CC BY
57
Thromb. Vasc. Biol. - 2010. - Vol. 30, N 9. - P. 1861-1866.
23. Miyaura S, Maki N, Byrd W, Johnston J. M. // Lipids. - 1991. - Vol. 26. - P. 1015-1020.
24. Möhler E. R., Ballantyne C. M, Davidson M. H. et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2008. - Vol. 51, N 17. - P. 1632-1641.
25. Nambi V., HoogeveenR. C. et al. // Stroke. - 2009. - Vol. 40, N 2. - P. 376-381.
26. OeiH. H., van der MeerI. M., HofmanA. et al. // Circulation. - 2005. - Vol. 111. - P. 570-575.
27. Persson M., Nilsson J. A., Nelson J. J. et al. // Atherosclerosis. -2007. - Vol. 190. - P. 388-396.
28. Rosenson R. S. // Curr. Opin. Lipidol. - 2010. - Vol. 21, N 6. - P. 473-480.
29. Schaloscke R., Dennis E. // Biochim. Biophys. Acta. - 2006. - Vol. 1761. - P. 1246-1259.
30. Schreiner P. J., Morrisett J. D., Sharrett A. R. et al. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1993. - Vol. 13. - P. 826-833.
31. SchwartzR. S., HolgerK., CarmelietP. // N. Engl. J. Med. - 2011. -Vol. 364. - P. 656-661.
32. Shahar Lavi, Joseph P. et al. // Circulation. - 2007. - Vol. 115. - P. 2715-2721.
33. Sotiriou S. N., Orlova V. V., Al-Fakhri N. et al. // FASEB J. -2006. -Vol. 20, N 3. - P. 559-561.
34. Zalewski A., Nelson J. J., Hegg L., Macphee C. H. // Clin. Chem. -2006. - Vol. 52, N 9. - P. 1645-1650.
Поступила 11.04.11
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2012
УдК 616.24-07:616.233/.235-008.83-078.33
Н. А. Корецкая, Т. П. Бавилова, Г. А. Ткачев*
исследование количества проммп1, тимп1 и цистатина с в бронхоальвеолярном секрете пациентов с неспецифическими заболеваниями легких
Кафедра биохимии ГОУ БПО Московский государственный медико-стоматологический университет, *Отдел нейрогуморальных и иммунологических исследований НИИ клинической кардиологии ФГУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ, Москва
В воспалительном процессе участвуют протеиназы и их ингибиторы. Повреждение тканей легких может быть результатом действия протеиназ. Их активность регулируется ингибиторами, такими как тканевый ингибитор металло-протеиназ 1 (ТИМП1) и цистатин С. Проведен сравнительный анализ предшественника матриксной металлопротеина-зы (проММП1) и ингибиторов протеиназ ТИМП1 и цистатина С - показателей, характеризующих состояние системы протеолиз-антипротеолиз в бронхоальвеолярном секрете пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), бронхиальной астмой и пневмонией. В группе больных с ХОБЛ в отличие от других групп на 10-е сутки лечения после обострения заболевания не обнаружено существенного повышения содержания ингибиторов протеиназ. Это свидетельствует о продолжающейся протеолитической активности и хроническом воспалении при ХОБЛ.
Ключевые слова: бронхоальвеолярный секрет, предшественник матриксной металлопротеиназы 1, тканевый ингибитор металлопротеиназ 1, цистатин С, хроническая обструктивная болезнь легких, бронхиальная астма, пневмония
N.A. Koretskaya, T.P. Vavilova, G.A. Tkatchev THE ANALYSIS OF AMOUNT OF MATRIX METALLOPROTEINASE 1 PRECURSOR , METALLOPROTEINASE 1 TISSUE INHIBITOR AND CYSTATIN C IN THE BRONCHOALVEOLAR SECRETION OF PATIENTS WITH NONSPECIFIC LUNG DISEASES
The proteinases and their inhibitors participate in the inflammatory process. The damage of lung tissue can be a result of proteinase activity. This activity is regulated by such inhibitors as metalloproteinase 1 tissue inhibitor and cystatin C. The comparative analysis was applied concerning matrix metalloproteinase 1 precursor, metalloproteinase 1 tissue inhibitor and cystatin C - indicators of conditions of the "proteolysis-antiproteolysis" system in the bronchoalveolar secretion of patients with chronic obstructive lung disease, bronchial asthma and pneumonia. In the group of patients with chronic obstructive lung disease, in contrast with other groups, the significant increase ofproteinase inhibitors was not detected on the tenth day of treatment after exacerbation of disease. This fact testifies the ongoing proteolytic activity and chronic inflammation under chronic obstructive lung disease.
