CC BY
6
УДК 577.322.63
ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ HIS6 НА СВОЙСТВА ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP. 101
А.А. Пометун1,2,3, П.Д. Паршин2,3, Н.П. Галаничева2, И.В. Упоров2, Д.Л. Атрошенко1,2,3, С.С. Савин2,3, В.И. Тишков1,2,3
(1 Институт биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; 2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет; ЪООО «Инновации и высокие технологии МГУ»; *e-mail: vitishkov@gmail.com)
NAD(P)+-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ, КФ 1.2.1.2.) активно используется в процессах хирального синтеза с участием оксидоредуктаз для регенерации восстановленного кофактора. Для успешного использования ФДГ в таких системах необходим простой и быстрый способ очистки фермента. В качестве такого способа широко используется металло-хелатная хроматография, для которой необходимо наличие нескольких (шести и более) остатков гистидина на N- или C-конце аминокислотной последовательности фермента. Зачастую такое добавление остатков гистидина оказывает влияние на свойства ферментов. Проведено моделирование структур ФДГ из бактерий Pseudomonas (PseFDH) с разным положением гисти-диновой метки. Показано, что наиболее оптимально вводить последовательность His6 на N-конец, а не на С-конец фермента. Методом направленного мутагенеза получены His6-PseФДГ дикого типа и два NADP+-специфичных мутанта. Новые ферменты выделены в одну стадию практически в гомогенном состоянии. Сравнение их свойств с таковыми для исходных ферментов показало, что введение His-tag не влияет на каталитические свойства и слабо сказывается на термостабильности NADP -специфичных мутантов.
Ключевые слова: формиатдегидрогеназа, Pseudomonas sp.101, аффинная хроматография, каталитические свойства, температурная стабильность, His-tag.
Введение в последовательность белка дополнительного полипептидного фрагмента (аффинных тегов) позволяет легко очищать белки как из эукариотических, так и из прокариотических организмов [1]. Этот подход активно используется для научных исследований и практического применения разных ферментов. Кроме того, добавление полипептидных тегов может улучшать растворимость белков, решать проблемы фол-динга и повышать уровень экспрессии [2].
Один из наиболее широко используемых подходов - введение на К- или С-конец белка последовательности из шести остатков гистидина (His6-tag), хотя можно использовать и более длинные последовательности, например His7-12 [3]. His6 используют для проведения очистки ре-комбинантных белков методом аффинной метал-ло-хелатной хроматографии [1]. Отметим, что His6 не проявляет иммуногенности, в отличие от многих других полипептидных тегов.
Сродство His6 к зволяет быстро с чистотой до 99% отделить по-
лученный комплекс металла и белка с His6 от массы других бактериальных белков. Процедура очистки включает связывание фермента с His-tag на металло-хелатном носителе и отмывку носителя от несвязавшихся белков. С помощью буферных растворов, имеющих низкую концентрацию имидазола, с колонки снимали белки, имеющие низкое сродство. Для элюирования целевого белка с колонки использовали более высокие концентрации имидазола.
Введение His6 существенно упрощает процесс очистки белка. В то же время физико-химические свойства таких белков могут отличаться от свойств белков без His6. В качестве примера можно привести ФДГ из термотоле-ратных дрожжей Ogataea parapolymorpha БЬ-1 (ОраБО^. В работе [4] был получен рекомби-нантный фермент с His6 на С-конце (ОраФДГ-С-His6). В нашей лаборатории была создана генно-инженерная конструкция, позволяющая получать OpaFDH дикого типа без аффинной метки [5]. Оказалось, что введение His-tag на С-конец
OpaFDH приводит к увеличению константы Ми-хаэлиса по NAD+ в семь раз (84 и 12 мкМ для OpaFDH-C-His6 и wt-OpaFDH соответственно). Подобные исследования были проведены для ФДГ из Candida methylica (CmeFDH). В работе [6] показано, что после присоединения His6 на N-конец константа Михаэлиса фермента по формиату имеет такое же значение, что и для CmeFDH дикого типа. Авторы [7] исследовали влияние расположения His6 на растворимость и каталитические свойства рекомбинантной фор-миатдегидрогеназы из Chaetomium thermophilum (CthFDH). Показано, что His6 не влияет на растворимость ферментов, однако CthFDH с гисти-диновой меткой на C-конце аминокислотной последовательности обладает почти в три раза более высокой удельной активностью и в два раза большей каталитической эффективностью по сравнению с ферментом, содержащим His6 на N-конце.
