CC BY
166
ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ ПРИ ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ
Е.А. КУЗНЕЦОВА, к. ф.-м. н., доцент кафедры физики МГУЛа
В статье приведены основные результаты исследований флуоресцентных и других биофизических характеристик листьев высших растений при физиологических и более высоких температурах на разных стадиях развития. Предложен новый метод исследования состояния фотосинтетического аппарата растений - метод термограмм флуоресценции.
Введение
Фотосинтез представляет собой важнейший биоэнергетический процесс, обеспечивающий существование всего живого на Земле. Поэтому выяснение механизмов фотосинтеза является одним из основных вопросов современной биофизики и имеет большое научное и практическое значение. Важнейшую роль в фотосинтезе играют фо-тофизические процессы, происходящие в мембранах хлоропластов листьев растений при поглощении света. Эти процессы световой стадии фотосинтеза начинаются с поглощения кванта света молекулой хлорофилла, после чего энергия электронного возбуждения мигрирует к реакционным центрам, возбуждение которых приводит к разделению зарядов и инициирует цепь дальнейших превращений энергии света с получением в темновой стадии конечных продуктов фотосинтеза - углеводов. Из-за несовершенства процессов захвата и использования энергии возбуждения в реакционном центре часть этой энергии теряется путем теплового рассеяния и излучения света в виде люминесценции, основными составляющими которой являются флуоресценция и послесвечение. Флуоресценция происходит до разделения зарядов в реакционном центре, т.е. практически одновременно с освещением, а послесвечение (замедленная люминесценция) возникает после разделения зарядов при их рекомбинации в реакционном центре, т.е. при вторичном возбуждении молекул хлорофилла через некоторое время после освещения [1].
Измерения флуоресценции и послесвечения являются бесконтактными, высокочув-
ствительными и безынерционными. С их помощью получают важную информацию о световых стадиях фотосинтеза, наблюдают за локальными изменениями в хлоропластах листьев растений в момент действия экстремального фактора. Изменение флуоресценции и послесвечения листьев позволяет диагностировать физиологическое состояние растения и определять его устойчивость к различным неблагоприятным условиям.
Исследованием флуоресценции и послесвечения листьев при обычных и повышенных температурах автор занимается на кафедре физики МГУЛа с 1978 г. [2]. Это исследование выполнялось в сотрудничестве с физическим и биологическим факультетами МГУ им. М.В. Ломоносова. Часть работы была выполнена совместно с Высшим лесотехническим институтом в Болгарии (г. София). Основные результаты этих исследований [2-13] приведены ниже.
Экспериментальные установки
Исследования были выполнены на двух флуориметрических установках, радиоспектрометре Е-4 фирмы Уапап (США), спектрофлуориметре фирмы НіїасЬі, спектрофотометре Бресогс! и установке для измерения термо люминесценции.
Основная часть результатов получена на многофункциональной флуориметриче-ской установке, созданной автором в 1980 г. [3]. Эта установка содержит фосфороскоп в виде неподвижного цилиндра 1 (рис. 1) с тремя окнами, внутри которого вращается полый цилиндр 2 с двумя парами щелей. В центре фосфороскопа в прозрачной плоской кювете расположен исследуемый объект (ИО). При совмещении окон подвижного и
неподвижного цилиндров объект освещается то мощным действующим светом (ДС) с интенсивностью 2-100 Вт/м2, то слабым возбуждающим светом (ВС) с интенсивностью 0,01-0,03 Вт/м2. Частота сигналов ДС и ВС
равна 40-80 Гц. Каждый импульс ВС дополнительно модулировался с частотой 2,4 кГц с помощью модулятора М в виде вращающегося диска с прорезями.
Рис. 1. Схема установки для исследования флуоресценции и послесвечения: ВС - источник возбуждающего света; ДС - источник действующего света; ИО - исследуемый объект; Л] и Л2 - кварцевые линзы; Л3 - конденсор с тепловым водяным фильтром; Фь Ф2, Фз - стеклянные светофильтры; ДЗ - делительное зеркало; ФП - фотоприемник; У - усилитель; СД - синхронный детектор; Д - линейный детектор; РБ - разностный блок; КСП - компенсационные самопишущие потенциометры; М - механический модулятор; ФЭУ - фотоэлектронный умножитель; 1 -неподвижный цилиндр фосфороскопа; 2 - обтюратор; 3 - светопоглощающие уплотнители
Мощные импульсы ДС вызывают фо-тоиндуцированное изменение состояния листа, т.е. влияют на процессы фотосинтеза. Вызываемые светом ДС сильная флуоресценция и послесвечение (быстрые компо-ненты продолжительностью до 10 с) не по-
падают на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) в канале регистрации, так как во время освещения объекта светом ДС окно фосфороскопа в направлении ФЭУ перекрывается. В промежутках между импульсами ДС окна и прорези совмещаются так, что лист
освещается светом ВС, а флуоресценция листа от ВС (ФЛ) и медленные компоненты послесвечения (ПС) от ДС, продолжитель-
_•>
ность которых более 10 с, одновременно поступают на ФЭУ.
