CC BY
4
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 577.322.63
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА КОФЕРМЕНТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ФЕНИЛАЦЕТОНМОНООКСИГЕНАЗЫ ИЗ THERMOBIFIDA FUSCA МЕТОДОМ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
1 2 Павел Дмитриевич Паршин , Устина Александровна Мартысюк , Денис
13 3
Леонидович Атрошенко ' , Анна Владимировна Попинако , Святослав Сергеевич Савин1'3, Евгений Владимирович Пометун4, Владимир Иванович
13 13
Тишков ' , Анастасия Александровна Пометун '
1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, Россия
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва, Россия
4 Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Россия
Авторы для переписки: Владимир Иванович Тишков, vitishkov@gmail.com; Анастасия Александровна Пометун, aapometun@gmail.com
Аннотация. Фенилацетонмонооксигеназа из Thermobifida fusca (КФ 1.14.13.92, PAMO) принадлежит к семейству монооксигеназ Байера-Виллигера и катализирует реакции окисления различных ароматических кетонов до соответствующих сложных эфиров с использованием NADPH в качестве кофактора. В работе проанализирована структура центра связывания кофактора, выбраны наиболее важные для узнавания фосфатной группы кофактора аминокислотные остатки и проведено моделирование аминокислотных замен, потенциально способных привести к изменению коферментной специфичности фермента от NADPH к NADH. На основе проведенного моделирования предложены наиболее перспективные аминокислотные замены T218D, T218E, K336A, K336R. С помощью направленного мутагенеза получены генетические конструкции, которые содержат гены, кодирующие PAMO с соответствующими аминокислотными заменами, проведены экспрессия и очистка ферментов. Полученные мутантные PAMO способны связывать NADH, но не обладают способностью катализировать окисление бензил-ацетона в присутствии NADH и демонстрируют ухудшение констант Михаэлиса по NADPH. Каталитические константы изучаемых мутантных ферментов немного уменьшаются, однако это изменение находится в пределах погрешности эксперимента.
Ключевые слова: фенилацетонмонооксигеназа, монооксигеназа Байера-Виллигера, белковая инженерия, направленный мутагенез, коферментная специфичность
Финансирование. Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-3490120). Использовалось оборудование Центра коллективного пользования «Геном» Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Центра
© Паршин П. Д., Мартысюк У.А., Атрошенко Д. Л., Попинако А. В., Савин С. С., Пометун Е.В., Тишков В.И., Пометун А.А., 2022
коллективного пользования «Промышленные биотехнологии» Федерального государственного учреждения «Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук».
Для цитирования: Паршин П.Д., Мартысюк У.А., Атрошенко Д.Л., Попина-ко А.В., Савин С.С., Пометун Е.В., Тишков В.И., Пометун А.А. Исследование механизма коферментной специфичности фенилацетонмонооксигеназы из Ther-mobifida fusca методом направленного мутагенеза // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. Т. 63. № 5. С. 334-343.
ORIGINAL ARTICLE
STUDY OF MECHANISM OF COENZYME SPECIFICITY OF PHENYLACETONE MONOOXYGENASE FROM THERMOBIFIDA FUSCA BY SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
1 2 13
Pavel D. Parshin , Ustina A. Martysuk , Denis L. Atroshenko ' , Anna V. Popina-ko3, Svyatoslav S. Savin1' 3, Evgeny V. Pometun4, Vladimir I. Tishkov1' 3, Anastasia A. Pometun13
1 M.V. Lomonosov Moscow State University, Department of Chemistry, Moscow, Russian Federation
2 D.M. Mendeleev University of Chemical Technology, Moscow, Russian Federation
3 A.N. Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation
4 Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russian Federation Corresponding authors: Vladimir I. Tishkov, vitishkov@gmail.com; Anastasia A. Pometun, aapometun@gmail.com
Abstract. Phenylacetone monooxygenase from Thermobifida fusca (EC 1.14.13.92, PAMO) is a part of Baeyer-Villiger monooxygenases family. It catalyzes oxidation of different aromatic ketones to corresponding esters using NADPH as cofactor. In present work we analyzed cofactor-binding center, selected residues which are potentially important for recognition of 2'-phosphate group, followed by modeling amino acid substitutions which could result in change of the enzyme cofactor specificity from NADPH to NADH. As result of modeling the next amino acid changes were proposed - T218D, T218E, K336A, K336R. Plasmids with genes of PAMO with proposed mutations were prepared by site-directed mutagenesis. Mutant enzymes were expressed, purified and characterized. New mutant PAMOs bound NADH but they did not catalyzed benzyl acetone oxidation in presence of NADH and showed worse KM values with NADPH. Values of catalytic constants of mutant enzymes are slightly lower compared to wild type enzyme but deviations are in the range of experimental errors.