Из приведенных выше данных следует, что даже в случае такого консервативного фермента, как формиатдегидрогеназа, нельзя точно предсказать эффект влияния введения His6 на свойства фермента. В настоящей работе проведено моделирование структуры ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (PseFDH) c His-tag на N- и C-конце аминокислотной последовательности фермента. Получены три типа PseFDH c His6 на N-конце, изучены их каталитические свойства и термо стабильность.
Экспериментальная часть
Компьютерное моделирование. Ручной до-кинг фрагментов белковых структур и моделирование структур по гомологии были выполнены с помощью пакета программ Discovery Studio 2019 (Accelrys, Inc., https://www.3dsbiovia.com/products/ collaborative-science/biovia-discovery-studio/).
Для построения модели PseFDH с His-tag на N-конце белковой цепи использовали структуру PDB 2NAC. Общая вводимая последовательность - GlyHis6SerGly. Такая последовательность должна обеспечивать дополнительную гибкость между аффинной меткой и белковой глобулой. Добавление последовательности проводили в три этапа. Сначала к N-концевому остатку аланина PseFDH был достроен дипеп-тид SerGly. Затем к азоту остатка Ser (новый N-конец полипептидной цепи мономера) вручную подводили фрагмент N-концевого His-tag из структуры 3KKW таким образом, чтобы расстояние между ними и взаимная ориентация прибли-
зительно соответствовали геометрии пептидной группы. Затем N-конец His-tag удлиняли еще на один остаток Gly с помощью опции «EndRepair» модуля Homology. Структуру каждого из полученных таким образом мономеров, сохраненную в виде отдельного PDB-файла, использовали в качестве начальной структуры PseFDH с His-tag на N-конце для дальнейшей регуляризации и молекулярной динамики.
Полноразмерная субъединица PseFDH состоит из 400 аминокислотных остатков, в то время как в рентгеновской структуре 2NAD видно только 393 остатка. Поэтому для построения корректной модели PseFDH с С-концевым His-tag необходимо достроить белковую цепь каждого из мономеров до полного размера. Для построения модели полной белковой цепи использовали модуль Homology упомянутого выше пакета программ. В качестве опорной структуры использовали структуру ФДГ из Moraxella sp. C-1 [8], поскольку для нее C-конец разрешен полностью (PDB-код 2GSD, 401 аминокислота). Этот фермент демонстрирует высокую степень гомологии с PseFDH (около 85%).
Для регуляризации начальных структур и проведения расчетов по методу молекулярной динамики был использован пакет AMBER 2017 (http://ambermd.org/) [9] с силовым полем ff14SB [10]. С помощью утилиты tleap были достроены координаты всех атомов водорода димера. Димер помещали в ячейку, грани которой отступали как минимум на 12 Ä от поверхности белка, ячейка была заполнена молекулами TIP3P воды, заряд системы нейтрализовали путем добавления ионов Na+. После этого осуществляли минимизацию, для того чтобы потенциальная энергия взаимодействия введенных пептидных фрагментов друг с другом и полипептидной цепью PseFDH приблизилась к нормальным параметрам (этап регуляризации начальных структур). После чего систему постепенно нагревали до температуры 300 К, затем выполняли этапы выравнивания давления молекул растворителя и приведения системы в равновесие (50 пс). Для обеих моделей проводили молекулярную динамику с периодическими граничными условиями при постоянных температуре и давлении, длительность траектории составляла 10 нс.
