CC BY
69
УДК 579.873.21:579.253.2
С.Н. Жданова О.Б. Огарков А.Н. Зарбуев 2, Л.С. Унтанова 2, Е.Д. Савилов 3
исследование генетического разнообразия MYCOBACTERIUM tuberculosis при сочетанной патологии с вич-инфекцией в восточно-сибирском регионе
1ФГБУ «Научный центр проблем семьи и репродукции человека» СО РАМН (Иркутск)
2 Республиканский клинический противотуберкулезный диспансер им. Г.Д. Дугаровой (Улан-Удэ)
3 ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования»
(Иркутск)
Проведено исследование 61 клинического штамма M. tuberculosis методом MIRU-VNTR по 12-ти локусам. Продемонстрировано преобладание генетической группы. Beijing (78,7 %) в популяции микобактерий, выделенных от больных с сочетанной инфекцией туберкулез—ВИЧ, проживающих на территории Иркутской области и республики. Бурятия. Множественная, лекарственная, устойчивость проявлялась у трети (34,4 %) изученных изолятов без существенного отличия, у представителей генотипа Пекин и не-Пекин.
Ключевые слова: M. tuberculosis, туберкулез, ВИЧ-инфекция, лекарственная устойчивость, генотип Пекин, MIRU-VNTR, SITVIT
GENETic poLYMoRpmsM of MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS iN pATiENTs wiTH tuberculosis and human immunodeficiency virus infection iN EAsTEN siBERiA
S.N. Zhdanova O.B. Ogarkov A.N. Zarbuev 2, L.S. Untanova 2, E.D. Savilov 3
1 Scientific Centre of the Family Health and Human Reproduction Problems, Siberian Branch, Russian
Academy of Medical Sciences, Irkutsk 2Republican Clinical TB Dispensary, Ulan-Ude
3 Irkutsk State Medical Academy of Continuing Education, Irkutsk
A total 61 randomly selected, strains of M. tuberculosis were genotyped by the 12 loci of MIRU-VNTR. It was shown the predominance of the Beijing genetic group (78,4 %) in population of mycobacterium, from the patients with tuberculosis and human immunodeficiency virus infection in Irkutsk region and Buryatia. Multidrug resistance was observed in 34,4 % of the studied, strains without significant differences among representatives of Beijing and. non-Beijing.
Key words: M. tuberculosis, HIV-infection, MIRU-VNTR, Beijing genotype, drug resistant, SITVIT
Некоторые из ключевых особенностей туберкулеза — хронический характер заболевания, и, как правило, предшествующая многие годы латентная инфекция, приобрели в современных условиях развития двух эпидемий — туберкулеза (ТБ) и ВИЧ-инфекции, новые черты. У ВИЧ-инфицированных эффективное сдерживание клинических проявлений туберкулеза во время латентного периода становится недостижимым вследствие непосредственного поражения клеток иммунной системы вирусом иммунодефицита человека. Это приводит как к сокращению латентного периода туберкулеза, так и повышению риска нового заражения на фоне падения защитных сил организма. У ВИЧ-инфицированных больных с низким числом CD4 Т-клеток быстро развивается активная форма туберкулеза [14].
Проблема распространения туберкулеза усугубляется тем, что происходит расширение группы риска заражения и распространения инфекции за счет наблюдаемого в настоящий момент преодоления границ концентрированной эпидемии ВИЧ-инфекции и выхода ее в общую популяцию на ряде территорий РФ, в том числе и Сибирском Федеральном округе, где лидирующую позицию занимает Иркутская область.
Резервуар микобактерий туберкулеза (МБТ), обеспечиваемый больными ко-инфекцией ТБ/ ВИЧ, неоднозначен. Значительное преобладание диссеминированных и распространенных форм ТБ у ВИЧ-инфицированных, по сравнению с ВИЧ-негативными больными ТБ, на фоне меньшей частоты и менее значительных размеров полостей распада при легочных формах может привести к тому, что активность передачи инфекта в этой специфической популяции может в целом остаться неизменной [9, 12]. Другая характерная черта — развитие множественной лекарственной устойчивости у больных ко-инфекцией ТБ/ВИЧ — повышает эпидемическое значение этой уязвимой группы в современном течении эпидемического процесса ТБ [23].
