CC BY
152
УДК 581.132
ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИЙ
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА СОСНЫ ЕВРОПЕЙСКОЙ
П.А. Кашулин, Н.В. Калачёва
Полярно-альпийский ботанический сад-институт им. Н.А. Аврорина КНЦ РАН
Аннотация
Методами импульсно-модулированной флуоресцентной спектроскопии исследовано состояние фотосинтетического аппарата (ФА) и его возрастных модификаций в хвое резидентного субарктического вида сосны Pinus sylvestris subsp. Lapponica. Показана возрастная устойчивость ФА. В старых деревьях его эффективность снижается незначительно, но меняется стратегия использования световой энергии. У молодых деревьев доминирует фотохимическая конверсия и биосинтез, у старых - фотозащитная функция, утилизация её избытка и обеспечение долгосрочных энергетических запасов. Ключевые слова:
фотосинтез, сосна Pinus sylvestris, возраст, старение, флуоресцентная спектроскопия.
Долговременная устойчивость лесообразующих растений к неблагоприятным условиям Севера и их продуктивность зависят от надежности их фотосинтетического аппарата. Для проведения охранных мероприятий, направленных на сохранение уникального генофонда коллекционных образцов интродуцированных в ПАБСИ и старовозрастных древостоев Кольского Севера, необходима своевременная информация об их неблагополучии. Для оценки состояния древесных видов необходимо понимание физиолого-биохимических и субклеточных механизмов, контролирующих фотосинтез. Древесные хвойные виды отличаются высокой продолжительностью жизни даже на Севере и могут представлять интерес для изучения физиолого-биохимических механизмов старения. Парадоксальным фактом биологии продолжительности жизни является слабая изученность наиболее долгоживущих биологических видов, которыми богат мир растений. У некоторых экземпляров сосны Pinus longaeva документирован возраст свыше 4.7 тыс. лет [1], тем не менее, специальные морфологические исследования тканей и клеток, выполненные в этой и в других работах, не выявили отчетливых признаков старения. Главные причины гибели таких долгоживущих видов связывают не с возрастным ослаблением жизненного потенциала, а с неблагоприятными условиями среды.
Для оценки текущего физиологического состояния растения и его жизненного потенциала необходим постоянно действующий канал информации о состоянии органов, ответственных за ассимиляцию. Фотосинтетический аппарат (ФА) представляет собой сложно- и тонкоорганизованную систему, интегрированную в организм растения. Традиционные аналитико-биохимические методы предполагают изолирование его структур и их неизбежное повреждение. Необходимы новые методы, позволяющие осуществлять непрерывный мониторинг, не причиняя ущербf организму, без повреждений ФА нативного листа, без проникновения в его структуру и без расхода растительного материала.
Этим требованиям отвечает современная техника импульсно-модулированной флуоресцентной спектроскопии, разрабатываемая немецкой лабораторией Heinz Walz GmbH, которая была использована для измерений флуоресцентных характеристик хлорофилла и возрастных модификаций работы ФА местных экотипов сосны Pinus sylvestris subsp. Lapponica Fries.
Материалы и методы исследования
Для анализа текущего состояния ФА и его возрастных модификаций у резидентного вида сосны Pinus sylvestris subsp. Lapponica Fries использовали методы импульсно-модулированной флуоресцентной спектроскопии. Измеряли основные собственные флуоресцентные характеристики и их индуцированные изменения у нативной хвои разного возраста местных экотипов этого вида. Для изучения влияния возраста дерева на измеряемые показатели использовали близко расположенные
деревья разного возраста, произрастающие в одинаковых экологических условиях зеленомошного сосняка в предгорье Хибин. Для флуоресцентных измерений использовали полевой флуориметр РАМ-2100 «Не^ Walz GmbH» (ФРГ), для спектрофотометрических - спектрофотометр ЦУ-2401РС “Shimadzu” (Япония). В зависимости от измеряемых параметров импульсно-модулированной флуоресценции хлорофилла хвои использовали разные режимы считывания показаний.
