CC BY
55
1
ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ 77
>- УДК 616.314.13-073.524:535.37:546.621/623 S. Yu. Vasilchenko1, A. I. Volkova1, S. B. Korovin1, V B. Loschenov1, M. L. Sinyaeva2, Ad. A. Mamedov2, E. A. Luk'yanets3, S. G. Kuzmin4 INVESTIGATION OF ALUMINIUM PHTHALOCYANINE NANOPARTICLES FLUORESCENCE PROPERTIES IN TOOTH ENAMEL MICRODAMAGES 1NSC GPIRAS, Moscow 2I. M. Setchenov MMA, Moscow 3SRC "NIOPIK", Moscow 4ISCC"Intermedbiophyschim", Moscow ABSTRACT The possibility of fluorescence diagnostics application of tooth enamel microdamages with the use of water-insoluble aluminium phthalocyanine nanoparticles was studied. The investigation of aluminium phthalocyanine fluorescence intensity increasing in enamel microdamages has been carried out. The effect of aluminium phthalocyanine fluorescence enhancement in tooth microdamages was found out. Key words: fluorescence diagnostics, fluorescence, tooth enamel, nanoparticles, aluminium phthalocyanine. С. Ю. Васипъченко1, А. И. Волкова1, С. Б. Коровин1, В. Б. Лощеное1, М. Л. Синяееа2, Ад. А. Мамедов2, Е. А. Лукъянец3, С. Г. Кузъмин4 ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ СВОЙСТВ НАНОЧАСТИЦ ФТАЛОЦИАНИНА АЛЮМИНИЯ В МИКРОПОВРЕЖДЕНИЯХ ЭМАЛИ ЗУБА 1ЦЕНИ ИОФ РАН, Москва 2ММА им. И.М. Сеченова, Москва 3ФГУП "ГНЦ "НИОПИК", Москва 4ГУП "МНКЦ "Интермедбиофизхим", Москва РЕЗЮМЕ Изучена возможность применения флюоресцентной диагностики микроповреждений эмали зуба с использованием наночастиц водонерастворимого фталоцианина алюминия. Проведено исследование динамики роста интенсивности флюоресценции фталоцианина алюминия в микроповреждениях эмали. Обнаружен эффект разгорания флюоресценции фталоцианина алюминия в микроповреждениях. Ключевые слова: флюоресцентная диагностика, флюоресценция, эмаль зуба, наночастицы, фталоцианин алюминия. ВВЕДЕНИЕ разования, т.н. эмалевые призмы. Микроповреждения Диагностика микроповреждений эмали зуба имеет эмали характеризуется изменением состава, формы, большое значение в современной стоматологии для размеров и взаимной ориентации кристаллов апати-предупреждения развития кариеса, т. к. зачастую тов [1]. именно такие микроповреждения являются предшест- В современной клинической стоматологии ис-венниками кариеса. пользуют следующие методы диагностики раннего ка-Минеральную основу эмали составляют кристал- риеса и повреждений эмали зуба: визуальный осмотр лы апатитов — гидроксиапатита (до 75%), карбонапа- полости рта, зондирование, витальное окрашивание тита, фторапатита, хлорапатита и др., которые, в свою эмали специальными красителями, такими, как мети-очередь, формируют более крупные структурные об- леновый синий. Но эти методы не предназначены для ч
№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1
диагностики микроповреждений эмали, а способны выявить лишь повреждения достаточно больших размеров или кариес в стадии «белого пятна». К существенным недостаткам методов можно отнести также субъективность и отсутствие количественной оценки результатов.
Исходя из того, что в микроповреждениях эмали накапливается патологическая микрофлора, можно проводить аутофлюоресцентную диагностику, преимуществом которой является возможность количественной оценки. Однако поскольку естественные флюоресцентные свойства микрофлоры выражены, как правило, слабо, этот метод оправдывает себя лишь в случаях достаточно большого количества микрофлоры в микроповреждении и часто не дает возможности точной диагностики. Для решения этой проблемы в качестве маркеров для обнаружения патологически измененных участков поверхности зуба было предложено использовать другие естественные или синтетические флюорофоры, имеющие более высокую эффективность флюоресценции [3; 4].
