CC BY
38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
УДК 579.873.21:579.253.2
С.Н. Жданова, О.Б. Огарков, Л.А. Степаненко, А.А. Лац, В.В. Синьков, Л.С. Унтанова,
Г.И. Алексеева, Е.Д. Савилов
ПРИМЕНЕНИЕ ДЕЛЕЦИОННОГО АНАЛИЗА ПО RD105 ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ПЕКИН MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Институт эпидемиологии и микробиологии Научного центра проблем семьи и репродукции человека СО
РАМН (Иркутск)
Иркутский областной противотуберкулезный диспансер (Иркутск) Республиканский клинический противотуберкулезный диспансер (Улан-Удэ)
НПЦ «Фтизиатрия» РС (Якутия) (Якутск)
В работе было исследовано 284 штамма M. tuberculosis, выделенных в Иркутской области, Республиках Бурятия, и Саха (Якутия) в 2009—2010 гг. Изучаемая, популяция МБТ Восточно-Азиатской линии (152 штамма) включала наиболее распространенные штаммы, семейства Beijing М2 и М11, которые составили, две трети случаев. Применение делеционного анализа по RD105 позволило подтвердить принадлежность ранее полученных MIRU-VNTR профилей к генотипу Пекин, и описать ряд уникальных паттернов.
Ключевые слова: M. tuberculosis, MIRU-VNTR, RD105, пекинский генотип
THE DELETION ANALYSIS OF RD105 IS A USEFUL TOOL IN THE EVALUATION OF BEIJING STRAINS OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
S.N. Zhdanova, O.B. Ogarkov, L.A. Stepanenko, A.A. Laz, V.V. Sinkov, L.S. Untanova,
G.I. Alekseyeva, E.D. Savilov
Institute of Epidemiology and Microbiology SB RAMS, Irkutsk Irkutsk Regional TB Dispensary, Irkutsk Republican TB Dispensary, Ulan-Ude SPC “Phthisiology” Sakha Republic (Yakutia), Yakutsk
A total 284 isolates of M. tuberculosis was collected, and studied, in Irkutsk region, Republic Buryatia and Republic Sakha (Yakutia) during 2 years (2009—2010). The East-Asian lineage of Mycobacterium, tuberculosis (152 isolates) included, the most common strains of the Beijing family, M2 and. M11, which accounted, for two thirds of cases. RD105 deletion, analysis allowed, to confirm, previously obtained. MIRU-VNTR profiles as Beijing genotype and. describe a number of unique patterns.
Key words: M. tuberculosis, MIRU-VNTR, RD105, epidemic strain
В последнее десятилетие в Восточной Сибири сложилась крайне неблагоприятная ситуация по туберкулезу и изыскание новых, более эффективных методов клинико-эпидемиологической диагностики инфекции для оптимизации мер противодействия эпидемии, стало важнейшей задачей для всего региона. Одним из наиболее перспективных направлений в этой области является применение молекулярно-биологических методов для изучения структуры популяции и путей распространения микобактерий туберкулеза (МБТ), особенно эпидемиологически опасных штаммов, а также исследование эволюции штаммов для оценки динамики изменений вирулентности, в том числе и лекарственной устойчивости.
В последние годы все большее признание и практическое применение находят результаты
работ, посвященных изучению разнообразия, которое существует среди клинических изолятов МБТ. Для облегчения сравнительных исследований, направленных на расшифровку влияния полиморфизма штаммов МБТ на исход туберкулезной инфекции, требуются однозначные и легко интерпретируемые методы классификации. В качестве весьма эффективного средства классификации штаммов МБТ на сегодняшний день может быть использован метод определения полиморфизмов больших последовательностей (large sequence polymorphisms — LSPs), в частности, регионов различий (RDs), которые представляют собой ряд наиболее точно охарактеризованных уникальных элементов полиморфизма (делеции) [5,9]. Метод молекулярного типирования LSP (RD 105) используется специально для выявления при-
надлежности к Восточно-Азиатской линии МБТ, к которым относят и семейство сполиготипов Пекин (W/Beijing) [6, 12]. С этим генотипом связывают развитие ряда неблагоприятных тенденций (утяжеление клинического течения за счет диссеми-нации и генерализации инфекционного процесса, более частое развитие внелегочных форм, усиление лихорадочного синдрома в ответ на терапию, множественная лекарственная устойчивость и др.), характерных для современного течения туберкулеза [3, 7, 11].
В течение последних 10 лет на территории Иркутской области нами проводились исследования генетического полиморфизма штаммов МБТ с помощью MIRU-VNTR генотипирования [2] для пополнения имеющейся базы данных. В настоящее время этот метод рекомендован ВОЗ и Европейским Центром по борьбе с туберкулезом как основной метод для стандартных молекулярноэпидемиологических исследований в практике эпидемиологического надзора за туберкулезом [1]. В основе MIRU-VNTR генотипирования лежит определение числа тандемных повторов в микобак-териальном геноме с помощью ПЦР. Метод легко воспроизводим и пригоден для широкомасштабных эпидемиологических исследований с целью классификации штаммов МБТ и установления взаимосвязи генетических маркеров с другими клинико-эпидемиологическими факторами. Однако для выявления пандемического генотипа Пекин при этом подходе требуется поставить не менее 12 ПЦР, в то время как с помощью делеционного анализа по регионам различий (RD) будет достаточно одной реакции [12].
Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка сопоставимости результатов двух методов генотипирования (делеционного анализа по RD105 и MIRU-VNTR типирования) для определения структуры эпидемически значимых штаммов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали результаты MIRU-VNTR типирования и делеционного анализа по RD105 284 штаммов МБТ, выделенных от больных легочными формами туберкулеза и проживающих на территориях Иркутской области, Республик
Бурятия (РБ) и Саха (Якутия) (РС (Я)). Собранные нами за 2009 — 2010 гг. изоляты генотипировали по 12 локусам согласно протоколу Supply et al. [10] с детекцией ПЦР электрофорезом в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере. Для идентификации генетических семейств использовали открытую базу данных и пакет программ MIRU-VNTRplus [12]. Анализ на наличие или отсутствие делеции RD105 в геноме МБТ осуществляли по методике, описанной M. Reet et al. [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Штаммы МБТ, относящиеся к ВосточноАзиатской линии, включающей генотип Пекин (Beijing), на изучаемых территориях, как и в других регионах России [2, 3], были доминирующими, о чем свидетельствуют следующие результаты молекулярно-эпидемиологического скрининга. Среди исследуемых культур обнаружено 152 (53,5 %) изолятов, имеющих делецию в RD105 со значимым перевесом в Иркутской области (67,7 %) и РБ (65,2 %) по сравнению с РС (Я) (35,2 %) (х2 = 7,96; p < 0,005) (табл. 1). Выявленная разница может быть связана с региональными особенностями распространения штаммов этой генетической группы, которые требуют дальнейшего изучения.
Всего было обнаружено 32 различных MIRU VNTR-профиля в группе с делецией в RD105, среди которых 21 (13,8 %) были уникальными (встречались единичные штаммы в выборке). При этом доля наиболее часто встречающихся подтипов Beijing М2 и М11, согласно Mokrousov
I. et al., (2004), не имела значимых территориальных вариаций, и составляла в общем 35,5 % (М2) и 28,3 % (М11).
Среди изолятов МБТ Иркутской области встречались некоторые единичные профили Пекинского генотипа (М1, М4, М7, М8, М18, М19, М21, М33, М44, М75), не обнаруженные, ни в РБ, ни в РС (Я). С другой стороны, единичные штаммы М12, М54, М107 были характерны только для РС (Я) (см. табл. 1). Также были описаны уникальные профили MIRU-VNTR клинических штаммов МБТ с делецией в RD105 (табл. 2). Среди штаммов из РБ в шести случаях определен профиль 223325173423.
Таблица 1
Распределение клинических штаммов MБТ с делецией в RD105
Территории/ штаммы Пекинский генотип; n (%) Уникальные профили
М2 М11 М1, М4, М7, М8, М18, М19, М21, М33, М44, М75 М12, М54, М107 М14, М40, М87 М2+М11
Иркутская область, 40 23 19 0,0 3 1 4
п = 90, 67,7 % (44,4) (25,6) (21,1) (3,3) (1,1) (4,4)
Республика Саха (Якутия), п = 43, 35,2 % 10 (23,3) 14 (32,6) 0,0 3 (7,0) 8 (18,6) 0,0 8 (18,6)
Республика Бурятия, 4 6 0,0 0,0 0,0 0,0 9
п = 20, 69,0 % (21,0) (31,6) (47,4)
Общая, 54 43 19 3 11 1 21
п = 153, 53,9 % (35,5) (28,3) (12,5) (2,°) (7Л (0,7) (13,8)
Таблица 2
Уникальные профили MIRU-VNTR клинических штаммов MБТ с делецией в RD105
Территории Профили
223325173333
Иркутская область 223325113433
223325113533
223326153533
222325173523
223125153224
233325153433
Республика Саха 323325153433
323325153533
323325173533
323325173633
Республика Бурятия 223315173533
224325153533
Следует также отметить, что RD105 маркер служит для идентификации Восточно-Азиатской линии штаммов, которая включает две сублинии, в том числе штаммы семейства сполиготипов Beijing [5]. В дополнение к делеции в RD105, классические штаммы W /Beijing также имеют уникальную делецию в RD207, приводящую к потере спейсеров 1-34, что характерно именно для этого семейства сполиготипов [4]. Кроме того, со штаммами RD 207 связывают повышенную частоту развития хронических случаев туберкулеза [6]. Поэтому дальнейшим этапом нашей работы станет сопоставление результатов исследований различных RD для более углубленной классификации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучаемая популяция МБТ Восточно-Азиатской линии, включающей генотип Пекин (Beijing), оказалась гетерогенна. Наиболее распространенные штаммы семейства Beijing М2 и М11 составили две трети случаев, что указывает на их ведущую роль в эпидемии туберкулеза в Восточно-Сибирском регионе.
