CC BY
4
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 577.151
ИНЖЕНЕРИЯ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ STAPHYLOCOCCUS AUREUS: ВВЕДЕНИЕ В СТРУКТУРУ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ПЕТЛИ И ОСТАТКОВ ГИСТИДИНА Татьяна Сергеевна Юрченко1, Анастасия Аркадьевна Логинова2, Егор Павлович Сергеев3, Евгений Владимирович Пометун4, Владимир Иванович Тишков5, Святослав Сергеевич Савин6, Анастасия Александровна Пометун7 1 3' 5 7 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет
1, 5, 7
' ' Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук 4 Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет Автор, ответственный за переписку: Анастасия Александровна Пометун, [email protected]; Владимир Иванович Тишков, [email protected]
Аннотация. NAD-зависимая формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2, FDH) из патогенных бактерий Staphylococcus aureus (SauFDH) значительно отличается от других FDH как по первичной структуре, так и по каталитическим свойствам. Отличительной особенностью SauFDH является самая высокая (примерно в 2,5-3 раза) удельная активность по сравнению с другими формиатдегидрогеназами. При этом SauFDH обладает высокими значениями констант Михаэлиса по обоим субстратам. На основании анализа трехмерных структур и выравнивания аминокислотных последовательностей были выбраны замены, перспективные с точки зрения изменения каталитических параметров. Замена I220H привела к увеличению KNAD ; значение kcat не изменилось. При замене Т250Н наблюдается увеличение KMNAD+, kcat снижается с 20 до 13 с \ Замена K368H привела к незначительному увеличению KM , kcat снизилась с 20 до 6 с . Введение дополнительных вставок TGA и AGA в а-спираль на С-конец фермента привело к увеличению KMNAD+
lyr hcoo- ^ „ , , 1ут nad+ м
и KM . Больший эффект наблюдался для KM - разница составила более
чем в 10 раз. Для мутантных SauFDH со вставками kcat значительно снижается до 4 с . Аналогичные результаты наблюдаются для мутантов с многоточечными заменами. Таким образом, было показано, что С-концевая последовательность играет важную роль в катализе SauFDH.
Ключевые слова: NAD-зависимая формиатдегидрогеназа, сайт-направленный мутагенез, Staphylococcus aureus, структура, С-конец, моделирование
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2023-64-2-163-177
Список сокращений: FDH - формиатдегидрогеназа, NaPB - натрий-фосфатный буфер.
Финансирование. Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 20-04-00915 и частично в рамках государственного задания.
Для цитирования: Юрченко Т.С., Логинова А.А, Пометун Е.В., Тишков
B.И., Савин С.С., Пометун А.А. Инженерия активного центра формиатдеги-дрогеназы из Staphylococcus aureus: введение в структуру дополнительной петли и остатков гистидина // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. Т. 64. № 2.
C. 163-177.
© Юрченко Т.С., Логинова А.А, Пометун Е.В., Тишков В.И., Савин С.С., Пометун А.А., 2023
ORIGINAL ARTICLE
ENGINEERING THE ACTIVE SITE OF FORMATE DEHYDROGENASE FROM STAPHYLOCOCCUS AUREUS: INTRODUCTION TO THE STRUCTURE OF THE ADDITIONAL LOOP AND HISTIDINE RESIDUES
Tatiana S. Iurchenko1, Anastasia A. Loginova2, Egor P. Sergeev3, Evgenii V. Pometun4, Vladimir I. Tishkov5, Svyatoslav S. Savin6, Anastasia A. Pometun7
1-3, 5-7 Department 0f Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation
1 5' 7 Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation
4 Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russian Federation
Abstract. NAD+-dependent formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2, FDH) from pathogenic bacterium Staphylococcus aureus (SauFDH) differs significantly from other FDHs both in terms of primary structure and catalytic properties. A distinctive feature of SauFDH is the highest (about 2.5-3 times) specific activity compared to other formate dehydrogenases. At the same time, SauFDH has high Michaelis constants for both substrates. Based on the analysis of three-dimensional structures and the alignment of amino acid sequences, substitutions promising in terms of changing catalytic parameters were selected. The replacement of I220H resulted in an increase in KMNAD+; the value of kcat has not changed. When Т250Н is replaced, an increase in KMNAD+ is observed, kcat decreases from 20 to 13 s-1. The replacement of K368H led to a slight increase in KMNAD+, kcat decreased from 20 s-1 to 6 s-1. The introduction of TGA and AGA additional inserts in a-helix at the C-terminus of the enzyme led to an increase in KMNAD and KMHCO° . A bigger effect was observed for KMNAD+ - the difference was more than 10 times. For mutant SauFDH with insertions kcat significantly reduced to 4 s-1. Similar results were observed for mutants with multipoint substitutions. Thus, the C-terminal sequence has been shown to play an important role in the catalysis of SauFDH.
Keywords: NAD+-dependent formate dehydrogenase, site-directed mutagenesis, Staphylococcus aureus, structure, C-terminus, modeling
Financial Support. The research was carried out with partial financial support of the Russian Foundation for Basic Research within the framework of scientific project No. 20-04-00915 and partially as a part of state research program.
For citation: Iurchenko T.S., Loginova A.A., Sergeev E.P., Pometun E.V., Tishkov V.I., Savin S.S., Pometun A.A. Engineering the Active Site of Formate Dehydrogenase from Staphylococcus aureus: Introduction to the Structure of the Additional Loop and Histidine Residues // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. T. 64. № 2. P. 163-177.
NAD(P)+-3aBHCHMaa формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2, FDH) катализирует реакцию окисления формиат-иона до углекислого газа с сопряженным восстановлением NAD(P)+ до NAD(P)H. FDH состоит из двух идентичных субъединиц, каждая из которых состоит из кофермент-связы-вающего (остатки с 147 по 333 для формиатде-гидрогеназы из Pseudomonas sp. 101 (PseFDH)) и каталитического (аминокислотные остатки
1-146 и 334-400) доменов. Каждая субъединица содержит активный центр, который располагается в глубине белковой глобулы.
Гены FDH обнаружены в бактериях, дрожжах, грибах и растениях (как высших, так и низших) [1-3]. Показано, что при неблагоприятных условиях содержание мРНК, кодирующей FDH, резко возрастает. Соответственно, данный фермент играет важную роль в метаболизме клеток.
В частности, это касается патогенных бактерий при образовании ими биопленок [4].
В настоящее время применение FDH в качестве катализатора регенерации никотинамид-ных кофакторов NAD(P)H в ферментативных системах стало традиционным [5-8]. Это объясняется тем, что FDH выгодно выделяется на фоне других ферментов с аналогичной функцией благодаря низкой стоимости субстрата (HCOO) и летучести реакционного продукта. Однако, согласно литературным данным, во всем мире по-прежнему ведется активный поиск новых перспективных с точки зрения биотехнологии FDH.
