CC BY
57
Промышленная экология и биотехнологии. Экология (по отраслям)
DOI 10.1555/2409-3203-2017-0-9-228-232 УДК 579.63:628.4.04-404.9
ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СТОКОВ МЯСОКОМБИНАТА
Колотова Ольга Владимировна
к.т.н., доцент кафедры промышленной экологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный технический университет»
Россия, г. Волгоград Соколова Ирина Владимировна к.б.н., доцент кафедры промышленной экологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный технический университет»
Россия, г. Волгоград
Аннотация: В работе произведена качественная оценка липолитической активности четырех бактериальных штаммов, выделенных из смыва промышленной мясорубки мясокомбината, по отношению к твинам и природным жирам. Установлено, что максимальным спектром экзолипазной активности обладает штамм № 6. Исследована возможность утилизации жиров в качестве единственного источника углерода при использовании среды специального состава - бульона Штерна. Для штамма №6 алкалиметрическим методом определена липолитическая активность по отношению к оливковому маслу, свиному и говяжьему жирам. Показано, что максимальную активность исследуемый штамм проявляет в отношении оливкового масла в течение первых суток культивирования. Установлено также, что ферментативная активность в отношении говяжьего жира проявляется на вторые сутки культивирования, свиного жира - через шесть суток.
Ключевые слова: бактериальные штаммы, липолитическая активность, жиры, индукция липаз.
THE RESEARCH OF THE LIPOLYTIC ACTIVITY BY MICROORGANISMS ISOLATED FROM THE SLAUGHTERHOUSE
SLUDGE
Olga Vladimirovna Kolotova
-Ph.D. in Technics, docent of Industrial Ecology and Life Safety ráair
Volgograd state technical University Rashia, Volgograd Irina Vladimirovna Sokolova
Ph.D. in Biology, docent of Industrial Ecology and Life Safety chair Volgograd state technical University Rashia, Volgograd
Abstract: The quantative measurement of lipolytic activity for four bacterial strains allocated from flush with the industrial grinder to tweens and natural fats was made. Were established the strain number 6 had maximum spectrum of ekzolipase activity. Were studied the ability to dispose lipids as the one carbon source in the special medium - Stern broth. The lipolytic activity to olive oil, pork and beef fats was identified for the bacterial strain number 6 with alcalimetric approach. Were illustrated maximum activity of the strain number 6 during the first 24 hours of the cultivation. Were established the enzyme activity to beef fat at the second 24 hours and to pork fat - after six days of cultivation.
Keywords: bacterial strains, lipolytic activity, fats, lipase induction
Развитие отечественного животноводства и связанный с ним рост перерабатывающей промышленности неизбежно приводит к увеличению количества отходов, представляющих угрозу окружающей среде при отсутствии эффективных методов их утилизации. К числу таких отходов относятся сточные воды мясоперерабатывающих предприятий, содержащие большое количество жировых веществ. Очистка сточных вод от жиров и переработка твердых жировых отходов относятся к числу трудно решаемых задач. Вместе с тем законодательством предъявляются жесткие требования по содержанию жиров в сточных водах, сбрасываемых в поверхностные водоёмы. Применение механических и физико-химических методов извлечения жиров из стоков влечет за собой необходимость утилизации собранной жиромассы. Для решения данной проблемы наибольшим потенциалом обладают биотехнологические методы с применением специально подобранных культур микроорганизмов-продуцентов липолитических ферментов - биопрепаратов. Подобные культуры способны использовать жировые отходы в качестве источников питания, расщепляя их с образованием конечных продуктов -углекислого газа, воды и некоторых других простейших неорганических веществ. Применение такого природного способа утилизации промышленных жировых отходов позволит существенно снизить нагрузку на природные водоёмы, в том числе в связи с уменьшением концентраций ПАВ, коагулянтов и других вспомогательных веществ, применяемых при физико-химической очистке сточных вод от жиров. В связи с вышеизложенным, поиск микробных культур, обладающих липолитической активностью, для применения в практике очистки жиросодержащих сточных вод, несомненно, является актуальной задачей.
Целью настоящего исследования стало определение липолитической активности бактериальных культур, выделенных из сточных вод мясокомбината, в отношении различных жировых субстратов для разработки основы биопрепарата.
Для сравнительной оценки липазной активности были отобраны 4 бактериальных штамма из коллекции кафедры промышленной экологии и безопасности жизнедеятельности (ПЭБЖ) Волгоградского государственного технического университета (ВолгГТУ), выделенные из смыва с промышленной мясорубки мясокомбината (хранящиеся под номерами 1, 2, 6, 9) [1]. Для исследования способности образования экзолипаз исследуемыми микроорганизмами готовили питательные среды следующего состава (г/л):
жировой субстрат (твин, жир или масло) - 5, пептон -10, хлорид натрия - 5, хлорид кальция - 0,1, агар-агар - 13. В качестве субстратов были изучены: твин 20, твин 60, твин 80, свиной жир, говяжий жир, оливковое масло. Стерильные среды разливали в чашки Петри. Для проведения эксперимента готовили взвеси суточных культур микроорганизмов по стандарту мутности на 10 ед., затем разводили полученные суспензии стерильным физиологическим раствором до концентрации 103 м.к./мл и высевали для получения изолированных колоний на подготовленные среды в чашки Петри. Посевы культивировали в термостате при 37 °С в течение суток. О способности к утилизации жирового субстрата (выделению экзолипаз) судили по наличию роста на чашках, наличию опалесценции (связанной с образованием мыла в процессе омыления жировых субстратов), по наличию кристаллов кальциевого мыла вокруг зоны роста на твин-содержащих средах. Полученные результаты представлены в таблице 1 [2].
