CC BY
38
УДК 616.314.17-008.1-07:535.37
M.L. Sinyaeva1, Ad.A. Mamedov1, V.V. Levkin1, S.S. Kharnas1, V.B. Loschenov2, V. V. Agafonov2, S. Yu. Vasilchenko2, A.I. Volkova2, A.N. Berezin3, G.L. Kiselev3
INVESTIGATION OF AUTOFLUORESCENCE AND ALA- INDUCED PROTOPORFIRINIX FLUORESCENCE OF ORAL CAVITY MICROFLORA AT INFLAMMATORY PARODONTIUM TISSUES DISEASES
1 Moscow Medical Academy 2General Physics Institute 3Moscow of Radio Engineering, Electronics and Automation
ABSTRACT
During the last several years research, activities have been carried out to study the fluorescent images of hard tooth tissues and demineralization enamel. Also it is well known about availability of photodynamic therapy (PDT) for pathogenic microflora suppression, which presence leads to different parodontium diseases. Our laboratory carried out research of images and spectra autofluorescent and fluorescent ALA- induced protoporfírin IX of different parodontium tissues in order to develop the methods of fluorescent diagnostics and PDT of inflammatory parodontium tissues diseases.
Keywords: fluorescent diagnostics, photodynamic therapy, 5-aminolelaevulinic acid, autofluorescence, parodontium diseases, microflora.
М.Л. Синяева1, Ад.А. Мамедов1, В.В. Левкин1, С.С. Харнас1, В.Б. Лощеное2, В В. Агафонов2, С.Ю. Васильченко2, А.И. Волкова2, А.Н. Березин3, Г.Л. Киселев3
ИССЛЕДОВАНИЕ АУТОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ И ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ АЛК-ИНДУЦИРОВАННОГО ТТРОТО! ЮРФИРИНАIX МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ТКАНЕЙ
ПАРОДОНТА
‘ММА им. И. М. Сеченова 2ЦЕНИ ИОФ РАН 3МИРЭА
РЕЗЮМЕ
В течение последних нескольких лет проводятся научные исследования, целью которых является изучение полученных флюоресцентных изображений твердых тканей зуба и очагов деминерализации эмали. Также имеются данные о возможности фото динамической терапии для подавления патогенной микрофлоры, наличие которой приводит к различным воспалительным заболеваниям тканей пародонта. Были проведены исследования изображений и спектров аутофлюоресценции и флюоресценции АЛК-индуцированного протопорфирина IX микрофлоры полости рта при воспалительных заболеваниях тканей пародонта с целью создания метода флюоресцентной диагностики и возможности последующей фотодинамической терапии.
Ключевые слова: флюоресцентная диагностика, фотодинамическая терапия, 5-аминолевулиновая кислота, аутофлюоресценция, заболевания пародонта, микрофлора.
ВВЕДЕНИЕ
Все более широкое распространение находит метод флюоресцентной диагностики (ФД) и фотодина-мической терапии (ФДТ) для лечения различных воспалительных, инфекционных и онкологических заболеваний с использованием препаратов-фотосенсибилизаторов (ФС). Суть этого метода заключается в том, что пациенту вводится препарат, который преимущественно накапливается в патологических тканях. Впоследствии проводится облучение ткани светом определенного диапазона длин волн селективно поглощаемого ФС. Посредством фотохимических реакций, включающих молекулярный кислород, присутствующий в тканях и ФС, играющий роль катализатора этих реакций, пораженные ткани селективно разрушаются. В качестве фотосенсибилизаторов используются препараты Фотосенс, Фотогем, а также 5- аминоле-вулиновая кислота (Аласенс, ФГУП «НИОПИК», Россия), являющаяся предшественником фотосенсибилизатора протонорфирина IX (ППIX). По своему существу 5-AJIK не является флюорохромом, это — эндогенное вещество, превращающееся в результате серии ферментативных реакций в ПП IX и в последующем в гем. ПП IX, в свою очередь, обладает высокой способностью к флюоресценции, являясь одновременно фототоксичным[1; 2; 3; 7].
В настоящее время флюоресцентные изображения твердых тканей зуба и тканей пародонта с целью диагностики и контроля за эффективностью лечения получают с помощью высокочувствительных приборов, например, таких, как QLF-I (Quantitative Light-induced Fluorescence), QLF-II [4; 8; 9], DIAGNOdent [5; 6].