Объектом настоящего исследования стала формиатдегидрогеназа из патогенных бактерий Staphylococcus aureus (SauFDH). Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей FDH выявил низкий уровень гомологии представителей семейства стафилококковых по сравнению с другими бактериальными FDH при сохранении той же функции. SauFDH обладает самым высоким значением каталитической константы относительно всех описанных FDH из других источников и очень хорошей температурной стабильностью [9, 10]. Недостаток этого фермента - высокие значения констант Михаэлиса [9]. Для этого фермента были также успешно проведены эксперименты по кристаллизации [10]. В результате была получена экспериментальная структура двойного комплекса [SauFDH-NAD ] (PDB:6TTB).
Настоящая работа посвящена выяснению взаимосвязи структура - функция в SauFDH с помощью белковой инженерии. Методом сайт-направленного мутагенеза проведено исследование влияния на свойства фермента замены аминокислотного остатка I220, а также нескольких аминокислотных остатков, расположенных в районе С-конца фермента.
Экспериментальная часть
Моделирование структуры
Структурный анализ и моделирование мутантов проводили с помощью программы AlphaFold2
[11] на открытом онлайн-сервере для ColabFold
[12]. Для множественного выравнивания использовали MMseqs2, для каждой модели проводили по 3 цикла уточнения предсказания. Генерировали по 5 моделей, лучшую выбирали по значению pLDDT (тест предсказанной точности на локальном расстоянии, predicted local distance difference test). Для встраивания молекулы NAD+ с последующей оптимизацией пространственного расположения использовали Coot [13]. Для визуализации применяли PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.1.0, Schrödinger, LLC).
Сайт-направленный мутагенез
Сайт-направленный мутагенез проводили методом ПЦР на «ThermoCycler Т100» («Bio-Rad», Россия). В состав реакционной смеси (25 мкл) входило 2,5 мкл буфера 10*Pfu (20 мМ Трис-HCl (pH 8,8 при 25 °C), 10 мМ KCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4 и 0,1% Triton X-100), 2 мкл dNTP (по 2,5 мМ), 1 мкл ДНК-матрицы pET24a с геном SauFDH1 (10 нг/мкл), 2 мкл прямого и обратного праймеров (10 пмоль/мкл, «Синтол», Россия), 0,5 мкл ДНК-полимеразы Pfu (10 Ед/мкл, «Thermo Fisher Scientific», США) и 15 мкл деионизированной воды. ПЦР проводили в тонкостенных пробирках объемом 0,5 мл («Eppendorf», Германия). Реакционную пробирку инкубировали в течение 5 мин при 95 °С, затем 30 циклов по 30 с при 95 °С, 60 с при 60-62 °С и 2 мин при 72 °С. С помощью двух пар олигонуклеотидов (SauFor/T7rev и SauRev/ T7for) были получены два фрагмента гена с необходимыми мутациями. Используемые олиго-нуклеотиды приведены ниже.
T7_for 5
T7_rev 5
I220H_for: 5
I220H rev: 5
T250H for: 5
T250H_rev: 5
K368H_for: 5
K368H_rev: 5
TGA_K368H for: 5
TGA_K368H rev: 5
AGA_K368H for: 5
AGA K368H rev: 5
Используемые олигонуклеотиды
'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' '-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
'-CTATGATCCACATAATCAACAAGACCATAAATTGTC-3'
'-CTTGTTGATTATGTGGATCATAGTGTTGTAATGTTAC-3'
'-CATGCACCATTACATCCAGAAACTGATAACTTATTTG-3'
-CAGTTTCTGGATGTAATGGTGCATGAATTGTAATC-3'
'-GTCGTATTGCTAGTCATAGTTATACAGCTAAATAATAG-3'
-CTGTATAACTATGACTAGCAATACGACCACTTG-3'
-GTCGTATTGCTAGTACCGGCGCGCATAGTTATACAGCTAAATAATAG-3'
-CTGTATAACTATGCGCGCCGGTACTAGCAATACGACCAC-3'
-GTGGTCGTATTGCTAGTGCGGGCGCGCATAGTTATACAGCTAAATAATAG-3'
-CTGTATAACTATGCGCGCCCGCACTAGCAATACGACCAC-3'
Продукты ПЦР первых двух реакций очищали с применением набора для экстракции из геля («Thermo Fisher Scientific», США) и использовали в качестве ДНК-матрицы в третьей ПЦР с праймерами T7 for и T7 rev. Продукт третьей ПЦР и плазмидную ДНК обрабатывали эндону-клеазами рестрикции EcoRI и HindIII («Thermo Fisher Scientific», США). Фрагменты с целевыми мутациями очищали и клонировали в те же сайты исходной ДНК-матрицы. Клеточная линия E. coli DH5a трансформировалась продуктами лигирования. Наработанную плазмидную ДНК выделяли с помощью набора GeneJET Miniprep Kit («Thermo Fisher Scientific», США). Полученные генетические конструкции секвениро-вали с использованием генетического анализатора «Applied Biosystems 3100», который подтвердил, что все плазмиды имели только заданные мутации.
Экспрессия SauFDH дикого типа и мутантных форм
SauFDH экспрессировали в клетках E. coli BL21(DE3) CodonPlus/pLysS, как описано ранее [13]. Клетки трансформировали соответствующей плазмидой с использованием CaCl2, далее использовали тепловой шок и выращивали культуру в течение ночи при 37 °C на чашках Петри с твердой питательной средой 2YT (16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 1,2% агара, pH 7,2) с 30 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола. Индивидуальные колонии переносили в пробирки с 4 мл среды 2YT, содержащей канамицин и хлорамфени-кол той же концентрации. Клеточную культуру термостатировали при 30 °С и 180 об/мин до достижения оптической плотности при 600 нм А600 = 1,0-1,2 ОЕ. Затем клетки переносили в колбы объемом 250 мл с 25 мл среды 2YT (разбавление 1:1000) и культивировали при 37 °С и 120 об/мин до достижения оптической плотности А600 = 0,6-0,8 ОЕ. После этого суспензию клеток количественно переносили в колбы (1 л с 225 мл среды 2YT) и культивировали при 30 °С и 90 об/мин. Индукцию проводили раствором лактозы (10 мл, 300 г/л) при достижении значения оптической плотности А600 = 0,6-0,8 ОЕ; после чего клетки культивировали в течение ночи при 20 °С и 120 об/мин. Биомассу собирали на центрифуге «Eppendorf 5403» («Eppendorf», Германия) (30 мин, 6000 об/мин, +4 °С). Клетки ресуспендировали в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 8,0 (концентра-
ция 20%, мас./об.). Полученную суспензию хранили при -20 °С.
Очистка ферментов
Выделение и очистку ферментов осуществляли по стандартной методике, описанной в работе [10]. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком при +4 °С с последующей тепловой обработкой при 55 °С в течение 15 мин. Осадок отделяли центрифугированием, к супернатанту добавляли раствор сульфата аммония до насыщения 40% в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0 (раствор А). Полученный осадок центрифугировали, содержание сульфата аммония в супернатанте доводили до 90% твердым сульфатом аммония и выдерживали осадок при +4 °С в течение 4 ч. Осадок собирали и перерастворяли в 1,8 М (NH4)2SO4 в буфере А (раствор Б).
