CC BY
24Органический синтез и биотехнология
УДК 577.352.27+577.352.42
Tatyana A. Grigoreva, Aleksandr V. Garabadzhiu, Vyacheslav G. Tribulovich
IN VITRO INVESTIGATION OF THE PERMEABILITY OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS
St Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia e-mail: rozentatiana@gmail.com
The method of quantification of biologically active compounds membrane permeability is described. The method is based on the use of artificial membranes and mainly used for assessment of permeability in general, but can be used to determine the substance's ability to permeate the blood-brain barrier. The paper discusses the importance of such parameters as the lipid membrane composition, the solubility of the tested compounds, the duration and the conditions of the experiment. Using the proposed method for the evaluation of substances ability to permeate the blood-brain barrier can not only reduce the complexity of the compound optimization, but also the time required for drug development.
Keywords: blood-brain barrier, permeability, РАМРА, artificial lipid membranes
DOI 10.15217/issn1998984-9.2016.33.41
Введение
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) представляет собой селективный фильтр, который позволяет питательным веществам проникать из кровеносного русла в мозг, и выводить продукты жизнедеятельности нервной ткани обратно в кровеносное русло. В случае лекарств, мишень которых находится в мозгу, преодоление ГЭБ является сложной задачей, поскольку основная роль барьера состоит в поддержании электролитного и биохимического гомеостаза мозга и, соответственно, затруднении проникновения чужеродных веществ в мозг Тем не менее, зачастую способность лекарственных препаратов преодолевать гематоэнцефалический барьер учитывается только на конечных стадиях разработки, в то время как отсев веществ с неудовлетворительными свойствами на ранних этапах представляется значительно более целесообразным, поскольку позволяет не только снизить трудоемкость оптимизации соединений, но и сократить время, необходимое для создания лекарственных препаратов.
Специфические свойства ГЭБ определяются особенностями строения: этот физиологический барьер
Т.А. Григорьева1, А.В. Гарабаджиу2, В.Г. Трибулович3
ИССЛЕДОВАНИЕ IN VITRO МЕМБРАНОТРОПНЫХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: rozentatiana@gmail.com
Исследуется метод количественного определения мембра-нотропности биологически активных соединений. Метод основан на использовании искусственных мембран и в основном применяется для общей оценки мембранотропности, однако может быть использован для определения способности веществ преодолевать гематоэнцефалический барьер. В работе рассмотрено значение таких параметров, как ли-пидный состав мембраны, растворимость исследуемых соединений, длительность и условия проведения эксперимента. Использование предлагаемого метода для оценки способности веществ преодолевать гематоэнцефалический барьер позволяет не только снизить трудоемкость оптимизации соединений, но и сократить время, необходимое для создания лекарственных препаратов.
Ключевые слова: гематоэнцефалический барьер, мем-бранотропность, РАМРА, искусственные липидные мембраны
образован эндотелиальными клетками, выстилающими микрососуды головного мозга, а также перицитами и астроцитами.
Проницаемость ГЭБ определяется в первую очередь эндотелиоцитами [1]. Эти клетки характеризуются слабым пиноцитозом, отсутствием просветов между клетками и особыми трансмембранными системами для транспорта биологически значимых веществ, функционирование такого транспорта возможно благодаря наличию в этих клетках большого числа митохондрий, поставляющих в виде АТФ энергию, необходимую для переноса веществ. В нормальных физиологических условиях эндотелиоциты создают механический барьер для доставки из крови в мозг растворенных веществ, электролитов и ксенобиотиков. Хотя плотные контакты между клетками предотвращают транспорт через межклеточное пространство, пассивная диффузия может идти через мембраны клеток [2-4].