Были проведены исследования изображений и спектров аутофлюоресценции и флюоресценции АЛК-ин-дуцированного протопорфирина IX микрофлоры полости рта при воспалительных заболеваниях тканей пародонта с целью создания метода ФД и возможностью последующей ФДТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для проведения исследований была создана установка LLSF-3 и разработан метод получения аутофлюоресцентных изображений тканей пародонта. Установка LLSF-3 включает в себя:
• HE-NE лазер (А=632.8 нм), плотность мощности— 10 мВт/см2 — для возбуждения флюоресценции в красном диапазоне спектра и металлогалоидный источник света—для возбуждения флюоресценции в ультрафиолетовом и синем диапазонах спектра;
• чувствительную камеру, оснащенную фильтрами для наблюдения аутофлюоресценции;
• систему, подводящую равномерное излучение к тканям пародонта.
Для оценки интенсивности флюоресценции твердых тканей зуба и десны был разработан специальный многоволоконный оптический катетер, позволяющий получать не только спектр люминесценции, но и изображение во флюоресцентном свете.
Кроме созданного прибора, для получения и последующего анализа флюоресцентных изображений использовались:
1. Светодиодный источник ЦБРН-675-01«Биоспек». Флюоресценция возбуждалась диодной матрицей, состоящей из 40 светодиодов. Длина волны излучения— 405 нм. Плотность мощности —10 мВт/см2. В качестве принимающего устройства излучения использовалась камера \¥а!ес 902Н чувствительностью 0,0003 Лк.
Фильтрами служили широкополосные фильтры КС-10: поглощение 300-570 нм, пропускание 570-2700 нм; КС-18: поглощение 300-660 нм, пропускание 660-2700 нм; ОС-17: поглощение 300-460 нм, пропускание 460-2700 нм.
2. Видеофлюоресцентное устройство УФФ-675-01 «Биоспек». Длина волны 675 нм. Пропускание фильтра 425-570 нм. Плотность мощности — 40 мВт/см2.
3. №:УАО лазер (вторая гармоника, Х-532 нм). Плотность мощности—10 мВт/см2.
Для измерения спектров флюоресценции использовалась лазерная электронно-спектральная установка ЛЭСА-01-«Биоспек» (НЕ-ИЕ лазер, А,=632,8 нм).
Аутофлюоресцентная диагностика была проведена 10 пациентам. Из них — 5 пациентов с катаральным гингивитом, 3—с пародонтитом легкой степени тяжести и 2 — с пародонтитом средней степени тяжести. В качестве контроля были обследованы 5 пациентов без видимых клинических признаков воспаления («условно здоровые»). Интенсивность аутофлюоресценции оценивалась по флюоресцентным изображениям и спектрам флюоресценции. Оптический катетер располагали на различных участках полости рта с целью получения флюоресцентного изображения, а также спектров аутофлюоресценции микрофлоры зубного налета и тканей пародонта.
Для исследования флюоресценции АЛК-индуциро-ванного ПП IX проводились аппликации препарата Аласенс 5 пациентам (2 с катаральным гингивитом, 2 — с пародонтитом легкой и 1 — с пародонтитом средней степени тяжести) в дозе, эквивалентной 20 мг на 1 кг веса за 40 мин до проведения ФД. Степень накопления ПП IX оценивалась по интенсивности его флюоресценции. В качестве контроля были обследованы 5 пациентов без видимых клинических признаков воспаления («условно здоровые»).
Спектры измеряли по наружной поверхности зубов и десны. Были взяты 6 позиций (рис. 1,1 — 6) от режущего края зуба до проекции верхушки корня зуба на десну. Измерения проводились также в области межзубных сосочков десны (рис. 1, 7). Обозначения зубов соответствуют классификации ВОЗ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты наших исследований показали, что интенсивность аутофлюоресценции и флюоресцентное изображение при использовании метода флюоресцентной диагностики соответствует диагнозам, поставленным на основании традиционных клинических и лабораторных методов исследования.