Автором предложен и реализован в этой установке способ разделения сигналов флуоресценции (ФЛ) и послесвечения (ПС) в системе регистрации. Для этого был дополнительно введен разностный блок РБ (см. рис. 1), вычитающий сигнал ФЛ из общего сигнала люминесценции ФЛ и ПС.
Мы исследовали флуоресценцию и послесвечение листьев в области X ~ 680-760 нм, а также флуоресценцию зондов 9-аминоакридина и атебрина (к ~ 510 нм), введенных в суспензию хлоропластов.
Созданная установка позволяет исследовать флуоресценцию и послесвечение объектов в зависимости от температуры. Для этого предусмотрена термостабилизирующая система, позволяющая изменять температуру объекта от 10 до 96 °С с погрешностью 0,1 °С при скорости нагрева 0,6-2 град/мин.
Проведен анализ параметров установки, на основании которого были выполнены условия, обеспечивающие высокую чувствительность установки (отношение сигнала флуоресценции к шуму находилось в пределах 30-40), стабильность параметров и хорошую воспроизводимость результатов.
Три типа термограмм флуоресценции листьев растений
Автором предложен и применен новый метод исследования состояния фото-синтетического аппарата листьев растений -метод термограмм флуоресценции [2, 4-8]. Термограммы флуоресценции (ТГФ) представляют собой зависимости интенсивности флуоресценции от температуры при нагреве листа с постоянной скоростью. Были получены ТГФ листьев 12 видов растений на разных стадиях развития при различных условиях. Исследованы покрытосеменные растения: боб, клен, липа, береза, дуб, сирень и голосеменные растения: сосна, ель, кедр, лиственница, можжевельник, туя. ТГФ полу-
чали при слабом возбуждающем свете (0,01 Вт/м2) в области температур 20-96 °С при скорости нагрева 2 град/мин. Усиление аппаратуры выбирали таким, чтобы при начальной температуре 20-25 °С величина получаемого сигнала для разных объектов была нормирована на одно и то же значение, равное 1. Типичные ТГФ приведены на рис. 2 и 3.
Т,°С
Рис. 2. Термограммы флуоресценции листьев
боба на разных стадиях развития:
1 - зачаточный лист длиной 5 мм;
2 - молодой, 6 мм; 3 - зрелый, 34 мм;
4 — хлоропласта зрелых листьев боба
Впервые установлено, что ТГФ листьев различных растений на разных стадиях развития принадлежат одному из трех типов. Термограммы первого типа имеют один максимум интенсивности флуоресценции в области температур 60-75 °С и «плечо» при 51-58 °С (см. кривые 1 на рис. 2 и 3). У термограмм второго типа имеются два максимума: при 51-58 °С и 60-75 °С (кривые 2 на рис. 2 и 3). На термограммах третьего типа наблюдается один максимум при 51-58 °С
(кривая 3 на рис. 2 и кривые 3 и 4 на рис. 3). Для листьев покрыто- и голосеменных растений по мере их созревания ТГФ постепенно переходят от 1-го типа для зачаточных листьев (например, для боба кривая 1 на рис. 2) ко 2-му типу для молодых листьев (кривая 2 на рис. 2) и к 3-му типу для зрелых листьев (кривая 3 на рис. 2).
Р, отн.ед.
Т, °С
Рис. 3. Термограммы флуоресценции зрелых листьев сосны и ели в разные сезоны года: I - сосна, январь; 2 - ель, март; 3 - сосна, август; 4 - сосна из теплицы, январь
Для зрелых листьев голосеменных растений, пробуждающихся после зимнего покоя, происходят такие же переходы ТГФ: от 1-го типа зимой (например, для сосны кривая 1 на рис. 3) ко 2-му типу весной (например, для ели кривая 2 на рис. 3) и к 3-му типу в летне-осенний период (для сосны кривая 3 на рис. 3).
Такие же переходы термограмм флуоресценции от одного типа к другому были установлены зимой у листьев сосны, когда принесенную с мороза ветку, имеющую ТГФ 1-го типа, выдерживали в комнате в банке с водой. Уже через несколько часов после внесения ветки в комнату ТГФ от 1-го типа перешла ко 2-му типу, соответствую-
щему весеннему пробуждению растения после состояния зимнего покоя, а через двое суток - к 3-му типу, соответствующему летне-осеннему периоду. То есть методом ТГФ было зафиксировано, что зимой во время выдержки ветки сосны в воде при комнатной температуре в листьях происходят такие же процессы, как и при смене сезонов года.
Также было проведено сравнительное исследование ТГФ листьев сосны, выращенной в естественных условиях, и сосны, выращенной в теплице. Оказалось, что у зрелых листьев тепличной сосны ТГФ, снятая зимой, была 3-го типа, тогда как у сосны в естественных условиях ТГФ в зимний период года принадлежала к 1-му или 2-му типу. Отсутствие ТГФ 1-го и 2-го типов у тепличной сосны связано с тем, что у нее нет состояния зимнего покоя и последующего пробуждения, которым соответствуют эти типы ТГФ.