При определении основных конститутивных характеристик флуоресценции хлорофилла хвои: Fo, Fv/Fm и Fm [2, 3] использовали режим импульсной кинетики и одиночные насыщающие импульсы света длительностью 0.8 с после предварительной темновой адаптации образца в течение 15 мин в специально предназначенном для этой цели листовом держателе 2030-В.
В кинетическом режиме световой индукции использовали 4-минутное включение красного активирующего света мощностью светового потока 218 цЕ. При записи световых кривых фотосинтеза использовали ступенчатую подачу нарастающих по мощности световых потоков, с шагом 20 сек. При этом измеряемая интенсивность электронного транспорта ИЭТ в фотосистеме II (ФС II) и квантовый выход фотосинтеза - Y связаны соотношением [4]:
ИЭТ = Y х ФАР х 0.5 х 0.84, где Y - усредненный фотохимический квантовый выход; ФАР - плотности потока внешней фотосинтетически активной радиации, измеренной в цМ м-2 с-1. Транспорт одного электрона требует поглощения двух квантов, поскольку в процесс вовлечены две фотосистемы, этим обусловлен множитель 0.5; 84% - типичный коэффициент поглощения внешних квантов поверхностью листа.
Результаты и обсуждение
Важнейшей характеристикой фотосинтетического потенциала растения являются световые кривые, представляющие собой зависимости фотосинтеза от мощности потока внешней световой радиации. Флуоресцентные характеристики хлоропластов позволяют проводить косвенную оценку квантового выхода фотосинтеза по интенсивности потока электронного транспорта, участвующего в фотохимической фиксации, в цМ электронов на квадратный метр в секунду. Она же показывает и интенсивность разделения зарядов в ФС II. На рис. 1 представлены световые кривые для хвои первого года сосен разного возраста, произрастающих на открытой возвышенности высотой около 350 м, снятые в начале июля при температуре воздуха 18оС.
Рис. 1. Интенсивность электронного транспорта в фотосистемах хлоропластов хвои первого года
у сосен разного возраста
При высоких интенсивностях освещения фотохимическая фиксация в хвое сосен разного возраста начинает различаться: у более молодых деревьев она выше, чем у старых (рис. 1). Одной из возможных причин различий являются изменения структуры реакционных центров ФС II и антенных комплексов. На это указывают возрастные различия в основных конститутивных характеристиках ФС II хлоропластов хвои:
Fo, Fv/Fm и Fm, измеряемых после ее темновой адаптации. В таких условиях все реакционные центры ФС II полностью открыты, и наблюдается максимальное фотохимическое тушение. Для хвои первого года у сосен 8 и 72 лет эти значения составили соответственно для Fo: 0.20 ± 0.01 и 0.17 ± 0.01; для Fv/Fm: 1.39 ± 0.02 и 1.06 ± 0.02; для Fm: 0.856 ± 0.005 и 0.841 ± 0.05. Известно, что повышение интенсивности темновой флуоресценции Fo может быть результатом разрушения реакционных центров ФС II или ингибирования переноса энергии возбуждения с антенных комплексов на реакционные центры [5, 6]. В частности, это может происходить при сильном освещении, засухе и других неблагоприятных воздействиях среды. В данном случае у более старых деревьев возрастного повышения темновой флуоресценции не наблюдали, наоборот, происходило её незначительное снижение с возрастом. Это указывает на отсутствие выраженных деструктивных сенильных процессов в ФС II, вместе с этим снижение максимальной и переменной флуоресценции указывает на возрастную мобилизацию процессов нефотохимического тушения.
Более детально эти различия в характере перераспределения поглощенной световой энергии в хвое сосен разного возраста обнаруживаются на световых кривых для основных каналов ее утилизации в ФС II, представленной соответствующими квантовыми выходами (рис. 2).