С помощью программы PyMol 2.1 (https:// pymol.org/2/) был проведен визуальный анализ полученных траекторий, чтобы определить влияние His-tag на структуру фермента.
Проведение реакции направленного мутагенеза. Введение точечных замен осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы использовали плазмиды pPseFDH8, pPseFDH8_D221Q и pPseFDH8_SM4_D221Q, в которых ген psefdh находится под контролем сильного промотора РНК-полимеразы фага Т7. Для введения мутаций использовали прямой (PseFDH_His_for) и обратный (Pse_Rev) праймеры на начало и конец гена соответственно, а также прямой и обратный праймеры, несущие требуемую замену в гене psefdh. Для получения генов ферментов с His6 вместо праймера T7_For использовали праймер PseFDH_His_for. Последовательности праймеров приведены ниже.
PseFDH_His_for 5 '-CAAACAATCCATGGGTCACC
ACCACCACCACCATTCGGGT
GCAAAGGTCCTGTGCGTTCTT
TAC-3'
Pse_Rev 5-GGAGCTCGAATTCTCAGA
CCGCCTTCTTGAACTTGGCGG
CCTCTT C-3
Реакционная смесь для проведения ПЦР содержала 2,5 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы (200 мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25 °C), 100 мМ (NH4)2SO4, 100 мМ KCl, 1 мг/мл БСА, 1% (v/v) Тритон X-100, 20 мМ MgSO4); 2,5 мкл смеси dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dСTP, концентрация каждого 2,5 мМ); 1 мкл ДНК-матрицы (~10 нг/мкл); по 2 мкл праймеров (10 нмоль/мл); 0,5 мкл Pfu ДНК-полимеразы (2,5 Ед/мкл) и де-ионизованную воду, добавленную для получения общего объема смеси 25 мкл. ПЦР проводили в тонкостенной пластиковой пробирке объемом 0,5 мл («SSI», США) на приборе «Терцик» («ДНК-Технологии», Россия). Для предотвращения испарения реакционной смеси в пробирку добавляли 30 мкл минерального масла. Пробирку прогревали в течение 5 мин при 95 °С, а затем проводили реакцию по следующей программе: денатурация - 95 °С, 30 с; связывание праймеров - 54-58 °С, 30 с; удлинение цепи - 72 °С, 2 мин. Всего было проведено 25-35 циклов. По окончании последнего цикла реакционную смесь дополнительно выдерживали 5 мин при 72 °С. Температуру на второй стадии выбирали на 3-5 градусов ниже температуры плавления дуплексов, образуемых праймерами.
Продукты ПЦР очищали электрофорезом в 1%-м агарозном геле. Затем продукты ПЦР об-
рабатывали эндонуклеазами рестрикции NcoI и EcoRI. Далее ДНК очищали электрофорезом в 1%-м агарозном геле с последующей экстракцией из геля и лигировали с расщепленной теми же эндонуклеазами рестрикции плазмидой pET28a. После лигирования реакционной смесью трансформировали клетки E. coli dH5a, высевали их на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей канамицин (30 мкг/мл), и выдерживали 16 ч при 37 °С. Для каждого варианта PseFDH с чашки брали по три колонии и выделяли из них плазмиды. Для контроля введения требуемых мутаций проводили секвенирование плазмид-ной ДНК в Центре коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН).