Современные исследования показали, что результат инфицирования и заболевания туберкулезом зависит от генотипа возбудителя и хозяина [13, 15]. При этом предполагается, что определенные генотипы МБТ могут иметь конкурентные преимущества среди ВИЧ-инфицированных. Целый ряд исследований показал, что штаммы генотипа Пекин, с которым связывают повышенные частоты резистентности к лекарственным средствам, стали эпидемическими за последние несколько
десятилетий на территории бывшего СССР [2, 6, 15], в том числе и в Восточно-Сибирском регионе [3]. На основании вышеизложенного, актуальным является изучение распространенности различных генотипов МБТ и оценки их лекарственной устойчивости среди больных ко-инфекцией ТБ/ВИЧ на территории эпидемиологического неблагополучия, что и явилось целью настоящего исследования.
материалы и методы
В анализ включен 61 случайно отобранный штамм МБТ, выделенный от больных (взрослые мужчины (42) и женщины (19) 21—49 лет) с различными формами легочного туберкулеза, сочетанными с ВИЧ-инфекцией (46 — от впервые выявленных пациентов, 13 — от хронических больных и 2 — больных с рецидивом), находившихся на лечении в противотуберкулезных диспансерах Иркутской области и Республики Бурятия (РБ) в 2010 — 2012 гг. ДНК собранных нами изолятов выделяли и генотипировали по 12 локусам MIRU-VNTR как описано ранее [1]. Для идентификации генетических семейств использовали открытые базы данных MIRU-VNTRplus [17] и SITVIT [128]. Анализ на наличие или отсутствие делеции RD105 в геноме МБТ осуществляли по методике, описанной M. Reed и соавт. [16]. Оценка лекарственной устойчивости в исследуемой выборке была осуществлена по результатам использования метода абсолютных концентраций.
Статистическую обработку данных проводили в редакторе электронных таблиц MS Excel
7.0 и пакете статистических программ «Statistica for Windows» (версия 6.0). Значимость различий между параметрами оценивали с помощью непараметрического критерия х2. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 [4].
результаты исследований
На основании скрининг-теста делеции RD105 в исследуемой выборке было обнаружено 78,7 % (48/61) представителей генотипа Beijing без значимого отличия среди впервые выявленных (80,4 % — 37 из 46 случаев), хронических и рецидивирующих (73,3 % — 11 из 14 случаев) больных туберкулезом с ВИЧ. Путем дальнейшей дифференциации штаммов с помощью MIRU-12 локусного типирования были обнаружены профили, свидетельствующие о циркуляции штаммов и других генетических семейств, большинство из которых были отнесены к известным: LAM (8,2 %), Ural (1,6 %), Т18 (1,6 %). Доля неклассифицированных штаммов среди изученных образцов составила 9,8 % (6/61). Применение MIRU — VNTR типирования позволило выявить неоднородность преобладающей группы штаммов, отнесенных к генотипу Пекин. Около половины (45,9 %) из них имели профили 223325153533 и 223325173533, классифицированные как Beijing MIT16 и Beijing MIT17 [19] соответственно. Сравнение других MIRU-профилей Beijing с базой данных SITVIT позволило определить присутствие более редких классифицированных образцов и
уникальных профилей. Описанный нами ранее [3] среди больных туберкулезом Бурятии профиль 223325173423 (MIT642) встречался как среди больных коинфекцией ТБ/ВИЧ из Бурятии, так и в Иркутской области — 6,6 % (4/61). Обнаружены также единичные изоляты с профилями, которые отсутствуют в базе SITVIT. Выявленные особенности преобладания и разнообразия представителей генотипа Beijing среди исследуемой группы больных свидетельствуют об эпидемическом распространении этих штаммов. Структура распределения изолятов, выделенных от больных ТБ/ВИЧ, носит сходный характер с полученными нами ранее результатами по территории Иркутской области и Республике Бурятия [3].