—♦—Y{ll) 70 -■-Y{NO)70 -* Y{NPQ) 70 —Y(H) 8 Y{NO)8 —Y{NPQ)8
0 100 200 300 400 500 600 700 800
PAR, ME
Рис. 2. Параметры флуоресценции ФС II хвои первого года сосен разного возраста. Показаны квантовые выходы фотохимического тушения Y(II), регулируемой утилизации Y(NPQ) и нерегулируемой диссипации световой энергии Y(NO) для деревьев 8- и 70-летнего возраста
В хвое молодого дерева её сравнительно большая доля используется в фотохимической конверсии, показатель Y(II). Помимо этого, в этой хвое фотохимическая фиксация является основным каналом утилизации поглощенной световой энергии при всех интенсивностях её потоков. В то время как в хвое более старого дерева, начиная с плотности фотосинтетический активного потока фотонов в 500 цЕ, основным каналом ее преобразования является регулируемая нефотохимическая утилизация, характеризуемая квантовым выходом Y(NPQ).
Процесс фиксации диоксида углерода в хвое молодых деревьев был более эффективным. Для всех уровней освещенности выше 50 цЕ фотохимическая конверсия, представленная показателем Y(II) - квантовым выходом ФС II, была выше, чем в хвое старых. Однако старая хвоя отличалась намного более высоким уровнем регулируемой утилизации части энергии, не использованной в цикле Кальвина-Бенсона, показатель Y(NPQ). Превышение было 2-3-кратным. И одновременно нерегулируемые тепловые и световые потери, показатель Y(NO), для неё были более низкими, чем у хвои молодых деревьев при всех уровнях освещенности. Это указывает на разные стратегии использования световой энергии деревьями разного возраста. Для молодых деревьев приоритетом является более быстрый рост, требующий достаточного количества ассимилянтов, для старших важнее запас энергии виде протонного градиента или АТР, а также своевременное, раннее предотвращение потенциально опасных свободнорадикальных процессов в хлоропластах. В хвое старого дерева суммарное преобразование энергии происходит менее расточительно, с более низкими
потерями и нерегулируемой, необратимой диссипацией, отражаемой параметром Y(NO). Важной характеристикой энергетического статуса хлоропластов являются коэффициенты тушения [3]. Дополнительные стороны возрастных функциональных различий ФА сосен были обнаружены при анализе коэффициентов тушения флуоресценции хлорофилла при росте уровня освещения, отражающих различные пути перераспределения поглощенной световой энергии (рис. 3).
1,2 -|
-И— qN70 qP70
—*— NPQ8
—i—qP 8
ФАР, jliE
Рис. 3. Различие в утилизации световой энергии фотосистемами хвои первого года у сосен разного возраста. Показаны коэффициенты фотохимического qP, qL и нефотохимического тушения qN, NPQ соответственно для деревьев 8- и 70-летнего возраста
Коэффициент qL, отражающий меру открытости реакционных центров, был более низким у образцов хвои молодого дерева, что и обусловливает их более высокие квантовые выходы нерегулируемой энергии Y(NO). Вычисление этого коэффициента производится в предположении, согласно которому пигментная организация соединенных между собой световоспринимающих антенн соответствует их равномерному распределению и описывается моделью озера (lake model), в то время как другая модель пирога (puddle model) предполагает их относительную автономность, на основе которой рассчитывается коэффициент qP.
Таким образом, большое различие между этими двумя коэффициентами qL и qP тушения флуоресценции ФС II хвои молодого дерева указывает на более высокую степень их связи между реакционными центрами световоспринимающих антенн их хлоропластов. Значительные различия для образцов хвои деревьев разного возраста выявлены в энергетическом статусе хлоропластов, отражаемые коэффициентом нефотохимического тушения qN. Его более высокие значения указывают на доминирование О2-зависимого электронного потока над СО2-зависимым в хлоропластах более старого дерева. Соответствующее переключение наступает, вероятно, при уровнях освещенности около 200 цЕ, на это указывает инверсия коэффициентов qP в данной точке.