Экспрессия новых His6-PseFDH в клетках E. coli. Экспрессию PseFDH дикого типа и мутантов проводили в клетках E. coli BL21(DE3)/ pLysS. Для получения штамма-продуцента клетки трансформировали соответствующей плазми-дой и высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей канамицин (30 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл). Для приготовления посевного материала с чашки отбирали единичную колонию и культивировали в течение 7-9 ч при 30 °С и 180 об/мин до достижения величины поглощения на длине волны 600 нм (A600 ~ 0,60,8) в 5 мл среды 2YT (дрожжевой экстракт 10 г/л, бактотриптон 16 г/л, хлорид натрия 5 г/л; рН 7,0) в присутствии 30 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола. Содержимое пробирок переносили в конические качалочные колбы (1 л) с отбойниками, содержащими 200 мл среды 2YT и 30 мкг/мл канамицина. Клетки культивировали при 30 °С и 80-90 об/мин до достижения величины поглощения на 600 нм (A600 = 0,6-0,8). Далее проводили индукцию клеток, добавляя в среду для культивирования раствор лактозы (300 г/л) до конечной концентрации индуктора 20 г/л. После индукции клетки культивировали в течение 17 ч при 120 об/мин. Полученную биомассу осаждали на центрифуге «Beckman J-21» (США) при 7500 об/мин в течение 20 мин при 4 °С и после удаления культуральной жидкости клетки ресуспендировали в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН 8,0) в соотношении 1:4 (мас.). Полученную суспензию замораживали и хранили при -20 °С.
Выделение и очистка. Для очистки ферментов, содержащих His-tag, использовали метод аффинной хроматографии. К бесклеточному экстракту добавляли буферный раствор 0,25 M TrisHCl (pH 7,5), содержащий 0,75 M NaCl до концен-
трации NaCl 0,15 M. Полученный раствор фильтровали и наносили на колонку HisTrap HP 1 мл (производитель «GE Heathcare», США), предварительно уравновешенную буфером 0,05 M TrisHCl (pH 7,5), содержащим 0,15 M NaCl. Для элюи-рования белка с колонки использовали градиент 0-300 мМ концентраций имидазола в аналогичном буфере. Активные фракции фермента обессоливали на колонке с Сефадекс G-25 в натрий-фосфатном буфере (pH 7,0). Контроль чистоты полученных препаратов осуществляли методом аналитического электрофореза в 12%-м полиа-криламидном геле в присутствии 0,1%-го доде-цильсульфата натрия на приборе для электрофореза «MiniProtean II» фирмы «BioRad».
Измерение активности формиатдегидроге-назы. Активность ФДГ определяли спектрофо-тометрически по накоплению NADH (NADPH) на длине волны 340 нм (е340 = 6220 М-1см-1) на спектрофотометре «Schimadzu UV 1800 PC» при 30 °С в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,0). Концентрация формиата натрия и NAD(P)+ в кювете составляла 0,6 М и 1 мг/мл соответственно.
Определение констант Михаэлиса. Кон -станты Михаэлиса по NAD+, NADP+ и форми-ату определяли на основании зависимостей активности фермента от концентрации (0,46,0 KM) соответствующего субстрата. Концентрация второго субстрата была насыщающей (>15 KM). Точные концентрации исходных растворов NAD+ и NADP+ определяли спектро-фотометрически на длине волны 260 нм (е260 = 17 800 М-1см-1). Раствор формиата натрия с заданной концентрацией готовили, растворяя нужное количество субстрата в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,0). Объем раствора доводили до нужного в мерной колбе. Значения KM были рассчитаны из экспериментальных зависимостей методом нелинейной регрессии с помощью программы Origin Pro 8.5.
Изучение кинетики термоинактивации. Термостабильность ферментов измеряли в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,0) при нескольких значениях температуры. Для каждого эксперимента готовили серию из пластиковых пробирок объемом 0,5 мл по 100 мкл раствора фермента (0,2 мг/мл) в каждой. Пробирки помещали в предварительно прогретый до необходимой температуры водный термостат (точность термостатирования ±0,1 °С). В определенные моменты времени отбирали по одной пробирке и переносили в лед на 5 мин, после чего пробирку центрифугировали в течение 3 мин при 12 000 об/мин на центрифуге «Eppendorf
5415D». Остаточную активность ФДГ измеряли, как описано выше. Константу скорости термоинактивации £ин определяли как тангенс угла наклона прямой из графика зависимости натурального логарифма величины остаточной активности от времени (полулогарифмические координаты 1n(A/A0) - t) методом линейной регрессии, используя программу «Origin Pro 8.5».