Нерастворившиеся белки были отделены центрифугированием, полученный раствор наносили на колонку 1x10 см с Phenyl-Sepharose Fast Flow («Pharmacia Biotech», Швеция), уравновешенную раствором А. Колонку промывали раствором А до исчезновения поглощения на 280 нм. SauFDH элюировали с использованием линейного градиента 1,8-0,0 M (NH4)2SO4 в 0,1 М натрий-фосфатном буферном растворе (pH 7,0) (общий объем градиента 150 мл). Собирали фракции по 5 мл, измеряли поглощение на 280 нм (А280) и ферментативную активность (А). Фракции с наибольшим отношением А /А 280 собирали, концентрировали и обессоливали гель-фильтрацией через колонку «Sephadex G-25 Fine» («Pharmacia Biotech», Швеция). Концентрирование осуществляли с помощью центрифужных концентраторов «Amicon Ultra-15» («Millipore», США). Степень очистки препаратов анализировали с помощью ПААГ-электрофореза (концентрация геля 12%) в денатурирующих условиях в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия. Препараты ферментов хранили при +4 °С в 0,1 М натрий-фосфатном буферном растворе (pH 7,0).
Кинетический анализ
Активность FDH определяли при 30 °C по увеличению поглощения продукта реакции NADH при 340 нм (е340 = 6220 М-1-см-1) с использованием спектрофотометра «Shimadzu UV 1800PC». Точные концентрации исходных растворов NAD+ определяли спектрофотометрически на длине волны 260 нм (е260 = 17 800 М-1-см-1). Для определения значений Vm и KM исследовали зависимость
скорости реакции от концентрации варьируемого субстрата в диапазоне 0,5-15 КМ. Диапазон концентраций NAD+ при постоянной насыщающей концентрации второго субстрата (>10 KM для NAD+ и >20 KM для формиата) составил:
0,15-5 мМ NAD+ для SauFDH I220H и K368H; 0,2-8,0 мМ для SauFDH T250H; 1,7-50,0 мМ для SauFDH TGA + K368H, AGA + K368H и I220H + T250H + TGA + + K368H;
2-75 мМ для SauFDH I220H + TGA + K368H или 0,05-2,50 М формиата натрия для SauFDH I220H, T250H, K368H и I220H + + TGA + K368H;
0,1-5,0 М для SauFDH TGA + K368H, AGA + + K368H и I220H + T250H + TGA + K368H). Каждое измерение проводили в трех повторах. Численные значения максимальной скорости и констант Михаэлиса получали, анализируя экспериментальные зависимости методом нелинейной регрессии (Origin Pro 8.5).
Определение концентрации активных центров и каталитической константы
Концентрацию ФДГ определяли методом Бредфорда по поглощению комплекса с кумасси бриллиантовый синий G-250 при 595 нм с помощью спектрофотометра «Shimadzu UV 1800PC» [15]. Использовали серию стандартов с концентрацией бычьего сывороточного альбумина (БСА) 0,001-0,020 мг/мл.
Определение констант скорости термоинактивации
Температурную стабильность SauFDH изучали по кинетике инактивации в 0,1 М натрий-фосфатном буферном растворе (pH 7,0) в широком диапазоне температур. Для фермента дикого типа он составил 60-64 °С. Для ферментов SauFDH I220H, K368H, TGA + K368H и AGA + K368H температурный диапазон составил 62-70 oC, для ферментов T250H, I220H + TGA + K368H и I220H + T250H + TGA + K368H - 60-68 oC. Через фиксированные промежутки времени пробирку переносили из бани в контейнер со льдом на 1 мин. Затем раствор центрифугировали в течение 1 мин при 12 000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5430». Остаточную активность FDH измеряли, как описано ранее. Константу скорости термической инактивации рассчитывали по наклону линейной зависимости ln (A/ A0) от времени (полулогарифмические координаты ln (A/A0) - t) в программе Origin Pro
8.5. Для каждого эксперимента готовили серию пробирок Eppendorf (0,5 мл) с 70 мкл раствора фермента (0,2 мг/мл). Пробирки инкубировали в водном термостате (точность термостатирова-ния ±0,1 oC). Через фиксированные интервалы времени отбирали одну пробирку и помещали ее в лед на 1 мин. Затем раствор центрифугировали 1 мин при 12 000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5430» и измеряли остаточную активность. Значение константы скорости термоинактивации kin рассчитывали как тангенс угла наклона прямой на графике зависимости натурального логарифма величины остаточной активности от времени в полулогарифмических координатах (ln (A/A0) - t)) методом линейной регрессии (OriginPro 8.5).
Результаты экспериментов
Выбор аминокислотных остатков для мутагенеза
Анализ полученной ранее структуры (PDB:6TTB) показал, что SauFDH состоит из двух идентичных субъединиц, одна из которых имеет закрытую конформацию активного центра, в котором находится кофермент NAD+ (холо-форма). Вторая субъединица соответствует апо-форме фермента, поскольку активный центр находится в открытой конформации и не содержит кофермент. Трехмерные структуры субъедниц SauFDH в апо- и холо-конформациях очень близки к соответствующим формам формиатдегидро-геназы из Pseudomonas sp. 101 (PseFDH, структуры PDB:2NAC и PDB:2NAD соответственно). Среднеквадратичные отклонения RMSD между структурам PDB:6TTB (открытая) - PDB:2NAC и PDB:6TTB (закрытая) - PDB:2NAD составляют 1,530 и 1,170 Ä соответственно. Сравнение показало, что в холо-форме структуры более близкие, чем в случае апо-конформа-ции. Это достаточно убедительно указывает на то, что структуры активных центров SauFDH и PseFDH должны быть очень близки. Этот факт позволяет проводить сравнение структур известных формиатдегидрогеназ для выявления общих закономерностей связи структура - функция и использовать данные сравнения структур для экспериментов по белковой инженерии методом рационального дизайна.
Большинство формиатдегидрогеназ имеет подвижный С-конец, который не виден в структуре, определенной методом рентгеноструктур-ного анализа. В случае SauFDH в структуре не
Рис. 1. Модельная структура SauFDH, построенная с использованием открытого онлайн сервера AlphaFold2 - ColabFold
разрешен С-концевой участок из 10 аминокислотных остатков RIASKSYTAK, хотя, согласно данным MALDI/TOF/TOF-спектрометрии, этот фрагмент в белке присутствует. В аминокислотной последовательности PseFDH 400 аминокислотных остатков и в структуре холо-фор-мы PDB:2AND не разрешены только последние семь. С учетом того, что аминокислотная последовательность SauFDH на С-конце по сравнению с PseFDH короче на 20 остатков, то по сравнению с бактериальным ферментом данные по структуре для SauFDH на 23 остатка меньше. Так как С-концевой участок FDH играет важную роль в связывании субстратов, данные о возможной структуре SauFDH в этой области очень полезны для исследования и инженерии этого фермента. Поэтому для анализа возможных вариантов пространственного положения С-концевого пептида RIASKSYTAK в глобуле фермента из патогена, нами была построена модельная структура SauFDH, содержащая полную последовательность С-конца (рис. 1). На рисунке хорошо видно, что программа добавила небольшую а-спираль на С-конце. Сравнение модельной и экспериментальной структур SauFDH показало высокую точность построенной модели - среднеквадратичное отклонение между ними составило 0,849 А. Более того, добавление пептида на С-конец привело к тому, что величина RMSD при сравнении структур SauFDH AlphaFold2: PDB:2NAD уменьшилась до 0,510 А. Таким образом, можно предположить, что результаты предсказаний для белко-
вой инженерии на основе модельной структуры SauFDH имеют высокие достоверность и надежность.