В исследуемой выборке треть (34,4 % — 21/61) составляли штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (одновременная резистентность к рифампицину и изониазиду) без значительного перевеса хронических больных ТБ — 40,2 % (6/15) по сравнению с впервые выявленными — 32,6 % (15/46). На этом фоне чувствительность сохраняли только 18,0 % (11/61) штаммов, выделенных от больных с новыми случаями ТБ. Распределения частот МЛУ среди штаммов генотипа «Пекин» и «не-Пекин» не имели отличия, как от общей выборки (х2 = 0,146; р = 0,703), так и в группах впервые выявленных и хронических больных с сочетанной патологией (х2 = 0,768; р = 0,375).
обсуждение
Условия ретроспективного сбора анамнестических данных пациентов не позволили нам выяснить, была ли у впервые выявленных больных первичная лекарственная устойчивость к основным противотуберкулезным препаратам в исследуемой группе пациентов, которая являлась бы доказательством повышенного риска заражения антибиотикоустойчивыми МБТ у ВИЧ-инфицированных. Тем не менее, мы предприняли попытку оценить общее влияние МЛУ среди больных ТБ/ВИЧ по данным нашей выборки. Оценка исходов пациентов с МЛУ ТБ свидетельствует, что две трети перестали быть бактериовыделителями (вследствие смертельного исхода болезни — 33,3 % (7/21) или эффективного курса лечения — 33,3 % (7/21)), а у трети больных стационарный курс лечения был либо закончен, либо прерван с наличием бактериовыделения. На фоне этого, по нашим данным, стационар покинули
41,0 % (25/61) ВИЧ-позитивных бактериовыделите-лей МБТ, четвертая часть из которых (7/25) — носители МЛУ. Насколько большую эпидемическую опасность несут эти больные, оценить однозначно сложно.
Заразность ВИЧ/ТБ-инфицированных пациентов по сравнению с ВИЧ-отрицательными лицами была предметом многих исследований, которые, однако, дали противоречивые результаты. Эти данные, как внутрибольничные, так и внебольнич-ные, были объединены в мета-анализе M. Cruciani с соавт., который заключил, что случаев повторного заражения туберкулезом в целом среди ВИЧ-
инфицированных пациентов было ни больше, ни меньше, чем среди ВИЧ-отрицательных больных [19]. Результаты другого исследования позволили выявить, что при домашних контактах с ВИЧ-отрицательными случаев повторного заражения было больше по сравнению с контактами с ВИЧ/ ТБ-инфицированными в Рио-де-Жанейро [2].
Рядом авторов считается, что в некоторых ситуациях, ВИЧ-инфицированные пациенты с легочными заболеваниями могут передавать МБТ меньше, чем ВИЧ-неинфицированные больные. Эти предположения построены на том, что лица с сочетанной инфекцией ВИЧ/ТБ не в состоянии поддерживать туберкулезную инфекцию, в основном, потому что ВИЧ истощает CD4 T-клетки, которые необходимы для активации макрофагов и гранулема-образования [14]. Возможно, ВИЧ-инфицированные менее заразны, потому что в их мокроте содержится меньше бактерий за счет редуцированных полостей распада. Кроме того, из-за отсутствия иммунитета, средняя скорость прогрессирования заболевания у ВИЧ/ТБ-инфицированных ускоряется по отношению к больным туберкулезом, которые являются ВИЧ-отрицательными. Следовательно, у ВИЧ/ТБ пациентов клинические и рентгенологические признаки проявляются раньше [12]; и у них более короткий период, в течение которого они заразны до начала лечения, поэтому должны иметь, следовательно, меньше возможностей для распространения.
При этом следует иметь ввиду, что, при легочном туберкулезе существует положительная связь между вирулентностью и активностью передачи, которая связана с образованием полостей, более часто приводящих не только к усилению бактери-овыделения, но к смерти пациента с коинфекцией [10]. В то же время, туберкулезный менингит или внелегочный туберкулез, более характерные для ВИЧ-инфицированных, представляют собой тупиковый путь для передачи бактерий [8], т.е. MБТ штаммы, которые приводят к смертельным исходам, считаются более опасными, но эти штаммы теряют возможность эффективной передачи.