Интенсивность аутофлюоресценциимикрофлорызуб-ного налетаитканейпародонтау пациентов контрольной группы была значительно ниже, чем у пациентов с воспалительными заболеваниями тканей пародонта, что подтверждает имеющуюся клиническую картину.
Рис. 1. Позиции измерения спектров рофлоры полости рта. Длина волны возбуждения
405 нм. Использовался фильтр ОС-17
Рис. 2. Пациент В. Флюоресцентное изображение мик- Рис. 5. Пациент В. Флюоресцентное изображение микрофлоры полости рта. Длина волны возбуждения рофлоры полости рта. Длина волны возбуждения 405 нм. Использовался фильтр КС-10 632,8 нм. Использовался фильтр КС-18
Рис. 3. Пациент В. Флюоресцентное изображение микрофлоры полости рта. Длина волны возбуждения 405 нм. Использовался фильтр КС-18
Рис. 6. Пациент В. Флюоресцентное изображение микрофлоры полости рта. Длина волны возбуждения 532 нм. Использовался фильтр КС-18
#
Рис. 7. Пациент В. Флюоресцентное изображение микрофлоры полости рта. Получено с помощью 1Х8Р-3
Рис. 10. Пациент М. Флюоресцентное изображение микрофлоры полости рта. Длина волны возбуждения
632.8 нм. Использовался фильтр КС-18
Рис. 11. Пациент Ь. Флюоресцентное изображение микрофлоры полости рта. Длина волны возбуждения 632.8 Рис. 8. Пациент С. Флюоресцентное изображение микро- нм‘ Использовался фильтр КС-18 флоры полости рта. Дпина волны возбуждения 675 нм
Рис. 9. Пациент А. Флюоресцентное изображение микрофлоры полости рта. Длина волны возбуждения 675 нм
Флюоресцентные изображения зубов и тканей па-родонта представлены на рис. 2 — 11.
Спектры аутофлюоресценции твердых тканей зуба и пародонта приведены на рис. 12 —15. Пик на длине волны 632,8 нм—рассеянное лазерное излучение, широкий пик на длинах волн 650-800 нм—аутофлюоресцентное излучение. Из рис. 12 видно, что интенсивность аутофлюоресценции межзубного сосочка в области 31-41 зубов превышает норму в 27 раз. Это объясняется наличием воспалительного процесса в пародонте.
При возбуждении аутофлюоресценции с помощью ирРН-675-01 контрастность между флюоресценцией области пораженной десны, зуба и нормальной ткани максимальна при использовании КС-18 и минимальна при ОС-17. Это объясняется тем, что при использовании данных фильтров в приемник попадают не только флюоресцентные изображения области пораженной десны, зуба и нормальной ткани, но и отраженный свет источника. Однако при использовании КС-18 интенсивность света, проникшего сквозь фильтр, гораздо
Рис.12. Пациент В. Спектры флюоресценции десны. Получено с помощью ЛЭСА-01 — «Биоспек»
Рис.13. Пациент В. Спектры флюоресценции зуба и десны (зуб 31). Получено с помощью ЛЭСА-01 - «Биоспек»
Длинаволны, нм
Рис.14. Пациент М. Спектры флюоресценции зуба и десны (зуб 41). Получено с помощью ЛЭСА-01 - «Биоспек»
Рис.15. Пациент М. Спектры флюоресценции десны. Получено с помощью ЛЭСА-01 - «Биоспек»
Длина волны, нм
Рис. 16. Накопление АЛК-индуцированного 1111IX в десне через 40 мин после аппликации Аласенса
Длина волны, нм
Рис. 17. Накопление АЛК-индуцированного ППIX в шейке зуба через 40 мин после аппликации Аласенса
меньше интенсивности флюоресценции, поэтому контрастность максимальна. При использовании КС-10 поверхность эмали кажется более глянцевой, чем при использовании КС-18, т.к. в приемник попадает более коротковолновое излучение, отражающееся от поверхности. Фильтр КС-18 блокирует такое излучение.
При возбуждении НЕ-МЕ лазером и устройством УФФ-675-01 «Биоспек» отсутствует флюоресценция эмали зуба, но отчетливо видна флюоресценция мшфофлоры.
Излучение Мс1:УАО лазера инициирует флюоресценцию и микрофлоры и эмали.
На рис. 16-18 приведены спектры флюоресценции
Рис.