Для выбора аминокислотных замен нами было проведено детальное сравнение трехмерных структур SauFDH (PDB:6TTB и модельная структура) и PseFDH (PDB:2NAC и PDB:2NAD). Результаты сравнения приведены на рис. 2 и в табл. 1. На рис. 2, А показан фрагмент структуры активного центра PseFDH (PDB:2NAD) с изображенными каталитически значимыми остатками His в положениях 223, 259 и 379. Остаток His259 PseFDH образует водородную связь с молекулой NAD+. В структурно-эквивалентном положении в SauFDH находится остаток треонина (Thr250) (рис. 2, Б, В и табл. 1), ОН-группа которого располагается на расстоянии 4А от адениновой части NAD+ и, вероятно, не образует с ним водородной связи. Для понимания, влияет ли это положение на связывание ко -фермента и субстрата, было предложено сделать замену T250H в SauFDH.
Анализ структуры холо-формы PseFDH (PDB:2NAD) свидетельствует, что остаток His379, расположенный на С-конце белковой глобулы, и остаток His223 могут взаимодействовать друг с другом по принципу стэкинг-взаимо-действия (рис. 2, А) [16]. В SauFDH в структурно-эквивалентных положениях находятся остатки Ile220 (рис. 2, В) и Lys368, которые не взаимодействуют друг с другом. Для образования стекинг-взаимодействия было решено сделать замены I220H и K368H.
Рис. 2. (А) - активный центр PseFDH (PDB: 2NAD); (Б) - фрагмент модельной структуры SauFDH в области C-концевой последовательности; (В) - фрагмент экспериментальной структуры SauFDH (PDB: 6TTB), RMSD 0,849 Â; (Г) - пространственное наложение смоделированных при помощи AlphaFold2 структур фермента дикого
типа и мутантной SauFDH TGA + K368H, RMSD 0,422 Â
Остатки Ser380 и Tyr381 в PseFDH образуют водородные связи с NAD+ напрямую и через молекулу воды соответственно. В структурно-эквивалентных положениях в SauFDH находятся Ser369 и Thr370 (рис. 2, А, Б). Поэтому в данных положениях было решено замены не делать.
Для выяснения роли C-концевой последовательности SauFDH в катализе нами было проведено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей этого фермента из штаммов Staphylococcus (рис. 3). Кроме того, в
выравнивание добавлены две последовательности из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 и Moraxella sp. C2 (для них определены структуры апо- и холо-форм, элементы вторичной структуры указаны для PseFDH), а также формиатдегидрогеназ из ряда других патогенов (см. подпись к рис. 3). Из рис. 3 следует, что на С-конце в последовательности SauFDH и других FDH из стафилококков имеется делеция из трех аминокислотных остатков. В PseFDH остатки в этом положении являются частью спирали а9,
CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment
PseEDH -----MAKVLCVLYDDPVDGYPKTYARDDLPKIDHYPGGQTLPTPK-AIDFTPGQLLGSVSGELGLRKYLESNGHTLVVTSDKDGPDSVFERELVDADVVIS
MorFDH -----MAKWCVLYDDPINGYPTSYARDDLPRIDKYPDGQTLPTPK-AIDFTPGALLGSVSGELGLRKYLESQGHELWTSSKDGPDSELEKHLHDAEVIIS
GmaFDH -----MAKVLCVLYDDPTSGYPPLYAKNAIPKIERYPDGQTVPNPK-HIDFVPGELLGCVSGELGLRS YLEDLGHTFIVTSDKEGPNSVFEKELPDADIVIS
BstFDH -----MATVLCVLYPDPVDGYPPHYVRDTIPVITRYADGQTAPTPAGPPGFRPGELVGSVSGALGLRGYLEAHGHTLIVTSDKDGPDSEFERRLPDADWIS
BpeFDH -----MAKILCVLYDDPVGGMPATYARDSLPAIARYPGGATLPTPL-ALDFTPGHLLGCVSGELGLRPFLQARGHTLWTADKDGPGSVFERELPDADWIS
LegFDH MFNQSQQKIVCVLYDDPKGGFPPNYARESIPELKQYPDGQSLPAPD-SIDFIPGEMLGSVSGELGLRQFLESNGHQLWTSDKDGSDSVFARELKEATWIS
ШВдВЗ -------MKIVALFPEAVEG-------------------------------QENQLL-NTKKALGLKTFLEERGHEFIILADN---GEDLDKHLPDMDVIIS
SluFDH -------MKIVALFPETEQG-------------------------------LDNQLL-NTTKAIGLPDFLEHTEHELVILKNG---ETDLDQHLSDADIIIS
SsiFDH -------MKIVALFPEATKG------------------------------QTENNVL-DDYTALNLRPFLEERGHELWLKDG---EDDLDQHLKDMDWIS
ScaFDH -------MKIVALFPKATEG------------------------------ETENNIL-DDQTALNLRPFLEEKGHELWLKNG---EEDLDKHLKDMDWIS
SsaFDH -------MKIVGLFPSDPNA------------------------------E SENQLL-NDKYALGI KS FLDNKKHE FVWNS----DEEIEEHIEDMDWIS
SeqFDH -------MKIVGLFPSDPSG------------------------------KSENQLL-NDRYALGIESFLEDKDHEFWINS----DEEVDQHLEDMEVIIS
PseFDH QPFWPAYLTPERIAKAKNLKlJUjTAGIGSDHVDLQSAIDRNVTVAEVTYCNSISVAEHVVtMILSLVRNYLPSHEWARKGGWNIADCVSHAYDLEAMHVGTV
MorFDH QPFWPAYLTAERIAKAPKLKLALTAGIGSDHVDLQAAIDNNITVAEVTYCNSNSVAEHVVMMVLGLVRNYIPSHDWARNGGWNIADCVARSYDVEGMHVGTV
GmaFDH QPFWPAYLTAERIAKAKKLKIJ^TAGIGSDHVDLNAAIKAGITVAEETFSNGICVAEHAVMMILALVRNYLPSHKIAEEGGWNIADCVSRSYDLEGMHVGTV
В s tFDH QPFWPAYLTAERIARAPKLRLALTAGIGSDHVDLDAAARAHITVAEVTGSNSISVAEHWMTTLALVRNYLPSHAIAQQGGWNIADCVSRS YDVEGMHFGTV
BpeFDH QPFWPAYLTAARIAKAPRbKIAITAGIGSDHVDLQAAAQHGLTVAEVTYSNSISVSEHVVMMVIJ^VRNYLPSYQCVLDGGWNIADCVARSYDLEGMQVG—
LegFDH Q PFWPAYLTRDRIESAPKLKIAITAGIGSDHVDLQAAME HNITVCEVT YCNSISVAEHTVMMILALVRDFIPQYNTVIDGGWNI ADCVSRS YDLEG^QVGCV APFYPAYMTKERIEKAPNLKLAITAGVGSDHVDLAAASEHNIGVVEVTGSNTVSVAEHAVMDLLILLRNYEEGHRQSVEGEWNLSQVGNHAHELQHKTIGIF
SluFDH APFYPAYLTRKRIEQAPKLKLAITAGVGSDHVDLEAASEHDVAWEVTGSNTVSVAEHAVMDLLIILRNYMEGHRQAVEGEWNLSKVGNQARELQHKTIGIF
SsiFDH APFYPAYMTKERIEQAPNLKLAITAGVGSDHVDLEAASEHDISVVEVTDSNTVSVAEHIVMTTLILVRNYEEGHRQSEEGGWNLTQVTNHAFELQNKTIGIF