Keywords: phenylacetone monooxygenase, Baeyer-Villiger monooxygenase, protein engineering, site-directed mutagenesis, coenzyme specificity
Financial Support. The research was carried out with partial financial support from the Russian Foundation for Basic Research within the framework of scientific project No. 20-34-90120. During the research, the equipments of the Center for Collective Use "Genome" of the V. A. Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences and the Center for Collective Use "Industrial Biotechnologies" of the Federal State Institution "Federal Research Center "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences" were used.
For citation: Parshin P.D., Martysuk U.A., Atroshenko D.L., Popinako A.N., Savin S.S., Pometun E.B., Tishkov V.I., Pometun A.A. Study of Mechanism of Coenzyme Specificity of Phenylacetone Monooxygenase from Thermobifida fusca by Site-Directed Mutagenesis // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. T. 63. N 5. S. 334-343.
Список сокращений: ИПТГ - изопропил-Р^-1-гиогалакгопиранозид; FDH -формиатдегидрогеназа; PAMO - фенилацегонмонооксигеназа из Thermobifida fusca.
Для биотехнологических процессов с участием оксидоредуктаз в качестве источника энергии используют в большом количестве дорогостоящие восстановленные формы никотинамидных кофакторов NADH и NADPH. Несмотря на то, что единственным структурным различием NADPH и NADH является наличие в первом кофакторе фосфатной группы, большинство ферментов обладают очень высокой (часто абсолютной) коферментной специфичностью к одному из них. Исследование механизма такой специфичности представляет само по себе важную и интересную фундаментальную задачу. Решение этой задачи имеет также очень большое практическое значение, поскольку при рассмотрении возможности реализации промышленных процессов наиболее предпочтительной формой является более дешевый и стабильный NADH.
Решающим этапом в реализации процессов хирального синтеза с помощью NAD(P)-зависимых дегидрогеназ стало введение в процесс второй реакции, в результате которой окисленная форма кофермента вновь переходит в восстановленную [1]. Показано, что наиболее оптимальным ферментом для регенерации NADH является формиатдегидрогеназа (FDH) из метанолутилизирующих микроорганизмов [2, 3]. В то же время в силу физиологической роли NADPH именно в реакциях биосинтеза in vivo процессы с его участием представляют больший интерес. Однако эти процессы долгое время не осуществлялись, поскольку не были известны NADP+-специфичные FDH. Первые процессы хирального синтеза с помощью ок-сидоредуктаз и регенерации NADPH были описаны только в середине 90-х годов прошлого века [4, 5] после того, как в нашей лаборатории был получен первый вариант мутантной FDH из бактерий Pseudomonas sp.101 (PseFDH) с измененной специфичностью от NAD+ к NADP+ [6]. Позднее были получены мутантные NADP-специфичные PseFDH с улучшенными катали-
тическими свойствами и стабильностью [7-11]. Эти ферменты использовали в ряде процессов хирального синтеза, включая процессы, катализируемые моноокисгеназами Байера-Виллигера [12]. В настоящее время для снижения себестоимости биокаталитического синтеза в основном используют изменение коферментной специфичности практически важных оксидоредуктаз от NADP+ к NAD+. В литературе можно найти успешные примеры такого изменения методом направленного мутагенеза. Так, введение двух аминокислотных замен K21A/N272D позволило получить NADH-специфичную ксилозоредукта-зу, в то время как фермент дикого типа использует в качестве переносчика электронов исключительно NADPH [13].
