатки растворителей в камере сублимационной сушки Beta 1-8 LD фирмы CH RIST под вакуумом. Далее липидную пленку гидратируют 1,5 мл 250 мМ раствора аммония сернокислого при 50 °С и постоянном перемешивании и измельчают при нагревании (Т=50 °С) с помощью ручного мини-экструдера через поликарбонатные мембранные фильтры с размером пор 0,2 нм.
Полученную липосомальную дисперсию делят на 2 части:
•0,75 мл используют для включения доксоруби-цина;
•0,25 мл оставляют «пустыми» в качестве раствора сравнения в химико-фармацевтическом анализе для количественного определения доксорубицина.
Включение в липосомы доксорубицина
0,75 мл пустых липосом, нагретых на водяной бане до 50 °С, смешивают с 12,25 мл нагретого до той
же температуры буфера HEPES с лактозой (10 мМ HEPES с pH 8,0-8,4, содержащий 5,0 % лактозы) и добавляют 2 мл раствора доксорубицина, нагретого до 50 °С (содержание 3 мг/мл). Далее полученную смесь нагревают до 50 °С при постоянном перемешивании.
Средний размер термочувствительных липосом в полученной дисперсии составлял после активной загрузки доксорубицином 230-250 нм и существенно не изменялся в течение последующих 2 сут.
Динамика высвобождения доксорубицина из стерически стабилизированных термочувствительных липосом
Оценка динамики высвобождения доксорубицина из стерически стабилизированных термочувствительных липосом при температуре фазового перехода ли-пидной композиции и ниже возможна благодаря тому, что после активной загрузки концентрация доксору-бицина внутри липосом превышает концентрацию самотушения флюоресценции. Поэтому оценивали динамику высвобождения препарата в раствор по возрастанию флюоресценции дисперсии.
Дисперсию отделенных от невключившегося док-сорубицина липосом медленно нагревали от 36 °С до 45 °С, фиксируя одновременно изменение интенсивности флюоресценции (Ex/Em 475 нм/590 нм) во времени.
В процессе нагревания заметное увеличение истечения доксорубицина происходит при 42,5 °С (рис. 1 и 2). Исходя из этого, далее сравнивали интенсивность выхода доксорубицина из термочувствительных липосом, термостатируя дисперсию при 37 °С и 43 °С. Относительное изменение интенсивности флюоресценции через 10 мин составило 28 и 118 условных единиц по шкале прибора соответственно. Таким образом, при 43 °С изменение интенсивности флюоресценции дисперсии термочувствительных липосом, активно загруженных док-сорубицином, более, чем в 4 раза, превышает изменение данного параметра при 37 °С.
Для сравнения подобный эксперимент был проведен для нетермочувствительных липосом, в данном
Рис. 1. Изменение интенсивности флюоресценции липосомальной дисперсии при нагревании со скоростью 0,5 °С/мин
Время, мин
Время (мин)
Рис. 2. Изменение интенсивности флюоресценции дисперсии термочувствительных липосом, термо-статируемой при 43 °С (А) и 37 °С (Б)
случае скорость и степень высвобождения доксоруби-цина при 37 "С и 43 "С существенным образом не отличалась.
Так как прямое флюориметрическое количественное определение высвободившегося доксоруби-цина затруднено рассеянием света в липосомальной дисперсии, а также тем, что доксорубицин, по-видимому, частично ассоциирован с поверхностью бислоя липосом, количество вышедшего при термо-статировании доксорубицина определяли с помощью колоночной гель-хроматографии. В течение 10 мин при 43 "С липосомы, полученные по предложенной методике, высвобождают в раствор 31,1 % включенной субстанции.
ВЫВОДЫ
1. Полученные по разработанной методике липо-сомы агрегационно устойчивы в течение нескольких суток, имеют стабильную степень включения доксо-рубицина во внутренний объем везикул не менее B5 %, размер 230-250 нм.
2. Термолипосомы с данной композицией липидов обладают способностью триггерно высвобождать включенный доксорубицин при температуре 43 "С.
ЛИТЕРАТУРА
1. Adams D. J. The Impact of Tumor Physiology on Camptothecin-Based Drug Development// Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. - 2005. - 5. - P. 1-13.
2. Allen T. M., Lopes de Menezes D., Hansen C. B., Moase E. H. Stealth liposomes for the targeting of drugs in cancer therapy. - McC. Gregoriadis (Ed.), Targeting of Drugs 6: Strategies for Stealth Therapeutic Systems, Plenum, New York, 1998. - P. 61-75.
3. Haran G., Cohen R., Bar L.K., Barenholz Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposome produce efficient and stable entrapment of amphipatic weak basis // Biochem. Biophys. Acta. - 1993. - Vol. 1151. - P. 201-15.
4. Liposomes: A Practical Approach, Second Edition, Edited by V. Torchilin and V. Weissig, Oxford University Press, 2003. - P. 9.
5. Mouritsen O. G., Jorgensen K., Honger T. Permeability of lipid bilayers near the phase transition, in: H.A. Disalvu, S.A. Simon (Eds.), Permeability and Stability of Lipid Bilayers. - CRC Press, Boca Raton, FL, 1994. - P. 137.
6. Needham D., Dewhirst M. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2001. - 53. - P. 285-305.
7. Papahadjopoulos D., Jacobsen K., Nir S., Isac T. Phase transitions in phospholipid vesicles. Fluorescence polarization and permeability measurements concerning the effects of temperature and cholesterol // Biochim. Biophys. Acta. - 1973. - 311. - P. 330.
Поступила 30.11.2006.