С помощью светофильтров было установлено, что для ТГФ 1-го и 2-го типов, начиная с температуры образования высокотемпературного максимума интенсивности (при ~ 70 °С) и далее, увеличивается коротковолновая доля флуоресценции листа. Указанные особенности трех типов ТГФ и их последовательный переход от одного типа к другому связан, вероятно, с тем, что у зачаточных листьев, а также у листьев голосеменных растений весной, во время их пробуждения после зимнего покоя, сначала формируется фотосистема 1, обусловливающая коротковолновый вклад во флуоресценцию листа, а затем по мере созревания покрытосеменных растений или пробуждения голосеменных формируется фотосистема 2, при этом на ТГФ образуется максимум интенсивности при температуре ~ 55 °С.
Зачаточные и молодые зеленые листья, извлеченные из кюветы после снятия ТГФ, имели зеленый цвет такой же или более яркий, чем до нагрева. А зрелые зеленые листья после снятия ТГФ приобретали бурый или буро-зеленый оттенок.
Наряду с листьями, были исследованы и хлоропласта' (класс Б), выделенные из зрелых листьев боба. Эти хлоропласта име-
ли ТГФ 3-го типа, как у листьев, из которых они были получены, но максимальная интенсивность флуоресценции и температура, при которой наблюдался этот максимум, у хлоропластов были ниже, чем у листьев (см. кривые 4 и 3 на рис. 2).
Снятие ТГФ в диапазоне температур от 20 до, по крайней мере, 80 °С позволяет установить, к какому типу относится данная ТГФ, так как высокотемпературный максимум у ТГФ 1-го и 2-го типов и последующий спад или подъем интенсивности флуоресценции выявляются в области 65-85 °С. В связи с этим ТГФ, полученная при изменении температуры до ~ 80 °С, дает максимальную информацию об исходном состоянии листа до нагревания при снятии ТГФ, т.е. при физиологических температурах.
Влияние различных факторов на термограммы флуоресценции листьев
На созданной установке было исследовано влияние интенсивности возбуждающего света (ВС) на вид ТГФ листьев. Оказалось, что ТГФ практически не зависят от интенсивности ВС, не превышающей 0,05 Вт/м2. При большей интенсивности этот свет вызывает изменения состояния листа и кривые ТГФ искажаются.
Было показано, что вид ТГФ зависит от условий освещения при выращивании растения. Так у молодых листьев боба одного возраста и размера, выращенных при естественном освещении, ТГФ была 2-го типа, как показано выше (см. кривую 2 на рис. 2), а при очень слабом освещении - 1-го типа. Вероятно, у молодых листьев, выращенных при очень слабом освещении, и у зачаточных листьев сначала формируется фотосистема 1, которой на ТГФ соответствует максимум интенсивности при температуре - 70 °С. Затем по мере созревания или освещения растения формируется фотосистема 2, и на ТГФ образуется еще один максимум интенсивности при ~ 50 °С. У этиолированного растения, т.е. выращенного при полном затемнении, интенсивность флуоресценции листа была близка к нулю во всем диапазоне температур от 10 до 90 °С.
Рис. 4. Термограмма флуоресценции (1) и кинетические кривые флуоресценции при фиксированных температурах (2, 3, 4) для зачаточных листьев липы в мае: 1 - Т = 25-96 °С; 2 -52,2 °С; 5-56 °С; 4- 58,8 °С
Внесение в почву посторонних вредных для растения веществ существенно искажает форму ТГФ листьев. Так, у листьев ели после того, как водители автомашин стали регулярно выливать под нее грязную воду с остатками бензина и машинных масел, ТГФ деформировались (стали иметь нечеткую форму со срезанными максимумами). При этом внешний вид этой ели ничем не отличался от здоровых деревьев, но через несколько месяцев она засохла. То есть, с помощью ТГФ была получена информация о болезненном состоянии растения задолго до того, как появились видимые признаки болезни.
Мы сравнили ТГФ молодых листьев клена и липы, прижатых во время измерения к медной подложке ячейки термостата, с ТГФ таких же листьев, изолированных от подложки тонкой, химически нейтральной пленкой. Оказалось, что контакт листьев с медной подложкой, в отличие от инертной, приводил к резкому уменьшению интенсивности флуо-
ресценции при температуре выше 65 °С. Это, возможно, вызвано проникновением атомов меди в клетки листа через слой расплавленных липидов и замещением магния в пир-рольном кольце молекулы хлорофилла.
Кинетика флуоресценции, индукция флуоресценции и послесвечение листьев при повышенных температурах
Были получены зависимости флуоресценции листьев от времени (кинетика флуоресценции) при фиксированных повышенных температурах [7, 8]. Сначала записывали ТГФ листа до определенной температуры в области 52-77 °С, после чего эту
температуру фиксировали и записывали кинетику флуоресценции при этой температуре (кривые 2, 3, 4 на рис. 4). Полученная кинетика флуоресценции сравнивалась с ТГФ такого же листа, записанной в области 25-96 °С (кривая 1 на рис. 4). Кинетические зависимости флуоресценции разных листьев при фиксированной повышенной температуре оказались подобными их ТГФ, причем время достижения экстремальных точек для голосеменных растений было почти таким же, а для покрытосеменных значительно большим, чем на ТГФ (например, для липы см. рис. 4).