Целью настоящего исследования было изучение возможности применения флюоресцентной диагностики микроповреждений эмали зуба с использованием в качестве маркера наночастиц водонерастворимого фталоцианина алюминия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Взвесь водонерастворимого фталоцианина алюминия, размеры кристаллов которого составляли 0,1-200 мкм, подвергали ультразвуковой диспергации (15 мин, мощность 70 Вт). Размеры полученных наночастиц составляли 50-200 нм. Важно отметить, что ни взвесь фталоцианина алюминия, ни полученный коллоидный раствор наночастиц не флюоресцировали при возбуждении в красном диапазоне спектра, хотя в мономолекулярной форме, например, при использовании органических растворителей, эффективность флюоресценции этого вещества достаточно высока.
Для флюоресцентных измерений использован волоконно-оптический спектрометр ЬЕ8А-01-«Вю$рес». Возбуждение флюоресценции осуществляли с помощью Ие-№ лазера (длина волны излучения 632,8 нм). Подробно система описана в работе [2].
Для апробации метода использовались зубы различной групповой принадлежности, удаленные по клиническим показаниям. Сначала исследовали поверхность зуба с помощью оптического микроскопа для выявления участков с микротрещинами эмали и неповрежденной эмалью, затем измеряли спектры аутофлюоресценции выбранных участков. Далее коллоидный раствор наночастиц ватным тампоном втирали в эмаль зуба в течение 15 с, после чего измеряли спектры флюоресценции.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Первая часть эксперимента выполнена на удаленных зубах. На рис. 1 представлены спектры аутофлюоресценции. Видно, что интенсивность аутофлюорес-
Рис. 1. Спектры аутофлюоресценции, измеренные в зонах микроповреждения и неповрежденной эмали
ценции в зоне микроповреждения практически равна интенсивности флюоресценции в нормальной зоне.
На рис. 2 видны спектры флюоресценции, измеренные непосредственно после нанесения наночастиц. Отношение интенсивностей флюоресценции фталоцианина алюминия в зонах эмали с микроповреждениями и неповрежденной эмали равно 1,6.
Ч
Рис. 2. Спектры флюоресценции, измеренные непосредственно после нанесения наночастиц
На рис. 3 показаны спектры флюоресценции, измеренные через 15 мин после нанесения наночастиц.
Рис. 3. Флюоресценции, измеренные через 15 мин после нанесения наночастиц
Видно значительное увеличение флюоресценции в зоне микроповреждения; в зоне неповрежденной эмали также увеличилась интенсивность флюоресценции, но гораздо меньше, так что отношение интенсивностей флюоресценции фталоцианина алюминия в зонах эмали с микроповреждениями и неповрежденной эмали составило 2,3.
Последнее измерение было произведено через 5 дней после нанесения наночастиц (рис. 4). Флюоресценция в зоне микроповреждения еще более увеличилась, увеличение в зоне неповрежденной эмали незначительно. Отношение интенсивностей флюоресценции фталоцианина алюминия в зонах эмали с микроповреждениями и неповрежденной эмали достигло 7,1.
Рис. 5. Динамика повышения интенсивности флюоресценции фталоцианина алюминия в зонах эмали с микроповреждениями и неповрежденной эмали
Для выяснения того, необходимо ли использование фталоцианина алюминия именно в виде наночастиц, был проведен эксперимент по нанесению на поверхность зуба взвеси фталоцианина алюминия (размер кристаллов 0,1-200 мкм), которая использовалась
нами как исходное соединение для приготовления наночастиц. Измерения были проведены через 15 мин после нанесения взвеси. Наблюдалась значительно более слабая, чем в случае использования наночастиц, флюоресценция, которая может быть связана с наличием во взвеси наноразмерной фракции фталоцианина алюминия. Отношение интенсивностей флюоресценции фталоцианина алюминия в зонах эмали с микроповреждениями и неповрежденной эмали (1,3) в данном случае также оказалось значительно ниже, чем при использовании наночастиц (2,3).
Проведены исследования in vivo. Пациенту на поверхность зуба наносили коллоидный раствор наночастиц и через 15 мин измеряли спектры флюоресценции. На рис. 6 представлены спектры флюоресценции, измеренные в ходе эксперимента. Значительного увеличения интенсивности флюоресценции с течением времени в данном случае не наблюдается, т. к. наночастицы вымываются слюной и уже через 40 мин практически не детектируются, однако достигаемого через 15 мин значения отношения интенсивностей флюоресценции фталоцианина алюминия в зонах эмали с микроповреждениями и неповрежденной эмали (1,9) достаточно для уверенной диагностики микроповреждений эмали.
Рис. 4. Спектры флюоресценции, измеренные через 5 дней после нанесения наночастиц
Из обобщенных диаграмм по динамике роста флюоресценции (рис. 5) ясно, что за 5 дней флюоресценция в области микроповреждения увеличилась в 7,4 раз, в неповрежденном участке эмали — в 1,7 раз.