Результаты и их обсуждение
Молекулярное моделирование положения гистидиновой метки. На рис. 1 представлены результаты моделирования структуры PseFDH, в которую добавлена последовательность His-tag на N- и C-концы аминокислотной последовательности фермента дикого типа (PseFDH wt) соответственно. На рис. 1, А показано, что His-tag на N-конце расположена вдали от активного центра фермента, она не взаимодействует с белковой глобулой и свободно вращается в пространстве. Во втором случае (His-tag на С-конце) аффинная метка также не взаимодействует с белковой глобулой и ориентирована в раствор, однако она расположена на входе в активный центр в районе кофермент-связывающего домена. Наличие в этой группе нескольких (до шести) положительных зарядов позволяет предположить, что она может взаимодействовать с отрицательно заряженной пирофосфатной группой NAD+, ухудшая связывание кофермента в активном центре. Вероятно, именно наличие дополнительных положительных зарядов остатков гистидина за счет введения His-tag на С-конец формиатдеги-дрогеназы из O. parapolymorpha DL-1 (OpaFDH) приводит к тому, что по сравнению с ферментом дикого типа значение КМ по формиату уменьшается с 1,2 до 0,5 мМ, а константа Михаэлиса по NAD+ возрастает в 7 раз - с 12 до 84 мкМ [4, 5].
Получение мутантных ферментов. По результатам молекулярного моделирования было решено ввести His-tag на N-конец PseFDH. Поскольку на практике используются как исходный NAD+-зависимый фермент (PseFDH wt), так и его NADP-специфичные мутанты, нами были получены три варианта фермента c His-tag на N-конце - His6-PseFDH, His6-PseFDH D221Q и His6-PseFDH D221Q/SM4. Зам6ена D221Q обеспечивает изменение коферментной специфичности PseFDH от NAD+ к NADP+ [11, 12]. Четыре дополнительные замены SM4 обеспечивают повышение химической и температурной стабильности [13]. Плазмиды, содержащие гены His6-PseFDH, His6-PseFDH D221Q и His6-PseFDH D221Q/SM4 были получены с помощью полимеразной цепной
Рис. 1. Модельные структуры формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp. 101 с последовательностями His6 на N-конце (А) и C-конце (Б) фермента. Субъединицы фермента представлены в виде комбинации структурных элементов и выделены светло- и темно-серым цветом, остатки His изображены в виде плочек. Условия моделирования даны в «Экспериментальной части»
реакции, как описано в разделе «Экспериментальная часть». Результаты секвенирования показали, что во всех плазмидах в гене psefdh отсутствуют посторонние нуклеотидные замены.
Для получения новых ферментов их экспрес-сировали в клетках E. coli BL21(DE3)/pLysS. Все три формы PseFDH с His-tag на N-конце экспрессировались в активной и растворимой формах. Уровень экспрессии не отличался от такового для ферментов без His-tag. Ферменты были очищены в одну стадию практически до гомогенного состояния с помощью металло-хелатной хроматографии по методике, представленной выше в разделе «Экспериментальная часть». Результаты представлены на рис. 2. Ферменты без His-tag были получены и очищены по методике, разработанной ранее в нашей лаборатории [12, 14].
Кинетические свойства ФДГ с His-tag. В табл. 1 представлены данные по константам
Михаэлиса и каталитическим константам для PseFDH, содержащих His-tag. Из табл. 1 видно, что как в случае NAD+-зависимого фермента дикого типа, так и в случае мутантов, обладающих специфичностью к NADP+, His-tag практически не влияет на кинетические свойства. Это находится в полном соответствии с нашими результатами по моделированию (см. выше). Таким образом, новые PseFDH, содержащие His-tag на К-конце, могут быть успешно использованы для регенерации кофактора в процессах хирального синтеза с помощью оксидоредуктаз.