Б, отн. ед.
10 мин
^ мин
Рис. 5. ТГФ с импульсами индукции флуоресценции (а) от ДС и импульсы послесвечения (б) в интервалах между импульсами ДС для листа ели голубой в октябре при /дс = 1 Вт/м2: 1 - ТГФ с импульсами индукции флуоресценции (а) от ДС; 2 - огибающая импульсов послесвечения
Мы исследовали также температурные зависимости индукции флуоресценции и послесвечения для листьев клена и ели [8]. Для этого при получении ТГФ по мере роста температуры многократно включали ДС на время 3-10 с, в течение которого одновременно измеряли максимальные значения индукции флуоресценции и послесвечения, как указано выше при описании экспериментальной установки. В результате на само-
писце КСП1 (см. рис. 1) получали кривые ТГФ (кривая 1 на рис. 5) с импульсами индукции флуоресценции (импульсы а) и одновременно на другом самописце (КСП2) регистрировали импульсы послесвечения (импульсы б). С ростом температуры до 50 °С величины этих импульсов уменьшались до 0 как для индукции флуоресценции, так и для послесвечения. В области 50-60 °С при включении ДС интенсивность флуоресцен-
ции резко уменьшалась, образуя узкие впадины на ТГФ, а послесвечение отсутствовало. Такой спад индукции флуоресценции листьев наблюдался впервые. При температуре более 60 °С ДС не оказывал влияния на вид ТГФ.
Спектры возбуждения и флуоресценции листьев до и после теплового воздействия
Были исследованы спектры флуоресценции и спектры возбуждения флуоресценции листьев разных растений, полученные при комнатной температуре на спектрофлуори-метре фирмы НкасЫ с предварительным нагревом листьев до 56-96 °С или без нагрева [8]. В спектрах флуоресценции листьев покрыто- и голосеменных растений, имеющих
ТГФ 3-го типа, без предварительного нагрева наблюдаются два максимума интенсивности (ее спектральной плотности) при Хфц = 684-687 и 733-737 нм ( например, для клена кривая 1 на рис. 6, а). У листьев, имеющих ТГФ 2-го типа, наблюдается 1-й из этих максимумов (кривая 2). У листьев с ТГФ 2-го типа, нагретых и затем охлажденных, остается только этот максимум, и интенсивность флуоресценции увеличивается (кривые 2 и 3 на рис. 6, а). У листьев с ТГФ 3-го типа предварительный нагрев приводит к возрастанию интенсивности 1-го максимума (~ 685 нм) и уменьшению 2-го максимума (~ 735 нм) до исчезновения.
I ,отн.ед.
Рис. 6. Спектры флуоресценции (а) Р(ХФл) при А.в = 400—540 нм (фильтр СЗС-22) и спектры возбуждения флуоресценции (б) Г(ХВ) при ХфЛ > 703 нм (фильтр КС-19) листьев клена (в июле), полученные при комнатной температуре с предварительным нагревом листьев или без нагрева: а, б: 1 - зрелый лист; 2, 3, 4 — молодые листья: 1,2- без нагрева; 3 - нагрев до 56,2 °С и охлаждение; 4 - нагрев до 96 °С и охлаждение
В спектрах возбуждения флуоресценции листьев клена, липы и ели без нагрева наблюдались несколько максимумов интенсивности флуоресценции, причем у молодых листьев интенсивность флуоресценции вы-
ше, чем у зрелых (кривые 2 и 1 па. рис. 6, б). Предварительный нагрев молодых листьев с ТГФ 2-го типа приводит к появлению в их спектрах возбуждения новых трех максимумов при Хв ~ 414-422, 514 и 543 нм и к уве-
личению интенсивности в длинноволновой части спектра (кривые 3 и 4 на рис. 6, б). Например, у листа ели весной после предварительного нагрева до 96 °С интенсивность флуоресценции при Хв = 422 и 609 нм увеличилась в 4 раза. У зрелых листьев влияние предварительного нагрева на спектры возбуждения выражено слабее и сводится к уменьшению интенсивности флуоресценции.
Флуоресценция и послесвечение листа в серии измерений
На установке (см. рис. 1) были получены кинетические зависимости фотоинду-цированной флуоресценции и послесвечения листа боба Унпа £аЬа (сорт «Русские черные») в серии из 28 измерений, следующих друг за другом через время темновой адаптации *т = 3-15 мин [9]. Измерения были выполнены при комнатной температуре. Результаты измерений представлены на рис. 7, на котором моменты включения и выключения света ВС и ДС показаны стрелками. Измерения 1-21 следовали через трехминутный темновой промежуток, а в измерениях 22-28 время темновой адаптации увеличивали до 4-15 мин.