ScaFDH APFYPAYMTAERIEKAPNLKIAITAGVGSDHVDLEAASKHDISVVEVTDSNTVSVAEHIVMTTLILVRNYEEGHHQSEDGTWNLTKVTNHAFELQNKTIGIF
SsaFDH SPFLPAYINKERINKAENLKLAITAGVGSDHVDLEAASE1TCLTVIEVTGCNTVSVAEHTVMDLLXLMRNFMEGHRQSYDGEWHLSKVGEHAHDIQHKKIGIF
SeqFDH SPFLPAYM)ENRIRKASQLKIAITAGVGSDHIDMAASQOT)LTVbEVTGCNTISVAEHTVMDVLILLRNF№GHRQSYNGEWNLSKVGNHAHDLQHKKIGIF
** ***•
*■** **
PseFDH MorFDH GmaFDH BstFDH BpeFDH LegFDH
ЕНВЗВП
SluFDH SsiFDH ScaFDH SsaFDH SeqFDH
aagrxglavlrrlapfdvhlhytdr aagrxglrvlrllapfdmhlhytdr
aagriglavlrrlkpfdvklhyt;
tar
gagrxglavlrrlkpfglhlhytqr -agrigsavlrrlkpfdvglhytd« aagri glavlrrlkpfavklh ytd: gfgrigqlvaerlapfnvtlqhydp gfgrigqlvaerlkpfnvniqhydp glgrigrlvgerlkpfnvdiih yrr glgrigrlvgerlkpfdvniqhyrr gygqigelvaqrlqpfdvqvqhfrr gygqigelvaerlqpfdvkvqhyrr j
RLPESVEKELNLTWHATREDMYPVCDWTLNCPL RLPEAVEKELNLTWHATREDMYGACDWTLNCPL RSPRAIEDELGLTYHATAEEMAEVCDVISIHAPL RLDAAIEQELGLTYHADPASLAAAVDIVNLQIPL RLPAATEQELGARYHPDAAALAGACDVISLHCPL iPLHLEQELNLTYHPSVESMVKVCDWSIHCPL QQDHKLSKFVSFDELVSTSDAITIHAPL
QKDSELSHFVEFEELVRTSDAITIHAPI
S-----QEDTDFSKYVNFDELVHKSDVLIITTPL
S-----QEDTDFSKYVDFDQLVETSDVLIITSPL
S-----QEDTAYSKYVNFDELVSTSDALVILSPL
S-----QENTPYSKYVDFDELVSTSDVIVILSPL
* • **
iqjrll |r rl]
1:
PETEHMINDETLKLFKRGAYIVNTARGKLCDRDAVARALES PETEHMINDETLKLFKRGAYLVNTARGKLCDRDAIVRALES 4PATEHLFNAKVLNKMRHGS YLVNTARAEICDRDDIVRALE S PS TEHLFDAAMIARMKRGAYL INT ARAKLVDRD AWRAVT S :iPGTEHLFDAAMLARMKRGAYLINTARGKICDRDAWQALAS iPETEYLFDDRLlKQMKRGSYLINTARGKICDQRAVADALES -PETDNLFD KD VLSRMKKHSYLVNTARGKIVNRDALVEALAS PSTDTLFDADVLSQMKTGSYLVNTARGKIVDTDALVAAVNS jPETDDLFDYNTlSQMKDGSYIVNCARGKIVNKEEWKMIEE JPETDNLFDYDTISRMKDGSYIVNCARGKIVNKDEIVQMVKE 3TDDLFNYDVLSRMKQGSYLVNTARGKIVNKEDLVELVNA
SETDDLFNYDVLSRMKEGSYLVNTARGKIVNKDDLIELVNN - *■ ■* ** •
PseFDH MorFDH GmaFDH BstFDH BpeFDH LegFDH
SluFDH SsiFDH ScaFDH SsaFDH SeqFDH
aG
. . .<->.<-
ßG
a8
3/10-9A ß9 ßlO a9 ->... .<-><->..<—X->
griagyagdvwfpqpapkdhpwrtmpyngmtphisgttltaqaryaagtreilecffegrpirdeylivqggalagtgagsyskgnatggseeaakfkkav-grlagyagdvwfpqpapndhpwrtmphngmtphisgtslsaqtryaagtreilecyfegrpirdeylivqggglagvga?syskgnatggseeaakyeklda
gqlagyagdvwfpqpapanhpwrnmphngmtphmsgsslsgqaryaagtreilecwfenrpirdeylivsngklagtga9sygvgeapkgk-----------
ghiagyggdvwfpqpapadhpwrampfngmtphisgtslsaqaryaagtleilqcwfdgrpirneylivdggtlagtga|syrlt-----------------
gqlagyagdvwfpqpaprdhpwrsmphhgmtphisgsslpaqaryaagtreilecwldgrairteylivdqgrlagaga ghlagyagdvwfpqppaknhpwrsmpnhamtphtsgttlsaqaryaagvreilecwlgnkpireeylivsqgrlagvgs
.ytpgdttagsenaarfhp---
Isysagntttgteqavelv----
3/10a <->
ehlqgyagdvwypqpapadhpwrtmprnamtvhysgmtleaqkriedgvkdilerffnhepfqdkdiivasgrias---
ghiqgcagdvwypqpapathpwrtmprngmtihysgmtlesqqriedgvkdiltrffnnepfqkkdiivdsgrias—
nhlqgyggdvwypqpapsdhpwrtmprnamtihysgmvieaqlriekgvkdllthffdetpfpkedvivnggqits---
nhiqgyggdvwypqpapadhpwrkmprnamtihysgmviealyrieegvknlltdffeekpfpekdvivnggqits-
khiqgyagdvwypqpapqdhpwrtmprnamtihysgmtleaqkriengvkniltnffndkdfdekdvivsggdikn---
nhiqgyagdvwypqpapqdhpwrtmprnamtihysgmtleaqkriekgvkgfltnffneeaydekdvivsggtitn—
SsYTAK------
IsYTAK------
4SYAKHDDSNN-
jsYAKNDKK---
SYKSK------
SYKSK------
****•***
**** **
** * **
• *
Рис. 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей формиатдегидрогеназ из разных источников, где PseFDH - Pseudomonas sp. 101 (P33160), MorFDH - Moraxella sp. C2 (008375), GmaFDH - Granulicella mallensis (G8NVB5), BstFDH - Burkholderia stabilis (B5A8W5), BpeFDH - Bordetella pertussis (A0A171JVB9), LegFDH - Legionella pneumophila (A0A3A6W2S5), SauFDH - Staphylococcus aureus (A0A266CVV8), SluFDH - Staphylococcus lugdunensis HKU09-01 (ADC88276), SsiFDH - Staphylococcus simulans (A0A418J355), ScaFDH - Staphylococcus carnosus subsp. carnosus TM300 (CAL28380), SsaFDH - Staphylococcus saprophyticus (A0A4Y9KMF1), SeqFDH - Staphylococcus equorum (A0A7T9NCC7). Отдельно выделены положения, в которых в SauFDH были проведены замены на остаток His. В последней строке выравнивания указаны структурные элементы для PseFDH и SauFDH
Т а б л и ц а 2
Каталитические свойства* и активационные параметры процесса термоинактивации SauFDH
дикого типа и мутантных форм фермента
Т а б л и ц а 1
Взаимодействия, ответственные за связывание кофермента и формирование оптимальной конформации
активного центра
Эквивалентные остатки PseFDH (PDB:2NAD) SauFDH (PDB:6TTB) Тип взаимодействия
H223 H379 I220 - стэкинг
H259 NAD+ T250 - водородная связь
F355иI361 - F347, F353 - гидрофобное
E364 R201/Q34 K356 R198/N143 электро статиче ское
H379 H2O K368 - водородная связь
S380 NAD+ S369 - водородная связь
Y381 H2O Y370 - водородная связь
Фермент kcat' с-1 v NAD+ Л , K , мкМ м " K HC00-, мМ AH кДж/моль AS Дж/(мольК)
PseFDH [1] 7,3 65 6,5 540±20 1320±40
wt-SauFDH [8] 20 220±7 130±10 430±20 1010±60
SauFDH I220H 21 330±20 150±10 450±20 1040±50
SauFDH T250H 13 540±50 100±10 590±30 1450±100
SauFDH K368H 6 280±20 105±10 650±50 1630±150
SauFDH TGA + K368H 4 3360±200 420±50 580±30 1415±100
SauFDH AGA + K368H 4 3300±300 230±20 580±20 1410±100
SauFDH I220H + TGA + K368H 4 4980±600 185±20 580±20 1410±80