Фенилацетонмонооксигеназа из Thermobifida fusca (КФ 1.14.13.92, PAMO) является термостабильной монооксигеназой Байера-Вилли-гера первого типа. Она содержит в активном центре FAD и катализирует реакции окисления ароматических кетонов до сложных эфиров [14]. PAMO, как и большинство монооксигеназ Байера-Виллигера первого типа, использует в качестве кофактора NADPH и проявляет значи -тельно меньшую активность с NADH. Исключением из этой закономерности является фермент MekA из Pseudomonas veronii MEK700, который обладает сравнимыми константами Михаэлиса по NADPH (29 мкМ) и NADH (11 мкМ) [15]. Работы по изменению коферментной специфичности проводили на нескольких ферментах данного семейства. В работе, посвященной 4-ги-дроксиацетофенонмонооксигеназе (HAPMO), показано, что замена аминокислотного остатка лизина в 439 положении (соответствует K336 в PAMO), находящегося в непосредственной близости к фосфатной группе NADPH в центре связывания кофермента, на остаток фенилаланина и аланина приводит к ухудшению каталитических свойств фермента в реакции с NADPH и улучшению в реакции с NADH. Также установлено, что любые замены канонического остатка
аргинина ^339 в НАРМО, R217 в РАМО), координирующего фосфатную группу NADPH, приводят к значительному ухудшению всех свойств фермента [16].
В работе [17] изучены аминокислотные замены S208D/E, Q210N/S, К326Н/^ К349^ L55R, S186P, T187L, W490Y, которые привели к улучшению свойств циклогексанонмоно-оксигеназы из Асте1оЬас1ег sp. NCIMB 9871 (СНМОАсШе(с). Многие из этих остатков присутствуют в структуре РАМО и находятся в непосредственной близости от центра связывания NADPH.
Анализ структуры кофермент-связывающего домена активного центра РАМО позволил выявить участие остатка Т218 в связывании фосфатной группы NADPH. Его замена на остаток аланина приводит к увеличению каталитиче -ской константы фермента в реакции с NADH, однако константа Михаэлиса также увеличи-вается [18]. Установлено, что замены H220N/Q приводят к значительному уменьшению константы Михаэлиса по NADH, а в случае замены H220N увеличивается и каталитическая константа. Мутация K336N не вызывает поло -жительных эффектов, хотя аналогичная замена приводит к шестикратному увеличению эффективности НАРМО с NADH.
В настоящей работе продолжены эксперименты по исследованию механизма коферментной специфичности РАМО. Проведен анализ структуры активного центра фермента и с учетом результатов предыдущих работ предложены новые
перспективные замены. Проведено моделирование возможного влияния выбранных замен, получены генетические конструкции, содержащие гены, кодирующие мутантные PAMO с этими заменами. Соответствующие ферменты получены, очищены и изучены.
Экспериментальная часть Компьютерное моделирование
Анализ структуры и моделирование му-тантных вариантов РАМО проводили с помощью программы UCSF Chimera [19], используя структуры фермента со связанным коферментом (PDBID 2YLR, 2YM1, 2YM2). Замены боковых радикалов аминокислот проводили, используя библиотеку различных конформаций боковых радикалов (ротамеров). Ротамеры были выбраны автоматически. Основные критерии отбора следующие: минимизация стерического напряжения, увеличение энергии водородных связей, соответствие конформациям боковых радикалов из библиотеки. Для оптимизации структурных моделей мутантов была проведена минимизация энергии с использованием подпрограммы минимизации UCSF Chimera без фиксации каких-либо атомов в системе.
Проведение реакции направленного мутагенеза
В качестве матрицы для получения генетических конструкций использовали ген pamo из T. fusca, содержащий дополнительную
Т а б л и ц а 1
Нуклеотидные последовательности используемых в работе праймеров
Праймер Нуклеотидная последовательность
PAMO_HisFor 5'- GCA TAT AGC CAT GGG TCA CCA CCA CCA CCA CCA TTC GGG TGC CGG GCA GAC GAC TG-3'
PAMO_Rev 5'-GGC CCA AGC TTT TAC TAG GTG AGG ACG AAA CCT TCG TAG CC-3'
T218D for 5'- TTC CAG CGC GAT CCC CAC TTT GCC GT-3'
T218D_rev 5'- CAA AGT GGG GAT CGC GCT GGA ACA CG-3'
T218E_for 5'- TTC CAG CGC GAA CCC CAC TTT GCC GT-3'
T218E rev 5'- CAA AGT GGG GTT CGC GCT GGA ACA C-3'
K336A_for 5'- TTC GGC ACC GCG CGC CTC ATC CTG -3'
K336A_rev 5'- GGA TGA GGC GCG CGG TGC CGA AC -3'
K336R_for 5'- TTC GGC ACC CGT CGC CTC ATC CTG -3'
K33бR_rev 5'- GGA TGA GGC GAC GGG TGC CGA ACG -3'
нуклеотидную последовательность, кодирующую 6 остатков гистидина на N-конце [20]. Все конструкции созданы на базе вектора серии pET28a(+). Введение необходимых нуклеотид-ных замен проводили с помощью двустадийной полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, представленных в табл. 1.