Интенсивность флуоресценции Рфп состоит из двух частей: Fфл = /*0 + А/7, где - интенсивность постоянной (фоновой) составляющей флуоресценции от света ВС; АР - интенсивность переменной составляющей флуоресценции, индуцируемой светом ДС (медленная индукция флуоресценции). Видно, что кривые 77фл(2‘) имеют два максимума и минимум, характерные для индукционных переходов флуоресценции хлорофилла в листьях растений (кривая Каутского) [1]. Постоянная составляющая флуоресценции ^ не изменялась в измерениях 1-23, следующих друг за другом через время темновой адаптации ?т = 3 мин. Интенсивность переменной составляющей флуоресценции ЛР сильно снижалась с каждым последующим измерением от 1-го до 8-го. В следующих четырнадцати измерениях с 8 по 21 при одном и том же значении ^ = 3 мин было обнаружено, что кривые ^фл(0 не изменялись (с погрешностью 1-2 % ДЛЯ -РфЛ и 1-4 % для времени появления
экстремальных значений ^ФЛ), т.е. лист достигал «стабилизированного» состояния.
Рис. 7. Кинетические кривые флуоресценции
(а) и одновременного послесвечения
(б) листа боба в серии последовательных измерений (с 1 по 28) со следующими промежутками темновой адаптации: 1-21 - 3 мин, 24 - 5 мин, 28 -15 мин
Кинетические кривые послесвечения Fnc(t) в измерениях 1-21 имеют характер, подобный кривым медленной индукции флуоресценции AF(t) (см. рис. 7): имеются аналогичные экстремальные точки, интенсивность послесвечения также уменьшается от опыта 1 до опыта 8, в измерениях 8-21 кривые послесвечения не изменялись, т.е. лист достигал «стабилизированного» состояния и по послесвечению. При дальнейших измерениях при таком состоянии листа обнаружено, что для экстремальных точек значения интенсивностей AF и Fnc оказались пропорциональными времени темновой адаптации в области 3-6 мин для AF и 3-15 мин для Fnc-
Использование в установке одного оптического канала при одном ФЭУ позволило ПО полученным кривым Рфл(0 и Fnc(0 рассчитать кинетические зависимости отношения квантовых выходов лучей флуоресценции и послесвечения листа, выходящих в элемент телесного угла по направлению к ФЭУ (Kfo/Knc, Ktf/Knc) и определить кинетику долей интенсивностей компонентов люминесценции листа в этом направлении (<Sf0, <S\f, <Ягс)- Для «стабилизированного» состояния в разные моменты времени получено Кро/Кпс ~ 3100-4000, KAF/Knc = 600-890, &о = 62-71 %, SAF = 11— 18 %, (5пс = 18-20 %, где <5fo + <5af + <5пс = 100 %.
Флуоресценция и послесвечение хлорофилла in vivo непосредственно связаны с процессами переноса энергии в пигментной матрице и разделения зарядов в реакционном центре фотосистемы 2, что подтверждается сходством спектров ФЛ и ПС [1]. Можно показать, что интенсивность AF и Fnc пропорциональны концентрации восстановленного первичного акцептора фотосистемы 2, что приводит к подобию кинетик AF(t) и Fnc(0> которые мы наблюдали.
Мы также сравнили эти зависимости с полученной методом ЭПР (см. ниже) кинетикой фотоиндуцированных окислительно-восстановительных превращений реак-
ционного центра фотосистемы 1 Р700 в листьях бобов. Превращения Р700 были индуцированы сначала светом с X = 707 нм (возбуждающим преимущественно ФС1), а затем белым светом (БС) (возбуждающим обе фотосистемы), включенным на фоне света А.707. Полученная кинетика разности концентраций
[Р700+Ьо7-[Р700+]БС = /(0 оказалась подобной кинетикам АР(г) и Рпс(0- Это говорит о взаимосвязи разных процессов в ФС1 и ФС2, приводящих к подобию кинетик трех указанных величин.
Радиоспектроскопические и люминесцентные исследования листьев и стеблей растений
Мы провели [10] сравнительное исследование биофизических характеристик листьев и стеблей различных растений (дуб, бук, клен, липа, орешник, сирень, китайская роза) тремя методами: электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), термолюминесценции (ТЛ) и медленной индукции флуоресценции (МИФ).
Радиоспектроскопическим методом были исследованы спектры ЭПР и кинетика фотоиндуцированных окислительновосстановительных превращений реакционного центра фотосистемы 1 Р700 (сигнал ЭПР1) в листьях и стеблях. Для обработки спектров ЭПР и выделения слабых сигналов на фоне шума использовали ЭВМ модели О-Сот РС-888. Для ввода аналоговых сигналов ЭПР в ЭВМ использован аналогово-цифровой преобразователь, функционирующий в стандарте 1ВМ. Спектры ЭПР регистрировали при комнатной температуре. Амплитуда высокочастотной модуляции составляла 0,4 мТл, мощность СВЧ равнялась 20 мВт.