SauFDH I220H + T250H + TGA + K368H 4 3350±200 300±50 560±20 1420±90
*Представленные значения являются средним из трех независимых экспериментов.
непосредственно контактирующей с молекулой NAD+. Вставка трех аминокислотных остатков и замена K368H в SauFDH должна позволить образовать а-спираль на данном участке структуры. Это позволит сформировать активный центр фермента, более похожий на активные центры других FDH. Согласно выравниванию аминокислотных последовательностей, в этой области с наибольшей частотой встречается последовательность из остатков TGA, с несколько меньшей частотой - из остатков AGA. Поэтому было предложено ввести именно эти три аминокислоты для образования дополнительного витка а-спирали. На рис. 2, Г представлен результат на-
ложения структуры мутантной формы со вставкой, смоделированной с помощью А1рИаБоЫ2 на модельную структуру БОН дикого типа. Как показано на рис. 2, Г, введение трех дополнительных аминокислотных остатков ТОА + замена К368Н приводит к незначительному смещению отдельных остатков (1220, Н368, 8369 и У381). Однако можно предположить, что остаток Ьу8368 в модельной структуре фермента дикого типа находится в неструктурированной области, из-за чего эта область может иметь большую подвижность. Предположительно, создание более протяженной а-спирали может привести к стабилизации в пространстве этого фрагмента структуры.
Таким образом, на основании результатов по моделированию структуры SauFDH с полноразмерным С-концом и сравнительного анализа этой структуры со структурой холо-формы PseFDH было предложено сделать точечные замены I220H, T250H, K368H, получить тройной мутант SauFDH с заменами I220H + TGA + K368H, а также получить ферменты с различными ком -бинациями заменТСА + K368H, AGA + K368H, I220H + TGA + K368H, I220H + T250H + TGA + + K368H.
Получение мутантных SauFDH
SauFDH дикого типа и мутанты экспрессирова-ли в клетках E. coli BL21(DE3) CodonPlus/pLysS с выходом 400-500 мг целевого белка на 1 л культуры. Чистота препаратов фермента дикого типа и мутантных SauFDH составила не менее 95%.
Кинетические свойства мутантных SauFDH
Кинетические параметры новых мутантных SauFDH и фермента дикого типа представлены в табл. 2. Введение замены I220H приводило к
^ nad+ л/г ^ hcoo-
увеличению KM с 220 до 330 мкМ, KM с 130 до 150 мМ; значение kcat не изменилось по сравнению со значением для SauFDH дикого типа. При замене Т250Н наблюдается увеличе-
„ nad+ с л л д ^ „ hcoo-
ние KM до 540 мкМ и снижение KM до 100 мМ; kcat снизился с 20 до 13 с-1. Эти результаты можно объяснить тем, что введение более объемных остатков гистидина может привести к нарушению конформации активного центра. Замена K368H привела к незначительному уве-
„ nad+ л/г туг hcoo-
личению KM до 280 мкМ и снижению KM до 105 мМ, kcat снизилась до 6 с-1. Введение трех дополнительных аминокислот приводит к резкому увеличению Km^ad+ (примерно до 3300 мкМ для вставок TGA и AGA), вставка TGA приводит к увеличению kmIc°° до 480 мМ, а более гибкая вставка AGA практически не меняет этот параметр. Для обеих мутантных форм kcat уменьшилась до 4 с-1. Аналогичные результаты наблюдались для мутантных форм с заменами I220H + TGA + K368H и I220H + T250H + TGA + + K368H. Таким образом, введение вставок на С-конце фермента приводит к увеличению констант Михаэлиса как по коферменту, так и по субстрату, а также к снижению каталитической константы SauFDH.
Температурная стабильность
На рис. 4, А представлены зависимости остаточной активности от времени для новых и ранее
полученных мутантных SauFDH. Зависимости линейны в полулогарифмических координатах, ln (A/A0) - t, т.е. инактивация мутантных SauFDH, как и фермента дикого типа, соответствует кинетике реакций первого порядка. Константы скорости термоинактивации kin во всех случаях не зависели от концентрации фермента [17]. Это доказывает мономолекулярный механизм инактивации полученных мутантных ферментов. Исследование температурной стабильности проводили в широком диапазоне температур. Замена K368H приводит к стабилизации фермента при 60-64 оС. Вероятно, происходит образование новой связи. Введение вставок TGA и AGA вместе с заменой К368Н привело к незначительному изменению температурной стабильности. Замены I220H, T250H приводят к снижению температурной стабильности примерно в 1,5-2 раза. Возможным объяснением этого может быть нарушение системы водородных связей и электростатических взаимодействий в белковой глобуле в области расположения этих остатков. Процесс инактивации может быть описан с помощью теории активированного комплекса; поэтому для расчета активационных параметров процесса термоинактивации всех изученных ферментов использовали основное уравнение этой теории в линейной форме:
Ln (kin/T) = ln (kB/h) + (AS Ф/Я) - (AH+/RT) =
= const - (AH */R)(1/T),
где const = ln (kB/h) + (AS*/R)h - постоянная
b ^ ^
Планка, kB - константа Больцмана, AH и AS -энтальпия и энтропия активации соответственно, R - универсальная газовая постоянная.