Исследование проницаемости ГЭБ можно проводить на трех принципиально различных уровнях, моделирующих реальные условия:
1) непосредственное введение исследуемых субстратов в кровеносное русло животной модели с последующим определением его содержания в ткани мозга;
1 Григорьева Татьяна Алексеевна, аспирантка каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: rozentatiana@gmail.com Tatyana A. Grigoreva, PhD student, Department of Technology of Microbiological Synthesis SPIT(TU
2 Гарабаджиу Александр Васильевич, д-р хим.наук, проректор по научной работе профессор каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: gar-54@mail.ru
Aleksandr V. Garabadzhiu, Dr Sci. (Chem.), vice rector for scientific work, professor, Department of Technology of Microbiological Synthesis
3 Трибулович Вячеслав Генрихович, канд. хим. наук, ст. науч. сотр. НИЛ «Молекулярная фармакология», e-mail: tribulovich@gmail.com Vyacheslav G. Tribulovich, PhD (Chem.), senior research scientist, Laboratory of Molecular Pharmacology
Дата поступления - 25 января 2016 года
2) проведениеэкспериментов с использованием элементов ГЭБ (сосуды мозга, клеточные культуры и мембраны), в том числе смоделированных в лабораторных условиях;
3) компьютерное моделирование.
Наиболее применимыми в лабораторных
условиях являются методы, основанные на использовании отдельных элементов ГЭБ, которые позволяют воспроизвести реальные процессы и взаимодействия. Они значительно более доступны, производительны и просты по сравнению с животными моделями, хотя, конечно, в меньшей степени воспроизводят реальные условия.
Так, капилляры, выделенные непосредственно из мозга, сохраняют свои нативные свойства и при инкубации с флуоресцентно-мечеными лигандами позволяют определить распределение исследуемых соединений или, при необходимости, локализацию рецепторов и переносчиков, однако в этом случае необходимо проводить эксперименты непосредственно после выделения и трудоемкой процедуры очистки сосудов [2, 5].
Модели, основанные на использовании клеточных культур, позволяют достичь более высокой производительности чем капиллярные и с определенной достоверностью воспроизводить изменения проницаемости при внешних воздействиях или заболеваниях [2]. Однако, в этом случае необходимо соблюдать условия работы с живыми организмами и постоянно поддерживать клеточные линии, способные со временем терять исходные характеристики [4]. В исследованиях такого рода используют различные клетки животного происхождения [3, 6, 7], реже человеческие. Более того, поскольку в организме функциональность ГЭБ обеспечивает комплекс, образованный помимо эндотелиоцитов также астроцитами и перицитами, то для наиболее адекватного воспроизведения ГЭБ используют совместное культивирование различных типов клеток - это способствует экспрессии транспортных белков, а также поддерживает плотные клеточные контакты, характерные для in vivo условий [4].
Хотя для наиболее точного воспроизведения ГЭБ необходимо смоделировать плотные контакты между соседними клетками эндотелия и обеспечить функционирование механизмов транспорта, известно, что малые, неполярные, гидрофобные молекулы, к числу которых относятся многие потенциальные лекарства, способны проникать через ГЭБ, используя лишь пассивную диффузию [3]. Учитывая этот факт, на первых этапах разработки лекарств, когда приходится проводить скрининг большого количества веществ, можно значительно ускорить работу, используя модель без активного транспорта. Такой моделью является метод PAMPA (parallel artificial membrane permeability assay), основанный на применении искусственно сконструированных клеточных мембран. PAMPA наиболее активно используется для исследований доступности препаратов через желудочно-кишечный тракт и кожу, однако была разработана система на основе полярных липидов мозга свиньи, растворенных в додекане, позволяющая сравнивать вещества по способности преодолевать ГЭБ [8].
В данной работе описан подход, использованный для создания модели, отражающей барьерные свойства мембран эндотелиоцитов ГЭБ человека.
Оптимизация метода РАМРА
Конструкция для проведения анализов с использованием метода РАМРА представлена на рисунке 1.
Рисунок 1. Система для проведения анализа по методу РАМРА. 1 - донорный отсек, 2 - акцепторный отсек, 3 - крышка, 4 - ПВДФ-подложка.