Определение RD105 позволило охарактеризовать не только весь массив MIRU-VNTR профилей, отнесенных к генотипу Пекин, но и описать ряд уникальных паттернов. Таким образом, применение двух описанных методов типирования (деле-ционный анализ по RD105 и MIRU-VNTR геноти-пирование) позволяет провести классификацию эпидемически значимых штаммов (генотип Пекин), уточняющую пространственную структуру популяции МБТ. Самостоятельно RD105 делеционный анализ может использоваться как для первичного эпидемиологического скрининга, так и для выявления высокопатогенных штаммов генотипа Пекин в клинических целях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ежегодное совещание Европейской сети эпиднадзора за ТБ в Европе г. Дубровник, Хорватия, 25 — 26 мая 2009 г. // http://www.euro.who.
int/___data/assets/pdf_file/0020/68204/E92976R.
pdf.
2. Огарков О.Б. и др. Молекулярное типирова-ние штаммов микобактерий туберкулеза в Иркутской области (Восточная Сибирь) в 2000 — 2005 гг. // Молекулярная медицина. — 2007. — № 2. — С. 33-38.
3. Савилов Е.Д., Синьков В.В., Огарков О.Б. Пекинский генотип M. tuberculosis // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2010. — № 4. — С. 50 — 53.
4. Flores L. et al. Large sequence polymorphisms classify Mycobacterium tuberculosis Strains with ancestral spoligotyping patterns // J. Clin. Microbiol. — Oct. 2007. — P. 3393 — 3395.
5. Gagneux S. et al. Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103. — 2006. — P. 2869 — 2873.
6. Kato-Maeda M. et al. Differences among sublineages of the East-Asian lineage of Mycobacterium tuberculosis in genotypic clustering // Int. J. Tuberc. Lung Dis. — 2010. — Vol. 14 (5). — P. 538 — 544.
7. Lopez B. et al. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes // Clin. Exp. Immunol. — 2003. — Vol. 133. — P. 30 — 37.
8. Mokrousov I. et al. Analysis of the allelic diversity of the mycobacterial interspersed repetitive units in Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing family: practical implications and evolutionary considerations // J. Clin. Microbiol. — 2004. — Vol. 42 (6). — P. 2438 — 2444.
9. Reed M. et al. Major Mycobacterium tuberculosis Lineages Associate with Patient Country of Origin. // J. Clin. Microbiol. — 2009. — Vol. 47 (4). — P. 1119—1128.
10. Supply P. et al. Automated high-throughput genotyping for study of global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis based on mycobacterial interspersed repetitive units // J. Clin. Microbiol. — 2001. — Vol. 39 (10). — P. 3563 — 3571.
11. Tsenova L. et al. Virulence of selected Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in the rabbit model of meningitis is dependent on phenolic gly-colipid produced by the bacilli // J. Infect. Dis. — 2005. — Vol. 192. — P. 98—106.
12. Tsolaki A.G. et al. Genomic deletions classify the Beijing/W strains as a distinct genetic lineage of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. — 2005. — Vol. 43. — P. 3185 — 3191.
13. Weniger T. et al. MIRU-VNTRplus: a web tool for polyphasic genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria // Nucleic Acids Res. — 2010. — Vol. 38, Suppl. — P. W326 — 331. — http://www. miru-vntrplus.org
Сведения об авторах
Жданова Светлана Николаевна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (664025, г Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел.: (3952) 33-34-25; e-mail: svetnii@mail.ru) Огарков Олег Борисович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторным отделением ГУЗ «Иркутский областной противотуберкулезный диспансер» (664047, г. Иркутск, ул. Терешковой, 59; тел. (3952) 38-72-61; e-mail: obogarkov@ yandex.ru)
Степаненко Лилия Александровна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел.: (3952) 33-34-25; e-mail: stepli@mail.ru)
Лац Анна Александровна - младший научный сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел.: (3952) 33-34-25; e-mail: hh0413@yandex.ru)
Синьков Вячеслав Владимирович - аспирант Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел.: (3952) 33-34-25; e-mail: vsinkov@gmail.com)
УнтановаЛариса Семеновна - кандидат медицинских наук, зав. орг. отделом ГУЗ Республиканский клинический противотуберкулезный диспансер (670004, г. Улан-Удэ, ул. Д-Батожабая)
Алексеева Галина Ивановна - д.м.н., зав. бактериологической лабораторией (677005, г. Якутск, ул. Алексеева, 93, Государственное учреждение «Научно-практический центр «Фтизиатрия» мЗ РС (Я)»; тел. (4112)33-52-21; e-mail: agi_nik@mail.ru) Савилов Евгений Дмитриевич - доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией эпидемиологии антропонозных инфекций Институт эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3; тел. (3952) 33-34-23; e-mail: savilov47@gmail.com)