Полимер азную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторе «T 100 Thermal Cycler» («Bio-Rad»). К раствору смеси праймеров (20 пкмоль каждого) добавляли 2,5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, поставляемого фирмой-производителем вместе с ферментом, 1 мкл раствора MgС12 (25 мМ), 2 мкл раствора dNTP (2,5 мМ каждого), 1 мкл раствора геномной ДНК (50 нг/мкл), 0,5 мкл Phusion ДНК-полимеразы («ThermoFisher Scientific», 5 ед./ мкл) и 17 мкл деионизованной воды до общего объема 25 мкл. ПЦР проводили по следующей схеме: 30 циклов (10 с при 98 °С; 10 с при 72 °С; 1,5 мин при 72 °С), далее элонгация 10 мин при 72 °С.
Продукты ПЦР очищали электрофорезом в 1%-м агарозном геле и обрабатывали эндону-клеазами рестрикции NcoI и HindIII. Затем ДНК очищали электрофорезом в 1%-м агарозном геле и лигировали с расщепленной теми же эндо-нуклеазами рестрикции плазмидой pET28a(+). После лигирования реакционной смесью трансформировали клетки E. coli DH5a и высевали их на чашки Петри с агаризованной средой, содержавшей канамицин (30 мкг/мл), и выдерживали 16 ч при 37 °С. Для каждой конструкции с чашки брали по три колонии, из которых выделяли плазмиды. Для контроля полученных конструкций проводили секвенирование плаз-мидной ДНК в Центре коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН).
Экспрессия мутантных PAMO в клетках E. coli
Для экспрессии ферментов проводили трансформацию плазмидной ДНК в штамм E. coli BL21(DE3). Колонии клеток штамма-продуцента помещали в 4 мл среды LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина, и культивировали в течение ночи при 37 °С и 180 об/мин. Клетки из ночной культуры пересевали в 200 мл свежей среды TB (дрожжевой экстракт 24 г/л; бактотриптон 24 г/л; глицерин 4 мл/л; 0,017 М KH2PO4; 0,072 М KH2PO4; pH 7,0) с аналогичной концентрацией канамицина до поглощения
А600 = 0,08-0,10. Клетки растили при 120 об/мин и 37 °С. По достижении поглощения А600 = 0,8 добавляли 200 мкМ ИПТГ. Экспрессию проводили в течение 24 или 7 ч при 120 об/мин и разной температуре (30 или 37 °С). Клетки осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин и 4 °С. Осадок ресуспендировали в охлажденном буфере, содержавшем 50 мМ Tris-HCl; 500 мМ NaCl и 20 мМ имидазол; pH 7,5.
Выделение и очистка
К суспензии клеток добавляли водный раствор FAD до конечной концентрации 10 мкМ. Разрушение клеток проводили ультразвуком в течение 4-5 циклов по 90 с во льду с перерывами на охлаждение. Далее раствор инкубировали при 55 ° С в течение 10 мин с последующим осаждением дебриса на центрифуге (40 мин, 10 000 об/мин, 4 °C). Бесклеточный экстракт наносили на колонку HisTrap HP объ -емом 1 мл, заполненную буферным раство -ром, содержавшим 50 мМ Tris-HCl, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол (pH 7,5), и смывали возрастающим линейным градиентом концен -трации имидазола от 20 до 500 мМ. Фракции, содержавшие целевой белок, переводили в 50 мМ натрий - фосфатный буферный раствор (pH 7,5) с помощью гель - фильтрации через Сефадекс G-25. За эффективностью очистки следили методом белкового электрофореза в денатурирующих условиях.