Определение температурной стабильности ферментов. Нами было проведено сравнительное исследование зависимости термостабильности от введения His-tag на К-конец PseFDH. На рис. 3 представлены зависимости остаточной активности от времени для трех форм PseFDH, содержащих и не содержащих His-tag. На рис. 3 показано, что в случае NAD+-
Рис. 2. Аналитический электрофорез в присутствии ВБ8-№ различных форм РбсРБИ. (1, 8 - белки-маркёры молекулярной массы; 2, 3 - Н1б6-РбсРБН Б2210/8М4 до и после очистки соответственно; 4, 5 - Н1б6-РбсРБН Б2210 до и после очистки соответственно; 6, 7 - ШБ^РБеРБН до и после очистки соответственно)
зависимого фермента различие в стабильности минимально и не превышает ошибки эксперимента. В случае НЛ0Р+-специфичной Р8еРЭН Э2210 термостабильность снижается на 1020%. В случае 02210/8М4 (более термостабильного варианта №86-Р8еР0Н) также происходит уменьшение термостабильности, но оно минимально и находится в пределах ошибки эксперимента.
Для более детального изучения влияния введения Н186 на термостабильность различных Р8еРЭН нами была изучена кинетика их термоинактивации при разной температуре (60-71 °С). На рис. 4 в качестве примера представлены результаты экспериментов для Н186-Р8еРЭН. Для других ферментов были получены
аналогичные зависимости. Из тангенсов углов наклона этих прямых были рассчитаны константы скорости термоинактивации. Наблюдаемые величины констант скорости инактивации не зависят от концентрации фермента во всем исследованном диапазоне значений температуры, что свидетельствует об истинном мономолекулярном механизме процесса термоинактивации. На рис. 5 представлены зависимости величины наблюдаемых констант скорости инактивации первого порядка kwa в координатах 1п^ин/71) от 1/T, где Т - температура в градусах Кельвина. Линейная зависимость вторичных графиков свидетельствует, что процесс термоинактивации нативной и мутантных ФДГ описывается уравнением для зависимости константы скоро-
Т а б л и ц а 1
Каталитические свойства PseFDH дикого типа и мутантных форм фермента (0,1 М натрий-фосфатный
буфер; 0,01М ЭДТА; рН 7,0)
Фермент ^ , мкМ тт нсоо KM с ]\ГЛБР+, мМ к , с 1 кат.' к /K ^л°(Р)+, К кат/^М 1 с -мкМ- k /K нс00-, К кат./ЛМ с-1 - мМ-1
РБеРБН тег* 32±2 1,0±0,1 7,3±0,2 0,228 7,30
Шз^РзеРБН* 39±2 1,1±0,1 7,2±0,2 0,185 6,55
РБеРБН 02210** 110±10 22±2 4,3±0,3 0,0391 0,200
Н186-Р8еГОН 02210** 140±20 31±2 4,2±0,3 0,0300 0,136
РБеРБН Б2210/8М4** 100±10 110±20 5,0±0,3 0,0500 0,0455
Н186-Р8еГОН Б2210/8М4** 120±10 100±10 5,2±0,3 0,0433 0,0520
* В качестве кофермента использовали №АБ+; ** в качестве кофермента использовали №АБР+.