Key words: bronchoalveolar secretion, matrix metalloproteinase 1 precursor, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, cystatin C, chronic obstructive lung disease, bronchial asthma, pneumonia
Неспецифические заболевания легких: бронхиальная астма (БА), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и пневмонии - входят в десятку наиболее частых причин смертности [5, 17]. Наибольшая длительность госпитализации, количество осложнений и
Для корреспонденции:
Корецкая Наталия Александровна, ст. преподаватель Адрес: 105275, Москва, ул. Б. Жигуленкова, 23 Телефон: 8-905-700-42-25 E-mail:[email protected]
летальных исходов принадлежат ХОБЛ, составляющей 10% от общей соматической патологии у лиц старше 40 лет [8]. При развитии указанных заболеваний степень воспаления определяется активностью фагоцитов, скоростью ремоделирования межклеточного матрикса и интенсивностью апоптоза или некроза клеток бронхоле-гочной системы.
Исследование нативного бронхоальвеолярного секрета (БС) позволяет оценить воспалительные изменения, происходящие непосредственно в бронхах [4]. Бронхо-
альвеолярный смыв (БАС), получаемый при процедуре бронхоальвеолярного лаважа, представляет собой смесь БС и 0,9% раствора хлорида натрия в неизвестном соотношении. Поэтому для каждого анализируемого образца БАС необходимо рассчитывать степень разведения [12]. Особенно это важно для исследования динамики показателей, поскольку количество аспирируемого изотонического раствора зависит от состояния и строения легких пациента, а объем бронхиального секрета может возрасти при воспалении в бронхах [6].
В развитии воспаления важную роль играют про-теолитические ферменты и регуляция их активности с помощью белковых ингибиторов [11]. Наиболее полно изучено повышение активности нейтрофильной эла-стазы при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) [1]. Эластаза нейтрофилов вызывает деградацию эластинов межклеточного вещества, а также коллагенов IV и V типов базальной мембраны, что приводит к снижению жизнеспособности клеток и активации апоптоза. Повышение активности эластазы наряду с другими сериновыми протеиназами и активными формами кислорода приводит к повышению внеклеточной активности матриксных металлопротеиназ (ММП), в частности ММП12, которые также участвуют в ремо-делировании белков соединительнотканного каркаса легких. За исключением ММП2 (желатиназы А), ММП - это индуцируемые ферменты, синтез которых, в частности, регулируется цитокинами [2]. Известно, что синтез ММП усиливается при гипоксическом, инфекционном и других типах повреждения тканей [10]. Эти ферменты необходимы клеткам для миграции в очаг воспаления [7], для антибактериальной защиты [14], наконец, ММП участвуют в ремоделировании межклеточного вещества [9]. Известно, что ММП выделяются из клеток в неактивной форме - в виде проферментов (проММП), активация которых происходит под действием активных ММП человека [13] и протеиназ бактерий [14]. В то же время протеолиз угнетается с помощью белков - ингибиторов протеиназ, в частности, тканевого ингибитора ММП1 (ТИМП1). Цистеиновые протеиназы нейтрофилов (катепсины) ингибируются цистатинами, в том числе цистатином С [16]. При достаточной концентрации ингибиторов протеиназ после устранения повреждающего агента формирование воспалительного инфильтрата и обновление соединительной ткани прекращаются [11, 15]. При дисбалансе
протеиназ и ингибиторов с преобладанием протеоли-тической активности деградация белков межклеточного матрикса продолжается и процесс приобретает хронический характер с возможным развитием эмфиземы легких [9]. По данным литературы, динамика соотношения протеолитических ферментов и их ингибиторов при различных неспецифических заболеваниях легких ранее не исследовалась. Поэтому представляет интерес сравнительный анализ содержания проММП1 и ингибиторов протеиназ в бронхоальвеолярном секрете (БС) пациентов с ХОБЛ, бронхиальной астмой (БА) и пневмонией во время пребывания их в стационаре.
