CC BY
35
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
РОЛЬ МЕТАБОЛИЗМА АРГИНИНА В РЕГУЛЯЦИИ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА
Старикова Э.А.
ФБГНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
Аргинин — условно заменимая протеиногенная аминокислота, которая играет важную роль в эмбриогенезе, раннем развитии и регуляции функций клеток иммунной системы (Carroll B. et al., 2016; Bronte V. et al., 2005). Большинство клеток млекопитающих, включая гранулоци-ты, эритроциты, гепатоциты, миелоидные супрессорные клетки, тучные клетки, эндотелиальные клетки и глад-комышечные клетки в разной степени экспрессируют ферменты, метаболизирующие аргинин-аргиназу и NO-синтазу. Аргинин является единственным физиологически значимым субстратом для синтеза NO — важного внутри- и межклеточного медиатора, который обеспечивает цитотоксичность клеток врожденного иммунитета, направленную на борьбу с патогенными микроорганизмами (Bogdan C., 2015). С дефицитом аргинина и его метаболитов связывают механизм действия миелоидных супрессорных клеток, которые вызывают длительное подавление пролиферации Т-лимфоцитов и снижение экспрессии CD3Ç (Bronte V. et al., 2005). Дефицит аргинина приводит к инволюции тимуса и снижению количества Т-лимфоцитов у мышей после массивного хирургического вмешательства (Morris S.M.Jr. et al., 2012). В отсутствие аргинина полностью блокируются экзоци-тоз гранул и цитотоксичность NK-клеток, значительно подавляются их пролиферация и секреция цитокинов (Oberlies J. et al., 2009). Снижение доступности аргинина в микроокружении клеток костного мозга приводит к изменению экспрессии генов, регулирующих дифферен-цировку В-лимфоцитов на стадии про^/пре-B клеток (Le Bien T.W. et al., 2002). Несмотря на многочисленные данные, свидетельствующие о важной роли этой аминокислоты в регуляции функций клеток иммунной системы, молекулярные механизмы, последствий деплеции аргинина остаются мало изученными. В последнее время в литературе появились данные о том, что аргинин является одним из ключевых активаторов сигнального пути mTOR (mechanistic target of rapamycin). В нативном состоянии, независимо от своих метаболических путей аргинин способствует максимальной активации серин-трео-нин протеинкиназы mTORCl — центрального комплекса сигнального пути mTOR (Carroll B. et al., 2016).
Сигнальный путь mTOR интегрирует сигналы доступности питательных веществ, сигналы от ростовых факторов, цитокинов, иммунорецепторов и как следствие, направляет дифференцировку и реализацию эффектор-ных функций клеток лимфоидного и миелоидного ряда (Keating R. et al., 2016; O'Neill L. A.J. et al., 2016; Weichhart T. et al., 2015). Благодаря mTOR-опосредованной модуляции процессов автофагии, биогенеза лизосом и экспрессии MHCII осуществляется регуляция презентации антигенов клетками системы врожденного иммунитета. Контроль процесса синтеза белков со стороны mTOR является одним из важнейших механизмов регулирующих продукцию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (Nyamdelger S. et al., 2016). mTOR выступает как важнейший регулятор баланса дифференциров-ки между регуляторными и эффекторными субпопуляциями Т-лимфоцитов. Активация PI3K/mTOR сигнального пути способствует дифференцировке эффекторных популяций Т-лимфоцитов. Напротив, специфическая ин-гибиция mTOR коррелирует со снижением генерации Th1-, Th2- и 1Ы7-клеток и усилением генерации Treg (Coquillard C. et al., 2015).
В ходе развития бактериальной инфекции аргинин становится субстратом для бактериальных ферментов аргиназы и/или аргининдеиминазы, кроме того некоторые бактерии могут катаболизировать аргинин опосредованно, индуцируя экспрессию аргиназы организма-хозяина (Das P. et al., 2010). Такая стратегия патогенов может приводить к нарушению дифференцировки и функциональной активности клеток иммунной системы, дизрегуляции процесса воспаления и иммунного ответа. Эта проблема заслуживает большего внимания иммунологов.