Рис. б. Спектры флюоресценции, измеренные in vivo через 15 мин после нанесения наночастиц. Отношение интенсивностей флюоресценции фталоцианина алюминия в зонах эмали с микроповреждениями и неповрежденной эмали составляет 1,9
Возможны следующие механизмы, обеспечивающие увеличение интенсивности флюоресценции наночастиц фталоцианина алюминия в микроповреждениях эмали зуба. Микроповреждения эмали характеризуются увеличением пространства между эмалевыми призмами. Наночастицы после попадания в такие увеличенные межпризменные пространства удерживаются там в течение длительного времени ван-дер-вааль-совыми и/или ионными силами. Эти же силы вызывают отделение молекул фталоцианина алюминия от наночастиц, приводя тем самым к повышению интенсивности флюоресценции. Также возможно взаимодействие между наночастицами и различными органи-
ческими субстанциями, обладающими поверхностно-активными свойствами (полисахаридами, аминокислотами и др.), концентрация которых повышена в микроповреждениях эмали, что также приводит к отделению молекул фталоцианина алюминия и как следствие увеличивает интенсивность флюоресценции.
В пользу первого механизма свидетельствует появление и увеличение интенсивности флюоресценции раствора наночастиц фталоцианина алюминия при добавлении в него обладающих развитой поверхностью наночастиц гидроксиапатита размером 5-10 нм (данные не представлены).
Второй механизм подтверждается результатами экспериментов по исследованию оптических свойств коллоидного раствора наночастиц при добавлении в него поверхностно активных веществ (ПАВ): в спектре поглощения раствора при наличии ПАВ появляется характерный для фталоцианинов пик в красной области. Также наблюдалось появление флюоресценции раствора наночастиц при добавлении в него ПАВ.
Наиболее вероятна реализация двух описанных механизмов одновременно, однако и в том, и в другом случае необходимо, чтобы наночастицы проникали внутрь микроповреждения эмали зуба. Это объясняет значительно более низкую интенсивность флюоресценции при нанесении на поверхность зуба взвеси фталоцианина алюминия с размером кристаллов
0,1-200 мкм, чем в случае использования наночастиц фталоцианина алюминия размером 50-200 нм. Такая зависимость результатов от размеров используемых кристаллов фталоцианина алюминия, возможно, позволит, применяя наночастицы различных размеров, проводить дифференциальную диагностику различных стоматологических заболеваний, характеризующихся изменением структуры эмали.
Увеличение интенсивности флюоресценции вследствие включения наночастиц в метаболическую цепь микроорганизмов, присутствующих в микроповреждениях эмали, представляется маловероятным,
т. к. сравнение результатов, полученных при использовании удаленных зубов, подвергнутых антибактериальной обработке, и зубов, не прошедших таковую, не выявило существенных качественных и количественных различий между результатами.
ВЫВОДЫ
Изучены возможности применения флюоресцентной диагностики микроповреждений эмали зуба с использованием наночастиц водонерастворимого фталоцианина алюминия. Наблюдалось увеличение интенсивности флюоресценции фталоцианина алюминия в микроповреждениях эмали, что может быть использовано для диагностики микроповреждений. Показано, что наблюдаемые эффекты зависят от размеров используемых наночастиц фталоцианина алюминия, что, возможно, позволит, применяя наночастицы различных размеров, проводить дифференциальную диагностику различных стоматологических заболеваний, сопровождаемых изменением структуры эмали.
ЛИТЕРАТУРА
1. Боровский Е. В., Леонтъев В. К. Биология полости рта. — М.: Медицина, 1991. — 304 с.
2. Лощенов В. Б., Стратоников А. А., Волкова А. И., Прохоров А. М. Портативная спектроскопическая система для флюоресцентной диагностики опухолей и контроля за фотодинамической терапией // Российский Химический Журнал. — 1998. — Т. XLII, № 5. — С. 50-53.
3. Loschenov V. B., Konov V. I., Prokhorov A. M. Photodynamic Therapy and Fluorescence Diagnostics // Laser Physics. — 2000. — Vol. 10, №6. — P. 1188-1207.
4. Sinyaeva M. L., Mamedov Ad. A., Vasilchenko S. Yu. et al. Fluorescence Diagnostics in Dentistry // Laser Physics. — 2004. — Vol. 14, № 8. — P. 1132-1140.
Поступила 28.04.2006.