Целью нашей работы было исследование проММП1, ТИМП1, цистатина С в БС при неспецифических заболеваниях бронхолегочной системы.
Материалы и методы. Исследованы образцы БАС, полученные во время фибробронхоскопии с процедурой бронхоальвеолярного лаважа в 1-е и 10-е сутки пребывания в стационаре городской клинической больницы № 70 Москвы 25 пациентов с заболеваниями легких; средний возраст больных 45 ± 15 лет. У 12 пациентов был диагноз ХОБЛ, у 5 - БА, у 7 - внебольничная пневмония. У всех пациентов на фоне стандартной терапии на 10-е сутки наблюдалось клиническое улучшение. Для оценки степени разведения БС определяли содержание мочевины в плазме крови и БАС кинетическим уреаз-ным глутаматдегидрогеназным методом в нашей модификации [3]. Концентрацию общего белка определяли по методу Бредфорд. Методом иммуноферментного анализа в БАС определяли содержание проММП1 с помощью набора реагентов R&D (США), ТИМП1 и цистатина С с помощью реагентов BioSourse (Бельгия). Статистическую обработку данных проводили методами непараметрической статистики в программе Statistica 6.0. Сопоставление показателей в группах ХОБЛ, БА, пневмонии проводилось с помощью критериев Краскелла-Уоллиса и Манна-Уитни. Попарное сравнение значений в связанных группах в 1-е и 10-е сутки пребывания в стационаре проводили по критерию Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты и обсуждение. Для сравнения содержания белков в разных образцах мы рассчитывали степень разведения БС по методу S. Rennard [12]. Согласно нашим данным, в 1-е сутки пребывания пациентов в клинике разведение БС в группах с ХОБЛ и пневмонией было статистически незначимо выше, чем у пациентов
Таблица 1
Содержание проММП1 (в мкг/л) в БС при неспецифических заболеваниях легких
Заболевание n Статистические показатели 1-е сутки 10-е сутки Р
X ± SD 1,62 ± 1,59 1,01 ± 0,89
ХОБЛ 12 Me 1,08 0,60 0,575
25%—75% 0,54-2,21 0,23-1,88
X ± SD 1,13 ± 0,81 0,40 ± 0,11
БА 5 Me 1,11 0,41 0,144
25%—75% 0,43-1,83 0,32-0,48
X ± SD 2,54 ± 1,54 1,08 ± 0,89
Пневмония 5 Me 2,99 0,84 0,465
25%—75% 1,53-3,55 0,40-1,31
Примечание. р - уровень значимости при попарном сравнении значений в 1-е и 10-е сут с помощью критерия Вилкоксона.
Таблица 2
Содержание ингибиторов протеиназ (в мг/л) в БС при различных заболеваниях легких
Заболевание Статистические показатели Цистатин С ТИМП1
1-е сутки 10-е сутки 1-е сутки 10-е сутки
X ± SD 5,49 ± 4,54 5,43 ± 4,47 6,27 ± 5,33 3,98 ± 2,78
ХОБЛ Ме 3,86 3,713 4,51 4,25
(п = 12)
25%—75% 1,66-10,11 2,24-8,73 2,89-7,54 1,45-5,22
X ± SD 3,11 ± 3,62 1,98 ± 0,99 1,95 ± 1,02 2,45 ± 0,75
БА Ме 2,11 2,298 2,27 2,45
(п = 5)
25%—75% 0,89-2,56 1,00-2,83 2,00-2,70 2,01-2,89
X ± SD 8,19 ± 4,47 14,09 ± 18,88 8,05 ± 5,38 14,63 ± 19,08
Пневмония Ме 8,99 7,69 9,97 8,65
(п = 7)
25%—75% 0,696-11,51 2,34-19,00 4,89-11,22 2,49-16,89
с БА (р = 0,117). На 10-е сутки это различие стало статистически значимым (р = 0,02), что можно объяснить снижением количества секрета у пациентов с ХОБЛ и пневмонией при угасании клинических симптомов и сохранением вязкого характера секрета у пациентов с БА. На 10-е сутки пребывания в стационаре разведение БС в составе БАС статистически незначимо снизилось в каждой группе пациентов. Вероятно, это объясняется тем, что при купировании воспаления количество секрета в воздухоносных путях уменьшается [4].