Рис. 3. Изучение влияния His-tag на термостабильность различных PseFDH: А - PseFDH wt (1), His6-PseFDH (2) (65 °С); Б - PseFDH D221Q (1), His6-PseFDH D221Q (2) (64 °С); В - PseFDH D221Q/SM4 (1), His6-PseFDH D221Q/SM4 (2) (66 °С); 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0)
Рис. 4. Зависимость логарифма остаточной активности His6-PseFDH от времени при разных значениях температуры, °С: 1 - 63, 2 - 64, 3 - 65, 4 - 66; 0,1 М натрий-фосфатный буфер № 7,0)
Рис. 5. Зависимость константы скорости термоинактивации His6-PseFDH D221Q/SM4 (1), His6-PseFDH D221Q (2) и His6-PseFDH (3) от температуры в координатах Ык /Т) - 1/7; 0,1 М фосфатный буфер ' (pH 7,0)
Т а б л и ц а 2
Активационные параметры процесса термоинактивации различных PseFDH
Фермент AH#, кДж/моль AS#, Дж/(моль К;
PseFDH wt 560±20 1320+70
His6-PseFDH 525±80 1250±160
PseFDH D221Q 610±10 1490±30
His6-PseFDH D221Q 560+30 1340+100
PseFDH D221Q/SM4 550±50 1300±110
His6-PseFDH D221Q/SM4 570±20 1350±50
сти от температуры из теории активированного комплекса [15]. Это уравнение может быть представлено в линейном виде:
где кв и к - это константы Больцмана и Планка соответственно, Я - универсальная газовая постоянная, АНф и ф - активационные параметры. Численные значения активационных параметров АНФ и ф процесса термоинактивации представлены в табл. 2, где показано, что все величины находятся в одном диапазоне. Таким образом, можно утверждать, что для разворачивания белковой глобулы всех мутантных форм затрачивается примерно одинаковое количество энергии.
Выводы
В результате проделанной работы на основании компьютерного анализа были получены
формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp. 101 дикого типа и две ее мутантные NADP-специфичные формы, содержащие на N-конце His6-последовательность. Введение аффинной метки His-tag позволило в одну стадию получать практически гомогенные препараты ферментов. Кроме того, наличие такой последовательности не влияет на каталитические свойства ферментов, которые могут быть использованы для получения гибридных ферментов на основе фор-миатдегидрогеназы PseFDH.
Работа выполнена при частичной поддержке
Российского научного фонда (проект № 1874-00146).
Конфликта интересов нет.
Дополнительных материалов нет.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hengen P. N. // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20. N 7. P. 285.
2. Arnau J., Lauritzen C., Petersen G.E., Pedersen J. // Protein Expr. Purif. 2006. Vol. 48. N 1. P. 1.
3. Hochuli E., Bannwarth W., Döbeli H., GentzR., Stüber D. // Nature Biotechnology. 1988. Vol. 6. N 11. P. 1321.
4. Yu S., Zhu L., Zhou C., An T., Zhang T., Jiang B., Mu W. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. Vol. 98. N 4. P. 1621.
5. Tishkov V.I., Pometun A.A., Stepashkina A.V., Fedor-chuk V.V., Zarubina S.A., Kargov I.S., Atroshenko D.L., Parshin P.D., Kovalevski R.P., Boiko K.M., Eldarov M.A., D'Oronzo E., Facheris S., Secundo F., Savin S.S. // Moscow Univ. Chem. Bull. 2018. Vol. 73. N 2. P. 1 (DOI 10.3103/S0027131418020153).
6. Ordu E.B., Karagüler N.G. // Prepar. Biochem. Biotech-nol. 2007. Vol. 37. N 4. P. 333.
7. Esen H., Alpdagta§ S., Mervan Qakar M., Binay B. // Prepar. Biochem. Biotechnol. 2019. Vol. 49. N 5. P. 529.
8. Shabalin I.G., Filippova E.V., Polyakov K.M., Sady-
khov E.G., Safonova T.N., Tikhonova T.V., Tishkov V.I., Popov V.O. // Acta Crystallogr. D Biol Crys-tallogr. 2009. Vol. 65. N 12. P. 1315 (D01:10.1107/ S0907444909040773).
9. Case D.A., Cerutti D.S., Cheatham III T.E., Darden T.A., Duke R.E., Giese T.J., Gohlke H., Goetz A.W., Greene D., Homeyer N., Izadi S., Kovalenko A., Lee T.S., LeGrandS., Li P., Lin C., Liu J., Luchko T., Luo R., Mermelstein D., Merz K.M., Monard G., Nguyen H., Omelyan I., Onu-friev A., Pan F., Qi R., Roe D.R., Roitberg A., Sagui C., Simmerling C.L., Botello-Smith W.M., Swails J., Walker R.C., Wang J., Wolf R.M., Wu X., Xiao L., York D.M., Kollman P.A. AMBER 2017, University of California, San Francisco.