Длина волны, нм
18. Накопление АЛК-индуцированного ИМ IX в межзубном сосочке через 40 мин после аппликации Аласенса
АЛК-индуцированного ПП IX. Пик на длине волны
632,8 нм — рассеянное лазерное излучение, широкий пик на длинах волн 650-800 нм — флюоресцентное излучение ПП IX. Из приведенных спектров видно, что накопление АЛК-индуцированного ПП IX у пациента L в десне и межзубном сосочке в 2 раза выше, чем у пациента В (рис. 17,18). В шейке зуба накопление АЛК-индуцированного ПП IX у пациента L в 2 раза ниже, чем у пациента В (см. рис. 18). Это связано с различной локализацией микрофлоры полости рта, накапливающей ПП IX, и соответствует поставленным диагнозам. Пациент В наблюдался в клинике с диагнозом локализованный катаральный гингивит, а пациент L—с диагнозом пародонтит легкой степени тяжести. Характерными особенностями данных заболеваний является превалирующее наличие патогенной микрофлоры зубного налета в первом случае—в шейке зуба, а во втором— в мягких тканях пародонта.
ВЫВОДЫ
Методы аутофлюоресцентной и АЛК-индуциро-ванной диагностики могут оказаться эффективным и для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний тканей пародонта различной степени тяжести, а также как экспресс-метод контроля за эффективностью лечения.
Созданный прибор LLSF-3 «Биоспек» может быть эффективным для выявления одновременно очагов поражения тканей пародонта и твердых тканей зуба.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лощеное В.Б., CmpamoHHUKoe A.A., Волкова А.И., Прохоров А.М. Портативная спектроскопическая система для флюоресцентной диагностики опухолей и контро-
2.
3.
4.
6.
7.
9.
ля за фотодинамической терапией // Российский Химический Журнал. — 1998. — Т. XLII, № 5. — С. 50-53. Рыбин В. К. Дифференциальная диагностика хирургических заболеваний легких с помощью флюоресцентной спектроскопии: Дисс.... канд. мед. наук. -М., 1993. Харнас С. С., Дадвани С. А., Заводное В.Я., Охотникова Н.Л. Использование фотосенсибилизатора Аласенс в дифференциальной диагностике заболеваний желудка: Материалы III Всероссийского симпозиума по фотодинамической терапии, 1999. — С. 96-101.
Bennett Т. Amaechi, Susan М. Higham. Use of Quantitative Light-induced Fluorescence to monitor tooth whitening, In Lasers in Dentistry VII, Peter Rechmann, Daniel Fried, Thomas Hennig, Editors, Proceedings of SPIE. — 2001,—Vol. 4249.
Danilo Duarte, Yara Piarengeli Claudio Fonseca, Fatima Zanin, Aldo Brugnera Junior. Deciduos Teeth Occlusal Caries Detection with 655 nm Diode Laser Confirmed by Surface Scanning Electron Microscopy, In Lasers in Dentistry VI, John D. B. Featherstone, Peter Rechmann, Daniel Fried, Editors, Proceedings of SPIE. — 2000. — Vol. 3910. Fatima Zanin, Antonio Pinheiro, Dilma Helena Souza Campos, Aldo Brugnera Junior, Jesus Djalma Pecora. Caries diagnosis using laser fluorescence, In Lasers in Dentistry VI, John D. B. Featherstone, Peter Rechmann, Daniel Fried, Editors, Proceedings of SPIE. — 2000. — Vol. 3910. Loschenov V. B., Konov V. I., Prochorov A. M. Photodynamic therapy and fluorescence diagnostics // Laser Physics. — 2000. — Vol. 10(6). — P. 1188-1207. Masatoshi Ando, Mostafa Analoui, Bruce Schemehorn, George Stookey. Comparison of light-induced and laser-induced fluorescence methods for the detection and quantification of enamel demineralization, Part of the SPIE Conference on lasers in Dentistry V San Jose. California January 1999 SPIE. — Vol. 3593.
Takamori K., Hokari N., Okumura Т., Watanabe S. Detection of occfusal caries under sealants by use of a laser fluorescence system // J. Clin. Laser Med. Surg. — 2001, —Oct 19. —P. 267-271.