Определение каталитических параметров
Раствор РАМО перед измерением инкубировали при 55 °С в течение 10 мин. За протеканием реакции следили при 30 °С по расходу NADPH, измеряя уменьшение поглощения при 340 нм. Объем реакционной среды составлял 1 мл. Для измерений использовали 50 мМ натрий-фосфатный буфер (pH 7,5), содержавший 50 мкМ NADPH и 10 мМ бензилацетона. Для определения констант Михаэлиса концентрацию NADPH и бензилацетона варьировали в диапазоне 5-500 мкМ и 0,25-15 мМ соответ -ственно. Значения KM были рассчитаны по экспериментальным зависимостям скорости реакции от концентрации вартируемого субстрата методом нелинейной регрессии с помощью программы Origin Pro 8.5. Концентрацию активных центров фермента определяли спек -трофотометрически по поглощению FAD на 441 нм (е = 12,4 мМ-1см-1).
Рис. 1. Структура участка кофермент-связывающего домена активного центра РАМО и положение ряда аминокислотных остатков в области связывания фосфатной группы
Результаты и обсуждения
Моделирование аминокислотных замен
По результатам анализа литературы и детального изучения структуры активного центра фенилацетонмонооксигеназы на основе имеющихся в базе данных PDB структур фермента в комплексе с NADPH (PDBID 2YLR, PDBID 2YM2, PDBID 2YM1) были отобраны аминокислотные остатки Н220, Т218, Т194, К336, и R217 (рис. 1). Замены остатка Н220 уже описаны в литературе, а остаток R217 играет важную роль в катализе [21], поэтому его замена не является целесообразной. Аминокислотные остатки Т194 и S196 находятся на большем удалении от фосфатной группы NADPH. Поэтому в первую очередь было изучено влияние аминокислотных замен остатков Т218 и К336.
Моделирование показало, что в случае ами -нокислотного остатка треонина наибольшее воздействие на центр связывания кофермен-та должны оказывать замены T218D и Т218Е (рис. 2, А). Выбор этих аминокислотных замен обусловлен стерическими затруднениями, возникающими вблизи фосфатной группы рибозы NADPH, которые могут препятствовать связыванию фосфорилированной формы кофактора и облегчать связывание NADH.
Аналогично (исходя из предположения о возникающих стерических затруднениях при связывании NADPH) была выбрана аминокислотная замена K336R (рис. 2, Б). Вводимый остаток аргинина заряжен положительно, как и остаток лизина. Поскольку это может благоприятно влиять на связывание фосфатной группы кофермен-та, было интересно получить вариант фермента с коротким незаряженным хвостом. По этой логике был сделана замена K336A.
Для верификации правильности выбора ключевых аминокислотных остатков мы сравнили результаты нашего анализа с предсказанием, выполненным сервером CSR-Salad (Cofactor Specificity Reversal Sructural Analysis & Library Design, http://www.che.caltech.edu/ groups/fha/CSRSALAD/index.html) с использо -ванием структуры PAMO PDB2YLR. Показано, что ключевыми для проявления коферментной специфичности являются остатки R217, T218, H220 и K336. Этот же сервер предлагает возможные замены. В случае остатка H220 ника -ких замен предложено не было, хотя в работе [18] показано положительное влияние замен H220N и H220Q на катралитическую активность РАМО с NADH. Остаток R217 следует рассматривать отдельно, поскольку ранее проведенные эксперименты [20] показали, что этот остаток нельзя подвергать мутации, так как он является каноническим для монооксигеназ.