Другой оценкой опасности больных коинфекцией ТБ/ВИЧ, как резервуара МБТ, служит определение разнообразия генотипов, которые, поражая иммуннокомпрометированных людей, могут расширить свои биологические ниши. Это подтверждают наблюдения из исследования, проведенного в Сан-Франциско, где выявлена повышенная вероятность заражения MБТ среди разных генетических линий у ВИЧ-инфицированных лиц, чем ВИЧ-отрицательных лиц [21]. В другой работе обнаружено, что генетическое разнообразие MБТ изолятов в обеих группах пациентов было одинаковым [11]. Последние данные согласуются с материалами, полученными нами в настоящей работе.
Обнаруженное абсолютное превалирование штаммов генотипа Beijing, представленного неоднородной группой МШи — VNTR вариантов, отражает общую обстановку циркулирующих в Восточно-Сибирском регионе МБТ. Со штаммами этого генотипа связывают способность предраспо-
лагать к приобретению устойчивости к лекарственным препаратам, обеспечиваемых мутациями [6]. Тем не менее, доказательства повышения частоты мутаций штаммов Пекин до сих пор отсутствуют [22]. К тому же, следует учитывать, что данные об относительной трансмиссивности МЛУ штаммами по сравнению с лекарственно-чувствительными штаммами неоднозначны [7]. Лекарственно-устойчивые штаммы могут быть меньше размером, чем полностью чувствительные штаммы [7]. И, вместе с тем, в некоторых районах мира, таких как страны бывшего Советского Союза, где распространенность МЛУ особенно высока, МЛУ штаммы MБТ весьма успешны, и среди них преобладают штаммы генотипа Beijing [2, 23]. Одним из возможных объяснений служит то обстоятельство, что MDR штаммы достаточно длительно циркулируют в этих регионах, произошла компенсационная эволюция [5], которая облегчает начальный дефицит размеров бактерий.
Таким образом, выявленное преобладающее распространение штаммов генотипа Beijing среди больных ТБ/ВИЧ коинфекцией носит неоднозначный характер, требующий настороженного внимания специалистов и исследователей. Успешность распространения эпидемических штаммов этого генотипа на фоне высоких показателей первичной и приобретенной антибиотикорезисте-ности МБТ и расширения группы риска заражения за счет значительного увеличения числа ВИЧ-инфицированных создали весомые предпосылки для сохранения устойчивого резервуара этой опасной инфекции в регионе.
литература
1. Молекулярное типирование штаммов микобактерий туберкулеза в Иркутской области (Восточная Сибирь) в 2000 — 2005 гг. / О.Б. Огарков [и др.] // Молекулярная медицина. — 2007. — № 2. — С. 33-38.
2. Савилов Е.Д., Синьков В.В., Огарков О.Б. Пекинский генотип M. tuberculosis // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2010. — № 4. — С. 50 — 53.
3. Характеристика лекарственно устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis с помощью молекулярно-генетических методов / С.Н. Жданова [и др.] // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). — 2011. — № 6. — С. 228 — 230.
4. Эпидемиологический анализ: Методы статистической обработки материала / Е.Д. Савилов [и др.]. — Новосибирск : Наука-Центр, 2011. — 156 с.
5. Andersson D.I., Hughes D. Antibiotic resistance and its cost: is it possible to reverse resistance? // Na. Rev. Microbiol. — 2010. — Vol. 8. — P. 260 — 271.
6. Borrell S., Gagneux S. Infectiousness, reproductive fitness and evolution of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. —
2009. — Vol. 13. — P. 1456—1466.
7. Cohen T., Sommers B., Murray M. The effect of drug resistance on the fitness of Mycobacterium tuberculosis // Lancet Infect. Dis. — 2003. — Vol. 3. — P. 13—21.
8. Extrapulmonary tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection / R.W. Shafer [et al.] // Medicine (Baltimore). — 1991. — Vol. 70. — P. 384-397.