Для регистрации кинетики превращений Р700 магнитное поле фиксировали на низкополевом экстремуме первой производной фотоиндуцированного сигнала ЭПР1. Высечку листа или стебля, внесенную в резонатор, первоначально адаптировали к темноте. После этого включали
красный свет (X = 707 нм), под действием которого происходит окисление центров Р700 и наблюдается рост сигнала ЭПР1. Затем переключали свет на X = 650 нм, под действием которого сигнал ЭПР1 уменьшался вследствие притока электронов к окисленным центрам Р700 от фотосистемы 2. Далее вновь включали свет с X = 707 нм, который затем переключали на белый свет, эффективно возбуждающий обе фотосистемы. Такая последовательность освещения листьев и стеблей дает наиболее полную информацию о функционировании двух фотосистем и процессах регуляции электронного транспорта в интактных хло-ропластах.
Термо люминесценцией называют свечение предварительно облученных и сильно охлажденных объектов при их постепенном нагревании в темноте. ТЛ, как и ПС, связана с рекомбинацией разделенных зарядов в реакционном центре, но в отличие от ПС, она происходит при нагревании в темноте от низких температур. На кривой высвечивания в виде зависимости интенсивности ТЛ от температуры наблюдается несколько полос (с максимумами). Три из них (в диапазоне от -20 до +40 °С) связаны с фотохимическими реакциями фотосистемы 2, в частности, с выделением кислорода [1].
Исследуемый образец мы предварительно облучали светом с X = 725 нм (для стандартизации опытов), охлаждали до температуры - 30 °С и облучали белым светом, возбуждающим обе фотосистемы. После облучения образец охлаждали в темноте до -100 °С, а затем нагревали со скоростью 20-35 град/мин до +70 °С. Излучение регистрировали с помощью ФЭУ.
Сравнительное исследование МИФ листьев и стеблей было проведено на однолучевом флуориметре при интенсивности ВС 3 Вт/м . Флуоресценцию регистрировали на длине волны 686 нм, используя спектрограф ИСП-51.
В результате сравнительных исследований тремя описанными методами было
установлено, что спектры ЭПР, кинетика фотоиндуцированных изменений сигнала ЭПР1, кривые ТЛ и МИФ стеблей аналогичны соответствующим зависимостям для листьев. Это свидетельствует об одинаковом функционировании цепи электронного транспорта и реакционных центров в хлоропластах листьев и стеблей.
Мы также исследовали [11] указанные характеристики листьев разных растений (бук, белая акация и других), выросших из зеленых черенков, которые перед посадкой облучались гелий-неоновым лазером в течение времени от 0,3 до 10 мин. Измерения проводили примерно через четыре месяца после облучения. Существенных отличий в радиоспектроскопических и люминесцентных характеристиках листьев растений с предварительным облучением их черенков и без облучения выявлено не было.
Фотоиндуцированное тушение флуоресценции зондов в суспензии хлоропластов
Флуоресцентные зонды, т.е. флуоресцирующие молекулы, введенные в суспензию хлоропластов, широко применяют для исследования структуры и функциональных изменений фотосинтетических мембран хлоропластов. Зонды связываются с биологическими мембранами или другими компонентами клетки нековалентными связями и резко изменяют параметры своей флуоресценции в зависимости от свойств среды. По флуоресценции зондов получают информацию о структурных перестройках в мембранах, переносе ионов, градиентах pH и электрического потенциала.
Мы провели сравнительное исследование флуоресценции двух рН-чувствитель-ных зондов акридинового ряда - 9-амино-акридина (9-АА) и атебрина (9-(4-диэтил-амино-1-метил-бутиламино)-6-хлор-2-мето-ксиакридин) (Ат) в суспензии хлоропластов при различных состояниях тилакоидных мембран [12]. Исследование проведено на описанной выше установке [3]. Флуоресценция зондов возбуждалась светом ВС (0,0025 Вт/м2) в области А, « 360-440 нм, а
регистрировалась при -510 нм. Интенсивность света ДС, влияющего на состояние хлоропластов, была равна 2,5 Вт/м2. Установка позволяла регистрировать флуоресценцию зондов с концентрацией 10-6 М в суспензии хлоропластов с концентрацией хлорофилла ~ 2 х 10~2 г/л.
Были получены значения относительного тушения (уменьшения) флуоресценции зондов под влиянием сильного ДС в зависимости от pH среды инкубации хлоропластов (pH = 5,5-9,5) с добавлением субстратов фосфорилирования (АДФ и фосфата) и без них при комнатной температуре. Из полученных данных по формуле Роттенберга были вычислены изменения трансмембранного градиента, вызванные введением АДФ (10“6 М), которые оказались равными 0,5 для 9-АА и 0,2 для Ат.