Раствор фосфолипидов в додекане наносится на пористую мембрану верхнего (донорного) отсека. Его лунки заполняются растворами исследуемых соединений в смеси ДМСО/фосфатный буфер. Лунки нижнего (акцепторного) отсека заполняются фосфатным буфером. Собранный планшет помещается в термостат при непрерывном перемешивании. Спустя 16-24 ч по оптической плотности растворов в УФ-диапазоне определяют концентрацию вещества в акцепторном отсеке и рассчитывают величину logPe, отражающую эффективную проницаемость мембраны, по формуле:
logPe = log[ * -lnil-^1,
® L(VA+Va>S*T V с/J
где Vд - объем донорного отсека, см3, Vа - объем акцепторного отсека, см3, S - площадь поверхность мембраны, см2, T - время инкубации, мин, Са - концентрация вещества в акцепторном отсеке, мг/мл, C - равновесная концентрация вещества в суммарном объеме отсеков, мг/мл.
Продолжительность эксперимента как значимый параметр. В литературных источниках и рекомендациях производителей данные о временных промежутках, после которых производится измерение концентрации исследуемого соединения в акцепторном отсеке, достаточно сильно различаются. Очевидно, что значения, полученные при различной длительности эксперимента, сравнивать некорректно.
Для определения оптимальной длительности эксперимента, мы провели серию опытов: оптическую плотность растворов в акцепторных отсеках измеряли спустя 2, 4, 8, 16, 24 и 48 ч. Были использованы 16 производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона, которые обладают противораковой активностью за счет реактивации в клетках проапоптотического белка р53. Результаты представлены на рисунке 2.
Время, ч
Рисунок 2. Изменение оптической плотности растворов в зависимости от времени.
В ходе работы было установлено, что оптимальным интервалом для оценки мембранотропности является интервал в 16 ч, поскольку за меньшее время вещества не успевают в достаточных количествах преодолеть мембрану, при увеличении времени происходит снижение оптической плотности растворов.
Липидный состав искусственной мембраны как значимый параметр. Принципиальным вопросом при создании модели для исследования способности веществ преодолевать ГЭБ является выбор липидного состава, наносимого на ПВДФ-подложку.
Анализ литературных данных, проведенный нами для подбора состава липидной смеси, показал, что информация о строении ГЭБ человека носит обзорный характер. Так, наиболее частыми компонентами мембран являются фосфатидилхолин (ФХ) и фосфатидилэта-ноламин (ФЭ), кроме того было показано, что липидные экстракты мозга также богаты фосфатидилсерином (ФС) [9]. С другой стороны, состав мембран клеток, которые используются в ex vivo моделях, достаточно хорошо изучен - в таблице 1 приведены данные о клеточных линиях RBE-4 (клетки эндотелия мозга крысы), ECV304 (изначально рассматривались как эндотелиальные клетки пупочной вены человека, однако генотипирование показало, что это клональные производные клеточной линии Т24 - опухолевые клетки рака мочевого пузыря), С6 (крысиная глиома) и MDCK (клетки почки взрослой самки кокер-спаниеля). Для сравнения приведены данные об апикальных мембранах крыс, а также несколько искусственных моделей ГЭБ по материалам [9] и [10].
Таблица 1. Липидный состав (% г/г) биологических мембран клеток
RBE4 ECV 304 C6 MDCK BBM Sugano BBM Soy Egg
ФХ 18 26 28 22 20 27 24 73
ФЭ 20 17 17 29 18 27 18 11
ФС 13 8 15 15 6 7 - -
ФИ 6,5 6 5 10 7 7 12 1
КЛ 2 3 2 - - - - -
СФ 8 5 10 10 7 - - -
ТГ 1 3 1 1 - - - -
ЖК 3 4,5 3 1 - - - -
ХО 15 16 9 10 37 33 - -
ХЭ 14 12 11 - -
ФК - - - - - - - 4
ЛФХ - - - - - - - 5
ЛФИ - - - - - - - 2
Примечание: условные обозначения: ФХ - фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ФС - фосфатидилсерин, ФИ - фосфатидилинозитол, КЛ - кардиолипин, СФ - сфингомиелин, ТГ - триглицериды, ЖК - жирные кислоты, ХО - холестерин, ХЭ - эфиры холестерина, ФК - фосфатидная кислота, ЛФК - лизофосфатидилхолин, ЛФИ - лизофосфатидилинозит, Soy - соевый лецитин (20 %) и Egg - яичный лецитин (60 %).