Зависимость константы скорости инактивации от температуры в координатах ln (kin/7) - 1/Г представляет собой прямую линию с наклоном, равным AH*/R. На рис. 4, Б представлены температурные зависимости наблюдаемой константы скорости термоинактивации для всех полученных мутантных форм и фермента дикого типа в координатах ln (kin/T) - 1/Г. С применением теории активированного комплекса были рассчитаны значения энтальпии (AH и энтропии (AS активации, представленные в табл. 2.
Высокие значения активационных параметров могут свидетельствовать о том, что процессы термоинактивации фермента обусловлены разворачиванием белковой глобулы. Особо следует отметить, что по сравнению с ферментом дикого типа мутантные SauFDH имеют гораздо более высокие значениия AHф. Это означает, что у мутантных ферментов константа скорости
Рис. 4. А - зависимость остаточной активности от времени инкубации в полулогарифмических координатах для SauFDH дикого типа и ее мутантных форм при 64 оС, 0,1 М МаРБ, 0,01 М №ЭДГА, рН 7,0; Б - зависимости констант скорости термоинактивации для SauFDH дикого типа и ее мутантных форм от температуры в координатах [1п (к. /Т)] - 1/Т для фермента дикого типа и мутанта
термоинактивации при снижении температуры уменьшается гораздо больше, чем у фермента дикого типа. На основании полученных параметров активации были расчитаны значения констант скорости термоинактивации в интервале температур от 4 до 80 °С, их сравнили с показателями для ферментов дикого типа (табл. 3). Из данных таблицы следует, что при комнатной температуре мутантные SauFDH превосходят по термостабильности фермент дикого типа на несколько порядков. Наиболее заметный эффект стабилизации при низких значениях температуры
наблюдается для SauFDH K368H, TGA + K368H и AGA + K368H. На основании результатов компьютерного моделирования можно предположить, что это связано с формированием более компактной конформации активного центра в области С-концевой последовательности после введения замены.
Обсуждение результатов
Поскольку введение трех дополнительных аминокислотных остатков не привело к существенному изменению температурной ста-
Таблица 3
Эффект стабилизации мутантных форм по сравнению с ферментом дикого типа*
т, °с Эффект стабилизации для мутантных ВаиРЭН
1220Н Т250Н К368Н ТСА+К368Н АСА+К368Н 1220Н+ТСА+К368Н 1220Н+Т250Н+ТСА+К368Н
4 1.50Е+03 2.30Е+07 1.37Е+10 4.41Е+07 2.76Е+07 8.96Е+06 2.83Е+06
20 1.41Е+02 8.82Е+04 1ЛЗЕ+07 2.02Е+05 1.32Е+05 4.30Е+04 1.94Е+04
25 7Л1Е+01 1.75Е+04 1.43Е+06 4.22Е+04 2.78Е+04 9Л1Е+03 4.56Е+03
30 3.66Е+01 3.68Е+03 1.95Е+05 9.29Е+03 6.20Е+03 2.03Е+03 1ЛЗЕ+03
35 1.92Е+01 8Л0Е+02 2.83Е+04 2Л5Е+03 1.45Е+03 4.76Е+02 2.90Е+02
40 1.03Е+01 1.88Е+02 4.37Е+03 5.21Е+02 3.55Е+02 1Л7Е+02 7.83Е+01
50 ЗЛ5Е+00 1Л5Е+01 1.24Е+02 3.49Е+01 2.42Е+01 8.01Е+00 6.42Е+00
60 1.03Е+00 8.35Е-01 4.35Е+00 2.75Е+00 1.95Е+00 6.45Е-01 6Л2Е-01
61 9.28Е-01 6,48Е-01 ЗЛ5Е+00 2Л5Е+00 1.52Е+00 5,05Е-01 4,88Е-01
62 8,34Е-01 5,03Е-01 2Д0Е+00 1,68Е+00 1,20Е+00 3,97Е-01 3,89Е-01
63 7,49Е-01 3,92Е-01 1,66Е+00 1,32Е+00 9,40Е-01 ЗД2Е-01 ЗД1Е-01
64 6,74Е-01 3,05Е-01 1,67Е+00 1,04Е+00 7,40Е-01 2,45Е-01 2,49Е-01
65 6,07Е-01 2,38Е-01 8,78Е-01 8Д6Е-01 5,83Е-01 1,94Е-01 1,99Е-01
66 5,46Е-01 1,86Е-01 7,93Е-01 6,43Е-01 4,60Е-01 1,53Е-01 1,60Е-01
68 4,44Е-01 1Д4Е-01 3,28Е-01 4,01Е-01 2,88Е-01 9,56Е-02 1,03Е-01
70 3,62Е-01 7.06Е-02 1,86Е-01 2,51Е-01 1,81Е-01 6.02Е-02 6.70Е-02
75 2Л9Е-01 2Л6Е-02 4Л1Е-02 8.00Е-02 5.81Е-02 1.93Е-02 2.32Е-02
80 1.34Е-01 6.86Е-03 9.47Е-03 2.63Е-02 1.92Е-02 6.42Е-03 8.30Е-03
* Эффект стабилизации рассчитывался как отношение констант скорости инактивации БаиРОН дикого типа к константе скорости инактивации мутантного фермента при данной температуре, к^/к{™и\ Полужирным шрифтом выделены величины эффектов стабилизации, рассчитанные из экспериментальных данных.
Н Н
СТ\ <3\ 4- 4-
¡о" ю" К> К»
Рис. 5 (А) Структура С-концевой области PseFDH; (Б) два больших по объему остатка фенилаланина в С-концевой области SauFDH; (В) - Структура С-концевой
области SauFDH
бильности в области температур 60-70 оС, сопровождающееся критическим ухудшением каталитических свойств, было выдвинуто предположение, что введение дополнительного витка а-спирали приводит к закрытию входа в активный центр. Иными словами, изменение носит локальный характер и не затрагивает белковую глобулу в целом. Дальнейший анализ С-концевой последовательности и сопоставление структур PseFDH и SauFDH позволили выявить ряд отличий в непосредственной близости к каталитически значимым С-концевым остаткам, описанным ранее. В табл. 1 представлены структурно-эквивалентные положения с типом
их взаимодействия. В структуре SauFDH обнаружено присутствие двух больших по объему остатков F347 на конце спирали а-8 и F353 в неструктурированной области (рис. 5, Б). Примечательно, что в структурно-эквивалентных положениях PseFDH (табл. 1 и рис. 5, А) имеется меньший по объему остаток 1361. Предположительно, наличие двух объемных остатков фенил-аланина может приводить к увеличению объема активного центра. Этим можно также объяснить подобную инертность структуры активного центра к введению дополнительных элементов вторичной структуры. Присутствие двух объемных остатков РЬе значимо также потому, что эта об-
ласть структуры у SauFDH содержит важный остаток К356, расположенный напротив одноименно заряженного остатка R198 (рис. 5, Б), который находится в высококонсервативном мотиве GXGXXG [18]. Это может приводить к взаимному отталкиванию одноименных зарядов и увеличению объема активного центра. Вместо положительно заряженного остатка K356 в структурно эквивалентном положении PseFDH расположен остаток Е364, противоположно заряженный относительно высококонсервативного R201. Таким образом, это электростатическое взаимодействие (притяжение) может играть важную роль в формировании оптимальной конформации активного центра, а также косвенно способствовать вовлечению С-концевой области в связывание кофермента у PseFDH.