Было изучено влияние ионного состава среды инкубации хлоропластов (при введении солей №С1 и Г^СЬ) и разобщителя фосфорилирования ЖЦО на фотоин-дуцированное тушение флуоресценции зондов 9-АА и Ат. С увеличением концентрации ЫаС1 до 150 мМ или М§СЬ до 10 мМ относительное тушение флуоресценции обоих зондов возрастало, а при дальнейшем увеличении концентрации солей оно практически не изменялось. При увеличении концентрации ИЩС! в среде, а также при добавлении АДФ и фосфата относительное тушение флуоресценции зондов под влиянием ДС уменьшалось.
Анализ полученных данных показал, что зонд 9-АА меньше связывается с тилакоидной мембраной по сравнению с Ат. Поэтому зонд 9-АА более подходит для измерения АрН в мембранах хлоропластов, а зонд Ат с длинным гидрофобным «хвостом» целесообразно применять для исследования структурного состояния мембран.
Мы также исследовали влияние температуры на фотоиндуцированное тушение флуоресценции зондов в физиологической области температур. Оказалось, что тушение флуоресценции этих зондов с
ростом температуры слабо уменьшается в области 10-24 °С и сильно снижается после 24 °С до полного исчезновения при 34 °С (рис. 8). Вместе с тем были обнаружены отличия в кинетике фотоиндуциро-ванного тушения флуоресценции 9-АА и Ат в области 24-34 °С. В этой области температур обнаружен новый эффект, состоящий в уменьшении с течением времени тушения флуоресценции Ат при включенном ДС (см. кривые 3, 4, 5 на рис. 8). Этот эффект у Ат, отсутствующий у 9-АА, связан, вероятно, с изменением состояния мембран хлоропластов с течением времени при совместном действии мощного освещения и температуры.
Влияние ингибитора и активатора фотосинтеза на люминесценцию листьев
Мы исследовали [13] медленную индукцию флуоресценции (МИФ), термолюминесценцию (ТЛ) и интенсивность фотосинтеза (скорость выделения Ог) листьев бобов, обработанных ингибитором диуроном (дихлорфенилдиметилмочевина), либо активатором фотосинтеза, разработанным НПО «Биотехнология».
Диурон разводили сначала в этаноле, а затем в дистиллированной воде, так что содержание этанола в конечном водном растворе не превышало 1 %. Раствор диурона вводили в лист с помощью шприца, не отрывая лист от стебля и через час после этого выполняли измерения МИФ, ТЛ и Ог-обмена. Скорость выделения О2 определяли манометрическим методом Варбурга. Активатор фотосинтеза (АФ) представлял собой водную суспензию кислотообразующих почвенных бактерий, обладающих способностью синтезировать цитокинины и другие ростстимулирующие вещества. Проростки бобов опрыскивали суспензией АФ дважды с интервалом в 5 дней и через 3 дня после второй обработки выполняли измерения.
Обработка листьев диуроном в концентрации 10^7—10“5 М приводила к увеличению стационарного уровня МИФ и к уменьшению максимальной интенсивности
МИФ Рм, так что отношение Рм/^т уменьшалось от 2,0 до 1,0. Подобные изменения МИФ, очевидно, связаны с тем, что диурон блокирует нециклический электронный транспорт между фотосистемами.
Обработка растений АФ, напротив, приводила к увеличению уровня Рм, уровень FJ практически не менялся и отношение Рм/^т возрастало на 10-20 % для растений разных посадок. Такое действие АФ можно объяснить более активным синтезом АТФ в первые секунды освещения, в результате чего уменьшается градиент протонов АрН на мембране тилакоидов, а известно [1], что АрН является тушителем флуоресценции.
Рис. 8. Фотоиндуцированное тушение флуоресценции зонда Ат (9 • 1СГ6 М) в суспензии хлоропластов бобов при различных температурах: 1 - 18,5; 2 - 23,3; 3 - 26,6; 4 - 28,6; 5 -30,6; 6 - 34 °С
По измерениям скорости выделения Ог при ингибировании и при активации относительная интенсивность фотосинтеза находилась в пределах 0-1,2 (где 1,0 - интенсивность без введения препаратов) и положительно коррелировала (линейно за-
висела) с параметром МИФ Рм^т, изменяющимся от 1,0 до 2,2 соответственно (без введения препаратов Рм/Рт = 2,0).
При измерении ТЛ было показано, что диурон в концентрации 10~5 М, при которой практически полностью ингибировался фотосинтез, вызывал смещение полосы В (область 0-40 °С) в сторону более низких температур на 7-8 °С. АФ вызывал смещение этой полосы на 10-11 °С в сторону высоких температур. Полоса В возникает при рекомбинациях и Бз+ состояний водорасщепляющего комплекса и электронов С вторичного (Зв~ хинонного акцептора. Можно предположить, что эффект диурона связан с уменьшением СЬ”, а эффект АФ - с изменением соотношения между Бз+ И Б2+ состояниями в сторону увеличения последних.
Полученные результаты могут быть использованы при изучении влияния различных химических агентов на растения.