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРНОГО РЕВМАТОИДНОГО ФАКТОРА, СДЕРЖИВАЮЩЕГО РАЗВИТИЕ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Столярова ЕЮ.1, Бедулева Л.В.1, Снигирев А.Я.2, Литвинюк А.А.1, Падерина Л.А.1
1ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет», Ижевск, Россия 2 БУЗ УР «Удмуртский Республиканский Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями», Ижевск, Россия
Введение. Недавно нами был выявлен ревматоидный фактор, получивший название регуляторный (регРФ),
ТАБЛИЦА. КОЛИЧЕСТВО CD4^ CD4+CD95+ ЛИМФОЦИТОВ В КРОВИ И ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛАХ КРЫС, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ОБМ (К ТЕЗИСАМ СТОЛЯРОВОЙ Е.Ю. И ДР.)
Кровь Лимфоузлы Титр регРФ в крови
CD4+,% РегРФ+крысы 22±5,8 55±4,0* 32±17,5
РегРФ-крысы 20±4,4 63±5,6 0±0,0
Интактные крысы 32±10,3 76±9,9 0,8±1,8
CD4+CD95+,% РегРФ+крысы 28±8,6 17±1,4 32±17,5
РегРФ-крысы 32±7,4 14±2,6 0±0,0
Интактные крысы 35±11,0 17±2,0 0,8±1,8
Примечание. * — статистически значимое различие между РегРФ+ крысами и РегРФ- крысами, р < 0,05, критерий Манна—Уитни.
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
продукция которого обеспечивает устойчивость к развитию экспериментальных аутоиммунных заболеваний, а также ассоциирована с ремиссией последних и завершением нормального иммунного ответа (Beduleva, 2015; Sidorov, 2017). Однако механизм действия регуляторного ревматоидного фактора остается не ясен. Мы предполагаем, что регРФ предотвращает развитие экспериментально-вызванных аутоиммунных заболеваний и вызывает их ремиссию посредством сдерживания экспансии Т-хелперов специфичных к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний и аутореактивных Т-хелперов, активирующихся в ответ на иммунизацию.
Цель и задачи. Проверить гипотезу о том, что регРФ сдерживает экспансию активированных Т-хелперов, специфичных к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний, вызывая их гибель по механизму апоптоза.
Материалы и методы. Крыс Wistar иммунизировали основным белком миелина морской свинки (ОБМ) (Sigma). На 7 день после иммунизации забирали регионарные лимфатические узлы (л/у) и кровь. Измеряли цитофлуориметрически количество CD4+ и CD4+CD95+ лимфоцитов в периферической крови и л/у. В крови измеряли регРФ методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов. Клетки л/у иммунизированных крыс культивировали в течение 5 дней в присутствии ОБМ, затем клетки обрабатывали регРФ-содержащей сывороткой и определяли количество погибших клеток в том числе несущих маркеры апоптоза с помощью Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC.
Результаты. Было показано, что у иммунизированных ОБМ крыс с относительно высоким уровнем регРФ в крови (регРФ+ крысы)относительное количество CD4+ лимфоцитов в л/у достоверно ниже (p < 0,05, критерий Манна-Уит-ни), чем у иммунизированных ОБМ крыс с низким уровнем регРФ (регРФ- крысы) (табл.). В крови исследуемых групп крыс уровень CD4+ лимфоцитов не отличается. Мы предполагали, что мишенью регРФ являются активированные CD4+ лимфоциты, несущие маркер CD95, опосредующий апоптоз, через взаимодействие с которым регРФ реализует свое цитотоксическое действие, и ожидали обнаружить у крыс с относительно высоким уровнем регРФ достоверное снижение количества CD4+CD95+ лимфоцитов по сравнению с крысами с относительно низким уровнем регРФ. Однако количество CD4+CD95+ лимфоцитов в л/у и крови у крыс с относительно высоким и относительно низким уровнем регРФ не отличается. Полученные факты свидетельствуют о том, что регРФ сдерживает экспансию активированных CD4+ лимфоцитов, но CD95 молекула не является мишенью для регРФ.