9. Flynn J.L., Chan J. Immunology of tuberculosis // Annu. Rev. Immunol. — 2001. — Vol. 19. — P. 93—129.
10. Helke K.L., Mankowski J.L., Manabe Y.C. Animal models of cavitation in pulmonary tuberculosis // Tuberculosis (Edinb). — 2006. — Vol. 86. — P. 337 — 348.
11. Human T cell epitopes of Mycobacterium tuberculosis are evolutionarily hyperconserved / I. Comas [et al.] // Nat. Genet. — 2010. — Vol. 42. — P. 498 — 503.
12. Human immunodeficiency virus and the prevalence of undiagnosed tuberculosis in African gold miners / Corbett E.L. [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2004. — Vol. 170. — P. 673 — 679.
13. Infection with Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains is associated with polymorphisms in SLC11A1/NRAMP1 in Indonesian patients with tuberculosis / R. van Crevel [et al.] // J. Infect. Dis. — 2009. — Vol. 200. — P. 1671 — 1674.
14. Kwan C.K., Ernst J.D. HIV- and tuberculosis: a deadly human syndemic // Clin. Microbiol. Rev. — 2011. — Vol. 24. — P. 351 —376.
15. «Lethal» combination of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype and human CD209-336G allele in Russian male population /O. Ogarkov [et al.] // Infection, Genetics and Evolution. — 2012. — Vol. 12. — P. 732 — 736.
16. Major Mycobacterium tuberculosis Lineages Associate with Patient Country of Origin / M. Reed
[et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2009. — Vol. 47 (4). — P. 1119—1128.
17. MIRU-VNTRplus: a web tool for polyphasic genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria / T. Weniger [et al.] // Nucleic Acids Res. —
2010. — Vol. 38. — P. 326 — 331. — http://www.miru-vntrplus.org
18. SITVITWEB — A publicly available international multimarker database for studying Mycobacterium tuberculosis genetic diversity and molecular epidemiology / C. Demay [et al.] // Infect. Genet. Evol. — 2012. — Vol. 12(4). — P. 755 — 766. — http:// www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_0NLINE/ index.jsp
19. The impact of human immunodeficiency virus type 1 on infectiousness of tuberculosis: a metaanalysis / M. Cruciani [et al.] // Clin. Infect. Dis. — 2001. — Vol. 33. — P. 1922—1930.
20. Transmission of Mycobacterium tuberculosis to contacts of HIV-infected tuberculosis patients / A.C. Carvalho [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2001. — Vol. 164. — P. 2166 — 2171.
21. Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis/ S. Gagneux [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. — 2006. — Vol. 103. — P. 2869 — 2873.
22. Werngren J., Hoffner S.E. Drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype does not develop mutation-conferred resistance to rifampin at an elevated rate // J. Clin. Microbiol. — 2003. — Vol. 41. — P. 1520—1524.
23. WHO. Global tuberculosis control — surveillance, planning, financing. — Geneva, Switzerland: WHO; 2010.
Сведения об авторах
Жданова Светлана Николаевна - к.м.н., старший научный сотрудник ФГБУ «Научный центр проблем семьи и репродукции человека» СО РАМН (664025, Иркутск, Карла Маркса, 3; тел. (3952) 333425, e-mail: svetnii@mail.ru)
Огарков Олег Борисович - к.б.н., заведующий лабораторией ФгБу «Научный центр проблем семьи и репродукции человека» СО РАМН (664025, Иркутск, Карла Маркса, 3)
Зарбуев Антон Найданович - к.м.н., главный врач Республиканского клинического противотуберкулезного диспансера им. Г.Д. Дугаровой
УнтановаЛариса Семеновна - к.м.н., заведующий организационно-методическим отделом Республиканского клинического противотуберкулезного диспансера им. Г.Д. Дугаровой
Савилов Евгений Дмитриевич - д.м.н., профессор, заведующий кафедрой ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» (664079, г. Иркутск, м-н Юбилейный, 100)