Для оценки уровня экспрессии ММП1 и ингибиторов протеолиза в легких при ХОБЛ, БА, пневмонии мы одновременно определяли содержание как предшественника ММП1 проММП1, так и потенциального ингибитора ММП1 - ТИМП1, а также ингибитора цистеи-новых протеиназ цистатина С.
Согласно доступным нам литературным данным, ранее не проводилось определение концентрации проММП1 в БАС человека. В результате нашего исследования выявлено, что содержание проММП1 в БС в 1-е сутки пребывания в стационаре было наибольшим у пациентов с пневмонией (различия статистически незначимы из-за малого количества данных; р = 0,468;
табл. 1). В этой же группе по сравнению с ХОБЛ и БА в БС определялась самая высокая концентрация ингибиторов протеиназ: цистатина С (р = 0,219) и ТИМП1 (р = 0,149) (табл. 2). На 10-е сутки у больных пневмонией концентрация проММП1 в БС снизилась в 3 раза, хотя и осталась выше, чем в других группах (р = 0,403), при этом содержание ингибиторов протеиназ (цистатина С и ТИМП1) осталось максимальным: р = 0,219 и р = 0,151 соответственно. Возможно, наблюдаемые тенденции связаны с тем, что при остром воспалительном процессе в легких при пневмонии регуляция интенсивности про-теолиза ингибиторами осуществляется наиболее эффективно.
Попарное сравнение показало, что на 10-е сутки пребывания в стационаре происходило статистически незначимое снижение в БС концентрации проММП1 у всех пациентов. Это снижение было наиболее выражено у пациентов с БА, у которых концентрация проММП1 снизилась с 1,11 мкг/л до 0,41 мкг/л (р = 0,144). В работах V. Lagente, В. Schaaf [11, 14] было показано, что мигрирующие в зону повреждения клетки крови выделяют значительное количество ММП при обострении воспаления, и тенденцию к снижению концентрации
1600-,
1400-
о 1200Ч ю
со
X X
О
X
¡5
и
=г
10008006004002000
1600 -,
246
336
203
534
БА ХОБЛ Пневмония
■ 1-е сутки ♦ 10-е сутки
Рис. 1. Удельная концентрация цистатина С (в нг на 1 г белка) в БС при неспецифических заболеваниях бронхолегочной системы.
2 с; аз ю
со
X
X
Е
БА ХОБЛ Пневмония
■ 1-е сутки ♦ 10-е сутки
Рис. 2. Удельная концентрация ТИМП1 (в нг на 1 г белка) в БС при неспецифических заболеваниях бронхолегочной си-
проММП1 в БС также можно связать с купированием воспаления на 10-е сутки пребывания пациентов в стационаре (см. табл. 1).
Содержание ингибиторов протеиназ при различных видах легочной патологии изменялось неодинаково. Если в бронхиальном секрете у пациентов с ХОБЛ содержание цистатина С (р = 0,722) и ТИМП1 (р = 0,798) на 10-е сутки пребывания в стационаре статистически значимо не изменилось по сравнению с их концентрацией в 1-е сутки, то у пациентов с БА концентрация ТИМП1 (р = 0,067) существенно увеличилась. У пациентов с пневмонией наблюдалась тенденция к повышению концентрации обоих ингибиторов протеиназ - как ТИМП1 (р = 0,144), так и цистатина (р = 0,138) (см. табл. 2). Итак, было выявлено отсутствие увеличения содержания ингибиторов протеиназ на 10-е сутки пребывания пациентов с ХОБЛ в стационаре в отличие от пациентов с другими заболеваниями.
Отличия стали еще заметнее при пересчете содержания ТИМП1 и цистатина С на 1 г белка. Полученные результаты показали, что при улучшении состояния здоровья у пациентов с пневмонией на 1-е сутки происходило незначимое повышение доли цистатина С (р = 0,285) и статистически значимое повышение доли ТИМП1 (р = 0,03) среди белков БС. У пациентов с БА также повысилось содержание как цистатина С (р = 0,144), так и ТИМП1 (р = 0,225). В то же время при ХОБЛ удельная концентрация цистатина С (р = 0,612) и ТИМП1 (р = 0,767) практически не менялась (рис. 1, 2).