Выводы
Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что С-концевая аминокислотная последовательность играет важную роль в формировании оптимальной конформации активного центра.
Нами получены новые мутантные формы с заменами I220H и T250H в активном центре SauFDH. За счет введения этих замен, вероятно, происходит увеличение объема области активного центра SauFDH. Значения для этих мутантных форм увеличились в 1,5 и 2,5 раза соответственно, тогда как величины
hcoo- , ^
KM и kcat изменились незначительно. Таким образом, увеличение объема области активного центра приводит к ослаблению связывания NAD+.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Tishkov V.I., Popov V.O. // Biochemistry (Moscow). 2004. Vol. 69. N 11. P. 1252-1267 (DOI: 10.1007/ s10541-005-0071-x).
2. Tishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. Eng. 2006. Vol. 23. P. 89-110 (DOI: 10.1016/j.bioeng.2006.02.003).
3. Alekseeva A.A., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae. 2011. Vol. 3. N 4. P. 38-54 (DOI: 10.32607/20758251-2011-3-4-38-54).
4. Resch A. Rosenstein R., Nerz C., Götz F. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71. N 5. P. 2663-2676.
5. Tishkov V.I., Goncharenko K.V., Alekseeva A.A., Kleymenov S.Yu., Savin S.S. // Biochemistry (Moscow). 2015. Vol. 80. N 13. P. 1690-1700 (DOI:10.1134/ S000629791513005).
6. Ernst M., Kaup B., Müller M., Bringer-Meyer S., Sahm H. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol. 66. N 6. P. 629-634.
Согласно выравниванию, аминокислотные последовательности FDH большинства бактерий имеют удлиненный С-конец, тогда как для семейства стафилококков характерна укороченная последовательность. Увеличение длины а-спирали с помощью вставок TGA или AGA на С-конце приводило к резкому увеличению констант Михаэлиса как для NAD+, так и для HCOO-, а также к критическому снижению kcat. Предположительно, это может быть связано с закрытием входа в активный центр, поскольку, несмотря на явное снижение каталитической эффективности, изменения температурной стабильности не происходит. Иными словами, отсутствуют значительные изменения основной части белковой глобулы. Можно сделать вывод, что дополнительная а-спираль и остаток ги-стидина действительно играют ключевую роль в формировании оптимальной конформации активного центра. Однако в случае FDH из S. aureus этот эффект имеет негативные последствия для каталитических свойств. Следовательно, проблема объемного активного центра в С-концевой области не может быть решена с помощью одних лишь точечных замен, приводящих к улучшению связывания кофермента. Требуется комплексный подход, включающий в себя исследование влияния стерических эффектов, гидрофобных, стэкинг- и электростатических взаимодействий между отдельными элементами вторичной структуры, задействованными в формировании активного центра. Однако этот подход отличается меньшей предсказуемостью и для его осуществления требуется детальное исследование структуры белка и учет многих факторов.
7. Weckbecker A., Groger H., Hummel W. // Adv. Bio-chem. Eng. Biotechnol. 2010. Vol. 120. P. 195-242.
8. Liu Q., Zhou J., Yang T., Zhang X., Xu M., Rao Z. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018. Vol. 102. N 5. P. 2129-2141.
9. Tishkov V.I., Pometun A.A., Stepashkina A.V., Fe-dorchuk V.V., Zarubina S.A., Kargov I.S., Atrosh-enko D.L., Parshin P.D., Shelomov M.D., Kova-levski R.P. Boiko K.M., Eldarov M.A., D'Oronzo E., Facheris S., Secundo F., Savin S.S. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2018. Vol. 73. N 1. P. 1-6 (DOI: 10.3103/ S0027131418020153).
10. Pometun A.A., Boyko K.M., Yurchenko T.S., Niko-laeva A.Y., Kargov I.S., Atroshenko D.L., Savin S.S., Popov V.O., Tishkov, V.I. // Biochemistry(Moscow). 2020. Vol. 85. N 6. P. 689-696 (DOI: 10.1134/ S0006297920060061).
11. Jumper J., Evans R., Pritzel A., Green T., Figurnov M., Ronneberger O., Tunyasuvunakool K., Bates R., Zidek A., Potapenko A., Bridgland A., Meyer C., Kohl S. A. A., Ballard A. J., Cowie A., Romera-Paredes B., Nikolov S., Jain R., Adler J., Back T., Petersen S, Reiman D., Clancy E., Zielinski M., Steinegger M., Pacholska M., Berghammer T., Bodenstein S., Silver D., Vinyals O., Senior A. W., Kavukcuoglu K., Kohlil P., Hassabis D. // Nature. 2021. Vol.596. N 7873. P. 583-589.
12. Mirdita M., Schütze K., Moriwaki Y., Heo L., Ovchin-nikov S., Steinegger M. // Nature Methods. 2022. Vol. 19. N 6. P. 679-682.
13. Emsley P., Lohkamp B., Scott W. G., Cowtan K. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010. Vol. 66. N 4. P. 486-501.
14. Alekseeva A.A., Savin S.S., Kleimenov S.Y., Uporov
I.V., Pometun E.V., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2012. Vol. 77. N 10. P. 1199-1209 (DOI: 10.1134/ S0006297912100124).
15. Bradford M.M. A // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
16. Fogal S., Beneventi E., Cendron L., Bergantino E. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015. Vol. 99. N 22. P. 9541-9554.
17. Sadykhov E.G. Serov A.E., Voinova N.S., Uglanova S.V., Petrov A.S., Alekseeva A.A., Kleimenov S.Y., Popov V.O., Tishkov V.I. // Appl. Biochem. Microbiol. 2006. Vol. 42. N 3. P. 236-240 (DOI: 10.1134/ S0003683806030021).
18. Baker P.J., Britton K.L., Rice D.W., Rob A., Still-man T.J. // J. Mol. Biol. 1992. Vol. 228. P. 662-671 (DOI: 10.1016/0022-2836(92)90848-e).
Информация об авторах
Юрченко Татьяна Сергеевна - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]);
Логинова Анастасия Аркадьевна - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]);
Сергеев Егор Павлович - студент химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]);
Пометун Евгений Владимирович - доцент кафедры аналитической, физической и коллоидной химии Института фармации ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), канд. хим. наук ([email protected]);
Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук; докт. хим. наук, профессор ([email protected]);
Савин Святослав Сергеевич - ст. науч. сотр. кафедры химической этимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. биол. наук ([email protected]);
Пометун Анастасия Александровна - ст. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, доктор химических наук ([email protected]).
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья поступила в редакцию 05.09.2022; одобрена после рецензирования 12.10.2022; принята к публикации 14.10.2022.