Измерение флуоресцентных характеристик фотосистем (ФС) хвои разного возраста одного и того же дерева также показало различие между ними. На рис. 4 показаны индукционные кривые для интактной хвои текущего года и 6-летней хвои одной и той же 72-летней сосны.
Кривые, показывающие медленную кинетику адаптации ФС хвои к высокой освещенности, получены после темновой адаптации включением активирующего красного света плотностью светового потока 218 цЕ через 110 сек. после старта записи. Различия в реакции ФС хвои разного возраста на освещение отчетливо заметны только в первые 2 мин после включения активирующего света и качественно соответствуют реакции хвои первого года деревьев разного возраста. Квантовый выход Y(II) фотохимической конверсии ФС II и нерегулируемая диссипация Y(NO) у молодой хвои были выше, чем у 6-летней, при более низком уровне регулируемой нефотохимической регуляции.
Однако по мере адаптации ФС к яркому освещению эти различия снижались и практически исчезли к третьей минуте после начала световой индукции.
Таким образом, различия световой реакции ФС хвои сосны на сильное освещение, обусловленные разным календарным возрастом дерева, более выражены и робастны, чем различия, обусловленные разным возрастом хвои одного дерева.
<и о»
S Ct s с
-э- 5
-Э- та m о. О CD 2С О.
<и
800
Рис. 4. Индукционные световые кривые для нативной хвои разного возраста одной старой сосны. Индукция вызвана включением красного света плотностью потока 218 цЕ через НО сек после начала записи
Спектрофотометрическое сравнение этанольных экстрактов хвои разного возраста не выявило существенных качественных различий их пигментного состава (рис. 5), которые наиболее заметны только в полосе Сорэ около 450 нм. Очевидно, что препарирование, гомогенизация образцов приводит к неизбежному нарушению их интактной структуры, что сказывается на результате.
Рис. 5. Спектры поглощения изолированных фотосинтезирующих пигментов хвои первого года Р. sylvestris разного возраста: 72 года (нижняя кривая) и 8 лет (верхняя)
Таким образом, флуоресцентные характеристики больше связаны со структурной организацией хлоропластов, к зменению которых они оказались более чувствительны. Это справедливо как для импульсно модулированной спектроскопии, так и для стационарной.
Стационарная флуоресценция, записанная непосредственно с поверхности нативной хвои, выявила существенные возрастные различия, рис. 6. Спектры испускания флуоресценции в обоих случаях получены при длине возбуждающего потока ^ех = 450 нм и одинаковой спектральной ширине возбуждения и эмиссии 5 нм. В данном случае возрастное различие отчетливо выражено, происходит перераспределение излучения и инверсия двух индикаторных максимумов интенсивности эмиссии флуоресценции хлорофилла при ^ет = 680-681 и А,ет = 732-735 нм. Спектры флуоресценции не только выявляют возрастные различия, но и позволяют сделать предположения об их природе. Поскольку максимумы интенсивности флуоресценции около 685 нм к максимуму около 725 нм примерно соответствуют флуоресценции ФС II и ФС I, то их отношение является приблизительной оценкой их численного отношения.
Рис. 6. Различие в спектрах эмиссии флуоресценции возбужденной при Хех = 450 нм в образцах хвои первого года (правый максимум) и пятого (левый максимум) старой сосны Р. sylvestris
Это указывает на более высокое содержание ФС II в хлоропластах более старой хвои по сравнению с содержанием этих фотосистем в более молодой хвое, где доминирует ФС I. Помимо этого, отличие спектров флуоресценции нативной хвои разного возраста в области около 500 нм, указывает на качественное различие состава каротиноидов и ксантофиллов, непосредственно участвующих в нефотохимическом тушении и регуляции избытка световой энергии. Таким образом, флуоресцентная спектроскопия позволяет выявить тонкие возрастные различия в нативных хлорофиллсодержащих структурах хвои сосны.