Заключение
Автором выполнен комплекс экспериментальных исследований флуоресцентных и других биофизических характеристик листьев растений. Была создана многофункциональная флуориметрическая установка. И, в основном, на ней, а также на других установках были получены новые данные по кинетике флуоресценции и послесвечения и по спектральным характеристикам листьев растений при обычных и повышенных температурах на разных стадиях их развития и при различных условиях выращивания и проведения эксперимента. Предложен новый эффективный подход к изучению состояния фотосинтетического аппарата растений - метод термограмм флуоресценции. Впервые установлено, что термограммы флуоресценции листьев различных растений на разных стадиях развития принадлежат одному из трех типов и переходят от одного типа к другому по мере созревания растения. Поэтому термограммы флуоресценции могут служить чувствительным тестом физиологического
состояния листьев растений и стадии их развития.
Результаты работы имеют существенное научное и практическое значение для исследований биофизических процессов фотосинтеза, включая разработку математических моделей этих процессов.
Основные результаты вышеизложенных исследований были доложены и обсуждены на I и II съездах биофизиков России, I и II Всероссийских съездах фото-биологов, Международном симпозиуме по нетрадиционным растениям, а также на десяти международных и всесоюзных конференциях и опубликованы в 37 научных работах.
Литература
1. Фотосинтез / Под ред. Говинджи. - М.: Мир, 1987. -Т. 1,2.-727 с., 472 с.
2. Кузнецова Е.А. Исследование зависимости • флуоресценции листьев растений от температуры // Биофизика. - 1981. - Т. 26, вып. 5. - С. 893-894.
3. Кузнецова Е.А. Установка для исследования флуоресценции и послесвечения биологических объектов // Лесной вестник. - М.: МГУЛ, 1998. -№ 1 (2).-С. 121-123.
4. Кузнецова Е.А. Термограммы флуоресценции листьев растений на разных стадиях развития // Тезисы докл. II Всероссийского съезда фотобиологов. - Пущино: 1998. - С. 346-349.
5. Кузнецова Е.А. Флуоресценция листьев покрытосеменных и голосеменных растений при повышенных температурах // Экология, мониторинг и рациональное природопользование / На-
уч. тр. - М.: Изд-во МГУЛ, 1998. - Вып. 294(1). -С. 123-128.
6. Кузнецова Е.А. Флуоресценция листьев высших растений при повышенных температурах // Биофизика. — 1982. - Т. 27, вып. 5. - С. 809-811.
7. Кузнецова Е.А. Кинетика термоиндуцированной флуоресценции листьев лесных растений // Науч.тр. / Моск. лесотехнический ин-т. - 1991. -Вып. 245. - С. 132-138.
8. Кузнецова Е.А. Флуоресцентные и спектральные характеристики листьев растений при повышенных температурах // Тезисы докл. II съезда биофизиков России. - М.: 1999. - Т. 3. - С. 1041— 1042.
9. Кузнецова Е.А. Кинетические зависимости флуоресценции и послесвечения листьев растений // Экология, мониторинг и рациональное природопользование / Науч. тр. - М.: Изд-во МГУЛ, 1999. -Вып. 295 (1).
10. Кузнецова Е.А., Солнцев М.К., Тихонов А.Н. Изучение функционального состояния хлоро-пластов в листьях и стеблях высших растений радиоспектроскопическим и оптическими методами // Науч. тр. / Моск. лесотехнический ин-т.
- 1990. - Вып. 225. - С. 56-62.
11. Кузнецова Е.А., Солнцев М.К. Влияние лазерного облучения черенков лесных культур на их люминесцентные характеристики после укоренения // Науч. тр. / Моск. лесотехнический ин-т.
- 1991. - Вып. 242. - С. 65-72.
12. Кузнецова Е.А., Кукушкин А.К. Влияние температуры на тушение флуоресценции 9-аминоакридина и атебрина в хлоропластах // Биофизика. - 1983. - Т. 28, вып. 5. - С. 776-778.
13. Караваев В.А., Полякова И.Б., Солнцев М.К., Юрина Т.П., Кузнецова Е.А., Кузнецов А.М. Влияние ингибитора и активатора фотосинтеза на люминесцентные показатели листьев бобов // Вестник Моск. ун-та. Сер. 3. - 1998. - № 6. - С. 29-32.
ВНИМАНИЮ ДЕЛОВЫХ ЛЮДЕЙ!
Продолжает свою работу журнал «Деревообработка в России». Мы предлагаем Вам поместить в нашем журнале статью на интересующую Вас тему (станки, инструменты, оборудование, технологии и др.). Размещение статьи в журнале бесплатно.
Рядом со статьей или внутри текста помещается Ваш блок рекламы, оплачиваемый: 1 страница - 1200 руб.; 1/2 - 700 руб.; 1/3 - 500 руб.; 1/4 - 400 руб.
Стоимость рекламы, размещаемой на обложке, рассматривается в каждом конкретном случае. Предоставляются скидки. Ждем Ваших предложений по адресу:
141005. Мытищи М.О., пос. Строитель, ул. 1-я Институтская, д. 1. Издательство МГУЛ. Тел. (095) 588-53-48, факс (095) 583-73-42 (с пометкой: Издательство, журнал «Деревообработка в России»),