Поскольку в различных рекомендациях производителей диапазон концентраций липидной смеси варьируется от 1 до 20 мг/мл, то для дальнейшего исследования нами были отобраны три варианта растворов в додекане:
1) 10 мг/мл фосфатидилхолина,
2) 2,52 мг/мл фосфатидилхолина + 6,62 мг/мл фосфатидилэтаноламина,
3) 2,52 мг/мл фосфатидилхолина + 6,62 мг/мл фосфатидилэтаноламина + 3,7 мг/мл фосфатидилсери-на.
Длительность эксперимента - 16 ч.
Структуры использованных соединений, а также расчетные значения параметров, отражающие их растворимость в водных средах (logS) и распределение в системе октанол-вода (1одР), представлены в таблице 2. В качестве контрольных использовали вещества с известной способностью преодолевать ГЭБ - кофеин, фу-росемид и леводопа. В ходе эксперимента пришлось исключить вещества, мало растворимые в фосфатном буфере.
Таблица 2. Исследованные производных индолинона и контрольные соединения с известной способностью преодолевать ГЭБ
Индекс Структура logs logP
R1 R2
1 XT— -5,67 5,33
2 xr— -7,17 6,18
3 HNP -4,94 4,42
4 N-r1 hnP w 0 -5,16 3,89
5 R2 Чз ЧЮ -4,71 3,61
6 -b ЧЮ' -4,71 3,84
7 .CO -6,03 5,43
8 43 Cl7 -5,49 4,11
9 OohI/^, о HO \Г 3 -4,2 2,59
10 .....OJO -5,54 5,28
К CH3 НзС о кофеин -0,97 -0,07
Ф O Cl y^ NH2 он фуросемид -3,66 2,03
L-допа O hoXT^ леводопа -1.78 -2.32
Полученные данные показали, что роль липидного состава варьируется в зависимости от исследуемых соединений. Так, в случае соединений с близкой структурой состав мембраны оказывает сходное влияние на проницаемость (рисунок 3), однако если структура исследуемых веществ различается значительно (1, 9 и 10), изменение липидного состава мембраны может оказывать разнонаправленное влияние на проницаемость. Наиболее чувствительным к составу мембраны оказалось сое-
динение 9, характерной структурной особенностью которого является наличие гидроксильных групп, способных образовывать водородные связи или участвовать в тауто-мерных равновесиях.
0,0000035
0,000003 0,0000025 0,000002 0,0000015 0,000001 0,0000005
0
II
J j
| Состав 1 I Состав 2 | Состав 3
ml пи
S'V'b V Ь fe Л <Ъ Л ®
Соединение
Рисунок 3. Значения Ре исследованных соединений, полученные с использованием мембран трех составов.
Известно, что леводопа преодолевает ГЭБ, тем не менее, полученные результаты показали, что вещество не способно преодолевать мембраны эндотелиоци-тов. Этот результат согласуется с литературными данными о том, что леводопа переносится в мозг с помощью специфической системы транспорта нейтральных аминокислот, а не путем пассивной диффузии [11]. Следует отметить отсутствие корреляции между значениями параметра 1одР, который зачастую применяют в качестве критерия для оценки мембранотропности соединений, и экспериментальными значениями, получаемыми при использовании метода РАМРА.
Из экспериментальных данных очевидно следует, что для задачи отбора веществ с очень низкой или очень высокой способностью преодолевать ГЭБ используемый липидный состав не играет существенной роли. Тем не менее, в большинстве случаев, при разработке лекарственных препаратов перед исследователем стоит задача выявления оптимального кандидата среди ряда соединений различной структуры, но с достаточно близкими физико-химическими свойствами, а в такой ситуации, как видно из диаграммы, использование одного состава может приводить к неверным выводам. Таким образом, для практических задач разработки лекарственных препаратов оптимальным представляется параллельное использование мембран нескольких составов.
Способ детекции как значимый параметр.
Стандартным методом определения количества вещества, диффундирующего через мембрану, является измерение оптической плотности растворов в лунках акцепторного отсека. Однако, в ходе исследования потенциальных лекарственных препаратов, исследуемые соединения зачастую модифицируются, в том числе путем введения флуоресцентной метки.