Ранее импульсно-модулированная техника была использована главным образом при изучении влияния окружающей среды на фотосинтетическую способность других видов сосны, в частности, исследовано влияние температуры, фотопериода и парциального давления С02 на фотосинтез сосен Ртш banksiana [7] и Ртш taeda [8].
Результаты представленной работы показали, что флуоресцентные характеристики хлорофилла Ртш sylvestris чувствительны не только к внешним, экологическим факторам окружающей среды, но и к тонким возрастным изменениям его микроокружения в фотосистемах хлоропластов.
Фотосинтетический аппарат хвои сосны представляет собой устойчивую в функциональном отношении структуру, его физиологические свойства мало меняются с возрастом и не обнаруживают явных признаков сенильных деструктивных изменений. Это находится в соответствии с отрицательными результатами поиска структурных признаков старения у остистой сосны [1]. Однако, как показали результаты данной работы, с возрастом дерева заметно меняется стратегия перераспределения и использования поглощенной световой энергии. У молодых деревьев
доминирует фотохимическая конверсия, направленная на биосинтез ассимилянтов, у старых -фотозащитная функция, утилизация её избытка и обеспечение долгосрочных энергетических запасов в виде синтеза АТР или формирования градиента протонов на мембранах тилакоидов. В последнем случае преобразование происходит менее расточительно, с более низкими потерями и нерегулируемой, необратимой диссипацией в виде тепла и флуоресценции.
Поиск новых, информативных, экспериментально унифицированных и в то же время достаточно простых биологических маркеров старения и разработка новых, неповреждающих способов определения возраста хвойных видов актуален для дальнейшего развития концепций старения, практической дендрологии и профессионального растениеводства. Наиболее чувствительные к возрасту дерева характеристикии флуоресценции хлорофилла, например, коэффициент qN и др., могут быть использованы как маркеры для экспресс-определений возраста дерева.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lanner K.M., Connor K.F. Does bristlecone pine senesce? // Experimental gerontol. 2001. Vol. 30. P. 675-685. 2. Genty B., Briantais J-M., Raker N.R. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence // Biochim. Biophys. Acta. 1989. Vol. 990. P. 87-92. 3. Kramer D.M., Johnson J., Kiirats O., Edwards G.E. New flux parameters for the determination of QA redox state and excitation fluxes // Photosynthesis Research. 2004. Vol. 79. P. 209-218. 4. Portable Chlorophyll Fluorometer PAM-2100. Handbook of Operation. Heinz Walz GmbH, 2003. Effeltrich, Germany. 195 p. 5. Bolhar-Nordenkampf H.R., Long S.P., Baker N.R., Oquist G., Schreiber U., Lechner E.G. Chlorophyll fluorescence as probe of the photosynthetic competence of leaves in field: A review of current instrumentation // Funct. Ecol. 1989. Vol. 3. P. 497-514. 6. La Porta N., Bertamini M., Nedunchezhian N., Muthuchelian K. High irradiance induced changes of photosystem 2 in young and mature needles of cypress (Cupressus sempervirens L.) // Photosynthetica. 2004. Vol. 42. P. 263-271. 7. Busch F., Norman P.A., Ensminger H., Ensminger I. Increased air temperature during stimulated autumn conditions does not increase photosynthetic carbon gain but affects the dissipation of excess energy in seedlings if the evergreen conifer jack pine // Plant Physiol. 2007. Vol. 143. P. 1242-1251. 8. Hymus G.I., Ellsworth D.S., Baker N.R., Long S.P. Does free-air carbon dioxide enrichment affect photochemical energy use by evergreen trees in different seasons? A chlorophyll fluorescence study of mature loblolly pine // Plant Physiol. 1999. Vol. 120. P. 1183-1191.
Сведения об авторах
Кашулин Петр Александрович - д.б.н., главный научный сотрудник; e-mail: [email protected] Калачёва Наталья Васильевна - младший научный сотрудник; e-mail: [email protected]