Обработка лимфоцитов л/у, культивированных 5 дней в присутствии ОБМ, сывороткой содержащей регРФ, полученной от крыс иммунизированных ОБМ, вызвала гибель лимфоцитов, но доля клеток, связывающих аннексин V, была незначительной. Сыворотка, содержащая регРФ, не вызывала гибель не активированных лимфоцитов.
Заключение.Таким образом, регуляторный ревматоидный фактор вызывает некроз активированных CD4+ лимфоцитов. CD95 не является мишенью для регуляторного ревматоидного фактора.
Работа поддержана грантом РФФИ 16-34-01154 мол_а.
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИЙ И КЛОНОВ NK-КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ПУТЕМ СТИМУЛЯЦИИ ИНТЕРЛЕЙКИНОМ 2 И ГЕНЕТИЧЕСКИ-МОДИФИЦИРОВАННЫМИ ФИДЕРНЫМИ КЛЕТКАМИ К562, ЭКСПРЕССИРУЮЩИМИ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫЙ ИНТЕРЛЕЙКИН 21
Стрельцова М.А., Ерохина С.А., Каневский Л.М., Коваленко Е.И.
ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Москва, Россия
Стимуляция NK-клеток фидерными клетками К562, экспрессирующими на своей поверхности Ш-21 (К562-тЬШ21) в сочетании с Ш-2 индуцирует интенсивную пролиферацию натуральных киллеров, что может быть использовано для накопления NK-клеток в иммуно-терапевтических целях. Однако величина экспансии NK-клеток, полученных от разных индивидов, значительно варьирует. Одна из причин таких вариаций может быть связана с тем, что данная комбинация стимулов по-разному действует на клетки различной степени диф-ференцировки и активации. Чтобы ответить на этот вопрос, в настоящей работе указанный метод стимуляции был применен к индивидуальным NK-клеткам, предварительно охарактеристизованным по уровню экспрессии молекул CD56, CD57 и HLA-DR, с целью получения клонов NK-клеток из субпопуляций, различающихся по степени дифференцировки и активации. С помощью ци-тометрического анализа были дискриминированы субпопуляции наименее дифференцированных NK-клеток CD56Ьгight, промежуточных CD56dimCD57- и наиболее дифференцированных CD56dimCD57bright. В кластерах CD56Ьгight и CD56dimCD57- были дополнительно выделены субпопуляции клеток с фенотипом HLA-DR- и HLA-DR+. Единичные NK-клетки из пяти указанных субпопуляций были отсортированы в лунки 96-луночного планшета, содержащего Ш-2 и облученные клетки К562-тЬШ-21. Частота образования клонов NK-клеток, которую определяли через 3 недели культивирования, оказалась выше в субпопуляциях CD56Ьnsht, по сравнению с субпопуляциями CD56dim, а наименьшая частота оказалась в субпопуляции NK-клеток, высоко экспрессирующих маркер терминальной дифференцировки CD57. Существеной связи экспрессии маркера «поздней» активации HLA-DR с эффективностью генерации клонов из данной субпопуляции не было выявлено. Фенотипический анализ полученных клонов показал, что, как правило, описанная стимуляция приводит к экспансии менее зрелых клеток, экспрессирующих рецептор NKG2A с низким уровнем экспрессии CD57. Часть клеток клонов из субпопуляции CD57+ при культивировании утрачивало экспрессию этого маркера. Доля клонов, экспрессирующих ингиби-рующие рецепторы KIR2DL2/DL3, оказалась наиболее низкой в субпопуляции HLA-DR+, при этом экспрессия этих рецепторов значительно не менялась при культивировании клонов.
Таким образом, на клональном уровне охарактеризованы NK-клеточные культуры, полученные путем стимуляции с помощью Ш-2 и K562-mЬIL-21 №К-клеток с разным уровнем зрелости и активации. Показано, что в ответ на такую стимуляцию лучше пролиферируют менее дифференцированные клетки, а хуже — более дифференцированные. Полученные результаты могут помочь