В работе использовались флуоресцентно-меченные молекулярно-импринтированные полимеры Fluor-EGFR ^Е), Fluor-Vanco (РУ), Fluor-Melamine ^М), К571-Уапсо (КУ). Растворы исследуемых веществ предварительно диспергировались: в течение 1 мин они встряхивались в шейкере, затем 2 мин обрабатывались ультразвуком. Обработка повторялась дважды, после чего эксперимент проводился по схеме со следующими изменениями:
- использовали один состав мембраны (состав
1);
- концентрацию веществ в акцепторных отсеках измеряли спустя 2, 4, 8 и 16 ч;
- для определения концентрации веществ измеряли флуоресцецию растворов с использованием мульти-модального ридера CLARIOstar (BMG LABTECH).
Результаты представлены на рисунке 4.
Соединение logPe
FE -4,8
FV -6,1
FM -6,3
KV -5,1
а)
б)
Рисунок 4. Определение способности молекулярно-импринтированных полимеров преодолевать мембраны с использованием флуоресценции в качестве метода детекции: а) значения logPe исследованных молекулярно-импринтированных полимеров ^ = 960 мин), б) временная зависимость концентрации исследуемого соединения в донорном отсеке.
В ходе работы было установлено, что в то время как Fluor-Melamine и Fluor-Vanco практически не диффундируют через мембрану, Fluor-EGFR и К571-Уапсо способны к этому в значительной степени.
Таким образом, метод детекции, основанный на измерении флуоресценции растворов может быть использован при оценке способности веществ преодолевать мембраны.
Заключение
Представленный в работе метод оценки способности веществ преодолевать липидные мембраны ГЭБ является универсальным, поскольку он, с одной стороны, применим к большому кругу веществ, а с другой, совместим с различными методами количественного определения веществ в растворе. Для получения наиболее полной информации о мембранотропности соединений целесообразно использовать несколько составов липид-ных мембран, а также определять временную зависимость концентрации вещества, преодолевшего мембрану. Критериями, определяющими применимость метода в конкретных случаях, являются а) способность исследуемых веществ в достаточной степени растворяться в водных растворах, б) размер возможных агрегатов, который не должен превышать размер пор ПВДФ-подложки (0,45 мкм).
Литература
1. Ueno M. Molecular anatomy of the brain endothelial barrier: an overview of the distributional features // Curr. Med. Chem. 2007. Vol. 14. P. 1199-206.
2. Naik P., Cucullo L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies // J. Pharm. Sci. 2012. Vol. 101. P. 1337-54.
3. Lee G., Dallas S., Bendayan R. Drug transporters in the central nervous system: brain barriers and brain parenchyma considerations // Pharmacol. Rev. 2001. Vol. 53. P. 569-96.
4. Cucullo L., Aumayr B., Janigro D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2005. Vol. 8. P. 89-99.
5. Bickel U. How to measure drug transport across the blood-brain barrier // NeuroRx. 2005. Vol. 2. P. 15-26.
6. Montermini D., Winlove C.P., Michel C.C. Effects of perfusion rate on permeability of frog and rat mesenteric microvessels to sodium fluorescein // J. Physiol. 2002. Vol. 543. P. 959-75.
7. Faller B. Artificial membrane assays to assess permeability // Curr. Drug Metab. 2008. Vol. 9. P. 886-92.
8. Di L., Kerns E.H., Carter G.T. High throughput artificial membrane permeability assay for blood-brain barrier // Eur. J. Med. Chem. 2003. Vol. 38. P. 223-32.
9. Avdeef A. Absorption and drug development: solubility, permeability, and charge state. John Wiley & Sons Inc., 2003. 287 p.
10. Krämer S.D., Hurley J.A., Begley D.J. Lipids in blood-brain barrier models in vitro I: Thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography for the analysis of lipid classes and long-chain polyunsaturated fatty acids // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2002. Vol. 38. P. 55765.
11. Kageyama T., Nakamura M., Matsuo A., Yama-saki Y., Takakura Y., Hashida M., Kanai Y., Naito M., Tsuruo T., Minato N., Shimohama S. The 4F2hc/LAT1 complex transports L-DOPA across the blood-brain barrier // Brain Res. 2000. Vol. 879. P. 115-21.