10. Maier J.A., Martinez C., Kasavajhala K., Wickstrom L., Hauser K.E., Simmerling C. // J. Chem. Theory Comput. 2015. Vol. 11. P. 3696.
11. Alekseeva A., Dolina I., Kargov I., Savin S., Tishkov V. // Prot. Sci. 2015. Vol. 24. N S1. P. 174 (DOI: 10.1002/ pro.2823).
12. Alekseeva A.A., Fedorchuk V.V., Zarubina SA., Sadykhov E.G., MatorinA.D., Savin S.S., Tishkov V.I. // Acta Naturae 2015. Vol. 7. N 1 (24). P. 60.
13. D'Oronzo E., Secundo F., Minofar B., Kulik N., Pometun A.A., Tishkov V.I. // ChemCatChem 2018. Vol. 10. N 15. P. 3247 (DOI: 10.1002/ cctc.201800145).
14. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., Tishkov V.I. // FEBS Lett. 1999. Vol. 445. N 1. P.183 (DOI: 10.1016/S0014-5793(99)00127-1).
15. Cornish-Bowden A. / Fundamentals of Enzyme Kinetics // Wiley-Blackwell. 2012. 4th Edition. ISBN: 978-3-527-33074-4. 510 pages.
Поступила в редакцию 10.03.2020 Получена после доработки 12.03.2020 Принята к публикации 20.03.2020
INFLUENCE OF HIS6 SEQUENCE ON PROPERTIES OF FORMATE DEHYDROGENASE FROM BACTERIUM PSEUDOMONAS SP. 101
A.A. Pometun 12'3, P.D. Parshin 2'3, N.P. Galanicheva 2, I.V. Uporov 2, D.L. Atroshenko 12,3, S.S. Savin 23, V.I. Tishkov 12,3*
(lA.N. Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences; 2 Department of Chemistry, M.V. Lomonosov Moscow State University; 3 Innovations and High Technologies MSU Ltd; *e-mail: vitishkov@gmail.com)
NAD(P)+-dependent formate dehydrogenase (FDH, EC 1.2.1.2.) is actively used in processes of chiral synthesis by oxidoreductases with systems of reduced cofactor regeneration. Efficient use of FDH in such systems requires simple and fast enzyme purification method. Metal-chelating affinity chromatography is widely used for such purposes. The method requires presence of six (or more) His residues at N- or C-terminus of protein. Addition of extra His residues can influence enzyme properties. Computer modeling of structure of FDH from bacterium Pseudomonas sp. 101 with different positions of His6 sequence showed that optimal case is His-tag at N-terminus. Three types of PseFDH with His6 were prepared - wild-type NAD+-dependent enzyme and two mutant NADP+-specific forms. New PseFDHs were obtained as homogeneous preparations through one step purification procedure. Comparison of properties of PseFDHs with and without His-tag showed that they have similar kinetic properties.
Key words: formate dehydrogenase, Pseudomonas sp.101, affinity chromatography, catalytic properties, thermal stability, His-tag.
Сведения об авторах: Пометун Анастасия Александровна - ст. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, ст. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук (aapometun@gmai1.com); Паршин Павел Дмитриевич - мл. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (parshin.p04@gmai1.com); Гала-ничева Наталья Павловна - студентка химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (gnata1ia0@gmai1.com); Упоров Игорь Владимирович - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. физ.-матем. наук (iuporov@gmai1.com); Атрошенко Денис Леонидович - мл. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (atrdenis@gmai1.com); Савин Святослав Сергеевич - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. биол. наук (savins1ava@gmai1.com); Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук; ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», докт. хим. наук, профессор (vitishkov@gmai1.com).