Таблица 1 - Результаты культивирования штаммов на средах, содержащие различные жировые субстраты._
Номер штамма Твин 20 Твин 60 Твин 80 Оливковое масло Свиной жир Говяжий жир
1 _1 - -+ + -+ +
2 -+ + -+ + + -
6 ++ + + + ++ ++
9 + + + + + +
-1 - отсутствие роста;
-+ - наблюдается слабый рост в виде мелких колоний;
+ - заметный рост, наблюдается опалесценция;
++ - интенсивный рост, наблюдается опалесценция.
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что все исследуемые бактериальные штаммы продуцируют липолитические ферменты, но наибольшим спектром ферментативной активности в отношении изучаемых жировых веществ обладает штамм № 6. Исходя из полученных данных, для дальнейших исследований с целью разработки основы биопрепарата для очистки жиросодержащих сточных был выбран штамм №6.
На следующем этапе исследования изучали характер роста штамма № 6 в бульоне Штерна, содержащем в качестве источника углерода оливковое масло. В ходе культивирования бактерий осуществляли мониторинг рН среды.
При рассмотрении поведения бактериальной культуры в данной среде выявлено, что уже к 24 - 48 часам культивирования имеет место переход окраски бульона, образование хлопьевидного осадка и газообразование, наблюдалось появление биопленки и пристеночного кольца. В ходе культивирования изучаемого штамма в бульоне Штерна производили контроль активной реакции среды. рН контрольной пробы (бульон Штерна до культивирования) составил 6,98. Изменение активной реакции среды в ходе культивирования микроорганизмов представлено на рисунке 1.
Рисунок - Изменение рН среды бульона Штерна в зависимости от времени
культивирования штамма № 6
Полученные данные свидетельствуют о повышении кислотности среды бульона Штерна вследствие образования кислых продуктов распада оливкового масла.
С целью количественной оценки липолитической активности исследуемого штамма применяли метод алкалиметрического титрования свободных жирных кислот, образующихся в процессе ферментативного разложения жиров. Для этого готовили суспензию суточной культуры микроорганизмов в цитратно-фосфатном буфере объёмом 5 мл с концентрацией 109 м.к./мл. Полученную взвесь засевали в предварительно подготовленную стерильную эмульсию жира (массовая доля жира 0,5%, в присутствии эмульгатора - 0,25%-го раствора твина-20) объёмом 50 мл во флаконы, тщательно перемешивали и инкубировали в термостате, отбирая пробы культуральной жидкости для титрования. В качестве контроля использовали незасеянные микроорганизмами эмульсии жировых веществ в соотношении с цитратно-фосфатным буфером 1:1. Из флаконов через 24 ч. (и далее) отбирали пробы объёмом 10 мл и оттитровывали раствором гидроксида калия (0,5н) в присутствии индикатора бромтимолового синего до смены окраски с желтой на синюю, фиксируя количество щелочи пошедшей на титрование. Контрольные эмульсии жиров в буферном растворе титровали при тех же условиях. Активность липазы (х) выражали количеством миллилитров раствора щелочи, израсходованных для нейтрализации свободных жирных кислот, образующихся при гидролитическом расщеплении 1 г масла (жира) и рассчитывали по формуле:
Х =
(а-Ь)
где, а - количество раствора едкого кали, израсходованного на титрование опытного образца, мл; Ь - то же для контрольного образца; н - навеска масла (жира).
Полученные данные представлены в таблице 2. Таблица 2 - Липолитическая активность исследуемого бактериального штамма в отношении различных субстратов при различной продолжительности культивирования
Субстрат Липолитическая активность (мл 0,5 н раствора КОН/г субстрата)
24 ч 48 ч 144 ч
Оливковое масло 2,404 0,576 0,096
Свиной жир 0 0 0,288
Говяжий жир 0 0,481 0,961
н
Полученные в ходе эксперимента данные свидетельствуют о том, что при использовании в качестве субстрата оливкового масла микробиологические процессы гидролиза масла (под действием микробных липаз) протекают интенсивнее процессов химического разложения. Наибольшая интенсивность микробиологического разложения оливкового масла с образованием кислых продуктов распада отмечена в первые 24 ч стационарного культивирования штамма № 6. Что касается животных жиров, которые, как известно, являются труднодоступными для усвоения бактериями субстратами, то заметное преобладание интенсивности микробиологического гидролиза над химическими процессами распада отмечается на третьи сутки культивирования исследуемого штамма. Следует отметить также, что скорость микробного гидролиза говяжьего жира возрастает в течение всего времени культивирования, что свидетельствует о более медленном индуцировании синтеза соответствующего фермента, возможно вследствие того, что при температуре культивирования (37°С) говяжир жир остается твердым веществом.
Таким образом, в результате проведенных исследований изучена экзолипазная активность в отношении различных жировых субстратов четырех бактериальных штаммов, выделенных из смыва с промышленной мясорубки. Установлено, что максимальной деструктирующей способностью и скоростью роста на средах, содержащих различные жиры, обладает штамм № 6. Произведена количественная оценка липолитической активности бактерий в отношении оливкового масла, свиного и говяжьего жиров в зависимости от длительности культивирования. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования штамма № 6 для очистки сточных вод, загрязненных различными жировыми веществами, хотя скорость утилизации субстратов значительно варьирует.
Список литературы:
1. Колотова, О.В. Выделение, идентификация и культивирование бактериального штамма, обладающего липолитической активностью / О.В. Колотова, И.В. Соколова, И.В. Владимцева и др.// Естественные и технические науки. - 2016. - № 2. - С. 11-16.
2.Богатыренко, Е.А. Характеристика культивируемых гетеротрофов микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга apostichopus japonicus: автореф. дис. / Е. А. Богатыренко канд. биологических наук. - Владивосток, 2013. -22 с.