Рис. 2. Структуры фрагмента активного центра фенилацетонмонооксигеназы вблизи молекулы NADPH для фермента дикого типа (Т218, К336), а также модельные структуры для ферментов с аминокислотными заменами Т218Е и T218D (А), К336Я и К336А (Б)
Получение и изучение мутантных вариантов РАМО
Экспрессию полученных генетических конструкций осуществляли по стандартной методике. Оптимизация условий экспрессии фенил-ацетонмонооксигеназы проводилась нами ранее на этапе изучения влияния гистидиновой метки [13]. Наличие последовательности His-tag на Оконце всех исследуемых вариантов РАМО позволяет использовать для очистки метод металл-хелатной хроматографии. Чистоту полученных препаратов контролировали с помощью аналитического гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Как показано на рис. 3, все ферменты были получены практически в гомогенном виде. В табл. 2 представлены каталитические параметры полученных ферментов в сравнении с фер-
ментом дикого типа. Из данных табл. 2 видно, что введение выбранных аминокислотных замен приводит к небольшому ухудшению констант Михаэлиса по NADPH, что свидетельствует об ухудшении связывания этого кофермента. При изучении процесса конверсии бензилаце-тона мутантными формами РАМО в реакции с NADH детектируется уменьшение концентрации восстановленной формы кофермента, что указывает на появление способности связывать NADH. Тем не менее, аналогичная скорость расхода NADH детектируется при любой стартовой концентрации бензилацетона, а также без добавления бензилацетона в реакционную среду. Это означает, что процесс конверсии бензилацетона отсутствует. Этот эффект расходования кофермента «вхолостую» - достаточно
Рис. 3. Результаты очистки РАМО и его мутантных форм. 1 - РАМО, 2 - РАМО Т218Б, 3 - РАМО Т128Е, 4 - РАМО К336^ 5 - РАМО К336А, 6-8 - фракции РАМО Т218Б на разных этапах очистки (6 - через два часа после индукции, 7 - в конце культивирования до аффинной хроматографии, 8 - после аффинной хроматографии), М - маркер молекулярной массы
Т а б л и ц а 2
Каталитические характеристики мутантных вариантов PAMO
Фермент k с 1 кат,' v NADPH Л , Km ,мкМ ^NADPH/^NADH
PAMO 1,5 ± 0,3 3,2 ± 0,4 33 ± 3
PAMO T218D 0,8 ± 0,3 21 ± 2 25 ± 2
PAMO T218E 1,1 ± 0,3 10 ± 1 20 ± 2
PAMO K336R 0,6 ± 0,2 25 ± 2 28 ± 2
PAMO K336A 0,7 ± 0,3 19 ± 2 23 ± 2
распространенная проблема для монооксигеназ [21, 22].
Результаты наших экспериментов вместе с данными других авторов свидетельствуют, что кардинальное изменение коферментной специфичности РАМО с NADP+ к NAD+ не может быть достигнуто за счет единичных аминокислотных замен. Проблема скорее всего может быть решена с помощью нескольких одновременных замен. Перед этим необходимо проведение комплексного моделирования влияния нескольких замен на структуру активного центра, что и запланировано сделать далее.
Результаты, полученные в настоящей работе с РАМО, полностью согласуются с общей закономерностью: изменение коферментной специфичности фермента с NADP+ к NAD+ представляет собой намного более сложную проблему, чем обратная процедура. Ярким примером служит первая успешная работа по изменению коферментной специфичности глутатионредуктазы
(GTR) от NADPH к NADH [23]. Кофермент-свя-зывающий домен этого фермента имеет очень высокую гомологию с NAD-специфичной ди-гидролипоамиддегидрогеназой (DHLDH). Только благодаря такой гомологии авторам удалось идентифицировать ряд ключевых остатков, которые подвергли направленному мутагенезу: третий остаток аланина в канонической последовательности GxGxxG(A) - Ala179 был заменен на остаток Gly, остаток Arg198, взаимодействующий с 2'-фосфатом кофермента, заменили на остаток Met, а в остаток 197 ввели мутацию Val197Glu для создания водородных связей между боковой карбоксильной группой остатка Glu и ОН-группами рибозы. Однако заметного улучшения каталитических свойств не наблюдалось. В результате ввели дополнительно куски аминокислотной последовательности из активного центра DHLDH в кофермент-связывающий домен GTR. Только после таких комплексных (точечных и линейных) замен удалось получить
мутантный фермент, который был в 71,8 раза более специфичен к NADH, чем к NADPH, однако его каталитическая эффективность (ккат/КМ) с
мутантной GTR с NADH была более чем в 30 раз хуже по сравнению с таковой с NADPH для фермента дикого типа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Wichmann R., Wandrey C., Bückmann A.F., Kula M.R. // Biotechnol. Bioeng. 1982. Vol. XXIII. N 12. P. 2789-2802.
2. Van Der Donk W.A., Zhao H. // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. Vol. 14. N 4. P. 421-426.
3. Тишков В.И. // Вестн. Моск. Унив. Сер. 2. Химия. 2002. T. 43. № 6. C. 380-387.
4. Seelbach K., Riebel B., Hummel W., Kula M.R., Tishkov V.I., Egorov A.M., Wandrey C., Kragl U. // Tetrahedron Lett. 1996. Vol. 37. N 9. P. 1377-1380.
5. Rissom S., Schwarz-Linek U., Vogel M., Tishkov V.I., Kragl U. // Tetrahedron: Assymetry. 1997. Vol. 8. N 15. P. 2523-2526.