Известно, что тканевые ингибиторы металлопро-теиназ связываются с молекулой активного фермента в соотношении 1:1 [13]. На основании этого с учетом молекулярной массы ТИМП1 и проММП1 рассчитано молярное соотношение этих белков в БС, характеризующее потенциальную ингибиторную способность. На 10-е сутки пребывания в стационаре молярное соотношение ТИМП1/проММП1 у пациентов с БА и пневмонией существенно выросло (критерий Вилкоксона, р = 0,068 и р = 0,067 соответственно). Напротив, у пациентов с ХОБЛ не наблюдалось изменения молярного соотношения ТИМП1/проММП1: р = 0,139 (рис. 3).
У больных пневмонией и БА на фоне снижения количества проММП1, отражающего уровень экспрессии гена данной металлопротеиназы, возрастало содержание ТИМП1, а у пациентов с ХОБЛ молярное соотношение ТИМП1/проММП1 осталось неизменным на 10-е сутки пребывания в стационаре.
Заключение. Результаты исследования содержания проММП1, ТИМП1 и цистатина С в БС пациентов с заболеваниями легких могут объяснить, почему наибольшая длительность госпитализации и количество осложнений отмечаются при ХОБЛ. Согласно полученным данным, при ХОБЛ в отличие от БА и пневмонии на 10-е сутки лечения после обострения заболевания не обнаружено существенного повышения содержания ингибиторов протеиназ. Выявленный дисбаланс ингиби-
■ 1-е сутки ♦ 10-е сутки
Рис. 3. Соотношение ТИМП1/проММП1 в БС при неспецифических заболеваниях бронхолегочной системы.
торов и проММП1 отражает отсутствие положительной динамики к этому сроку и свидетельствует о продолжающемся хроническом воспалении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Доценко В. Л., Спирина А. Я., Макинский А. И. и др. // Вопр. мед. химии. - 2000. - № 2.
2. Соловьева Н. И. // Биоорган. химия. - 1998. - Т. 24. - С. 217226.
3. Ткачев Г. А., Корецкая Н. А. // Сборник трудов 27-й итоговой науч. конференции молодых ученых МГМСУ - М., 2004. - С. 82.
4. Филиппов В. П. Бронхоальвеолярный лаваж при диффузных поражениях легких. - М., 2006. - С. 4.
5. Чучалин А. Г. // Пульмонология. - 2008. - № 2. - С. 5-14.
6. BayatS. et al. // Eur. Respir. J. - 2004. - Vol. 24. - P. 150-156.
7. BirrellM. A., Wong S., DekkakA. et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. -2006. - P. 741-750.
8. Chung K. F., Adcock I. M. // Eur. Respir. J. - 2008. - Vol. 31. - P. 1334-1356.
9. ImaiK., DalalS. S., ChenE. S. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med.
- 2001. - Vol. 163. - P. 786-791.
10. Kim J. H., SukM. H. et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol.
- 2006. - Vol. 291. - P. 580-587.
11. Lagente V., Manoury B. et al. // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2005. -Vol. 38. - P. 1521-1530.
12. RennardS. I. // Appl. Physiol. - 1986. - Vol. 60, N 2. - P. 532-538.
13. RussellR. E. K., CulpittS. V, DeMatos C. et al. // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 2002. - Vol. 26, N 5. - P. 602-609.
14. Schaaf B., Liebau C., Kurowski V. t al. // BMC Pulm. Med. - 2008. -Vol. 8. - P. 8-12.
15. Serveau-Avesque C., MartinoM. F., Herve'-Gre'pinet V. et al. // Biol. Cell. - 2006. - Vol. 98, N 1. - P. 15-22.
16. Takeyabu K., Betsuyaku T., Nishimura M. et al. // Eur. Respir. J. -1998. - Vol. 12, N 5. - P. 1033-1039.
17. Tetley T. D. // Chest. - 2002. - Vol. 121, N 5. - P. 156S-159S.
Поступила 28.12.10