6. Tishkov V.I., Galkin A.G., Egorov A.M. // Materials of International Conference "Enzyme Engineering XII.", Deu Ville, France, 1993.
7. Tishkov V.I., Galkin A.G., Fedorchuk V. V., Savitsky P.A., Rojkova A.M., Gieren H., Kula M. // Biotechnol. Bioeng. 1999. Vol. 64. N 2. P. 187-193.
8. Serov A.E., Popova A.S., Fedorchuk V V, Tishkov VI. // Biochem. J. 2002. Vol. 367. P. 841-847.
9. Tishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. Eng. 2006. Vol. 23. N 2-3. P. 89-110.
10. Alekseeva A.A., Fedorchuk V V., Zarubina S.A., Sadyk-hov E.G., Matorin A.D., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae. 2015. Vol. 7. N 1. P. 60-69.
11. Pometun A.A., Parshin P.D., Galanicheva N.P., Uporov I.V., Atroshenko D.L., Savin S.S., Tishkov V.I. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2020. Vol. 75. N 4. P. 250-257.
12. Schwarz-Linek U., Krödel A., Ludwig F.-A., Schulze A., Rissom S., Kragl U., Tishkov V.I., Vogel M. // Synthesis (Stuttg). 2001. Vol. 33. N 6. P. 947-951.
13. Zeng Q.K., Du H.L., Wang J.F., Wei D.Q., Wang
X.N., Li Y.X., Lin Y. // Biotechnol. Lett. 2009. Vol. 31. N 7. P. 1025-1029.
14. Fraaije M.W., Wu J., Heuts D.P.H.M., Van Hellemond E.W., Spelberg J.H.L., Janssen D.B. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol. 66. N 4. P. 393400.
15. Völker A., Kirschner A., Bornscheuer U.T., Altenbuch-ner J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. Vol. 77. N 6. P. 1251-1260.
16. Kamerbeek N.M., Fraaije M.W., Janssen D.B. // Eur. J. Biochem. 2004. Vol. 271. N 11. P. 2107-2116.
17. Beier A., Bordewick S., Maika G., Schmidt S., Bergh T. van den, Peters C., Joosten H., Bornscheuer U.T. // ChemBioChem. 2016. Vol. 17. N 24. P. 2312-2315.
18. Dudek H.M., Torres Pazmino D.E., Rodriguez C., De Gonzalo G., Gotor V., Fraaije M.W. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. Vol. 88. N 5. P. 11351143.
19. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Greenblatt D.M., Meng E.C., Ferrin T.E. // J. Comput. Chem. 2004. Vol. 25. N 13. P. 1605-1612.
20. Parshin P.D., Pometun A.A., Martysuk U.A., Kley-menov S.Y., Atroshenko D.L., Pometun E. V., Savin S.S., Tishkov V.I. // Biochemistry (Mosc.). 2020. Vol. 85. N 5. P. 575-582.
21. Balke K., Beier A., Bornscheuer U.T. // Biotechnol. Adv. 2018. Vol. 36. P. 247-263.
22. Kokorin A., Parshin P.D., Bakkes P.J., Pometun A.A., Tishkov V.I., Urlacher V.B. // Sci. Reports 2021. Vol. 11. P. 21706.
23. Scrutton N.S., Berry A., Perham R.N. //Nature 1990. Vol. 34. P. 38-43.
Информация об авторах
Паршин Павел Дмитриевич - мл. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, parshin.p04@gmail.com;
Мартысюк Устина Александровна - студентка Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева, ustina-m@mail.ru;
Атрошенко Денис Леонидович - мл. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук, atrdenis@gmail.com;
Попинако Анна Владимировна - науч. сотр. группы молекулярного моделирования Института биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, канд. биол. наук, popinakoav@gmail.com;
Савин Святослав Сергеевич - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. биол. наук, savinslava@gmail.com;
Пометун Евгений Владимирович - доцент кафедры аналитической, физической и коллоидной химии Института фармации ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), канд. хим. наук, epometun@gmail.com;
Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, докт. хим. наук, профессор, vitishkov@gmail.com;
Пометун Анастасия Александровна - ст. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук, aapometun@gmail.com.
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Статья поступила в редакцию 16.03.2022; одобрена после рецензирования 18.03.2022; принята к публикации 14.04.2022.
