CC BY
63
УДК 615.011.4:615.225.2
І.С.Чекман, Т.Ю.Небесна
дослідження фізико-хімічної взаємодії доксдзозину з днк: фармакологічний аспект
національний медичний університет імені О.О. Богомольця (м. Київ)
Дослідження виконували на кафедрі фармакології та клінічної фармакології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця в межах науково-дослідної держбюджетної теми «Розробка та впровадження нових технологій лікування артеріальної гіпертензії (експериментально-клінічне дослідження)», номер державної реєстрації-0107и003592.
Вступ. Доксазозин - похідне хіназоліну, що має альфа1-адреноблокуючі властивості. Фармакологічними показаннями до застосування доксазозину є артеріальна гіпертензія та доброякісна гіперплазія простати. За даними багатоцентрового клінічного дослідження ALLHAT («Антигіпертензивна та гіполіпіде-мічна терапія для попередження серцевих нападів») доксазозин може викликати серцеву недостатність, як ускладнення терапії артеріальної гіпертензії [4]. Механізми розвитку цієї побічної реакції невідомі, однак встановлена властивість доксазозину викликати апоптоз кардіоміоцитів людини та тварин. В експериментальних дослідженнях показано, що доксазозин також викликає апоптоз в культурі клітин пухлини простати і затримує поділ гладеньком’язевих клітин коронарних судин [11]. Описані властивості доксазо-зину зумовили зменшення його застосування в якості антигіпертензивного препарату, але стали підставою для проведення досліджень по профілактиці та лікуванню раку простати за допомогою альфа1-адреноблокаторів. Рак простати займає перше місце серед усіх пухлинних захворювань чоловіків, а за показником смертності, зумовленої новоутвореннями, в цій групі пацієнтів поступається лише раку легенів. Основними методами лікування цього захворювання на сьогоднішній день є хірургічне видалення простати та гормонотерапія андроген-чутливих пухлин [6]. Однак, ці заходи не дають задовільних результатів, оскільки частими є метастази та рецидиви хвороби. Тому актуальним є пошук лікарських засобів, які б попереджали розповсюдження метастазів та повторне утворення пухлин у людей з груп ризику. Нещодавно було показано, що доксазозин пригнічує утворення метастазів та стимулює апоптоз в клітинах пухлини простати у щурів, однак
механізми таких ефектів не пов’язані з впливом на адренорецептори і дотепер є невста-новленими [5].
Одним із можливих механізмів дії докса-зозину, що обговорюється в літературі, є прямий пошкоджуючий вплив на ДНК [6].
Тому метою даної роботи було дослідити можливість фізико-хімічної взаємодії між ДНК та доксазозином методами спектрофотометричного титрування та гель-електрофорезу.
Об’єкт і методи дослідження. Для дослідження взаємодії доксазозину з ДНК реєстрували зміну його електронного спектру при титруванні розчином ДНК фага лямбда в фізіологічному розчині. Для розрахунку на основі даних УФ-спектроскопії констант зв’язування доксазозину з ДНК, а також числа пар нуклеїнових основ, яке займає одна зв’язана молекула ДНК, застосовували модель МакГі та фон Хіппеля [1, 9]. На відміну від класичної моделі Скетчарда для незалежних сайтів зв’язування ця модель враховує розміри ділянки зв’язування ліганду, вплив занятих ділянок на імовірність зв’язування з іншими молекулами ліганду, а також наявність ліганд-лігандної кооперативності. При цьому рівноважний процес:
(Вільний сайт зв’язування ліганда) + (Вільний ліганд) .к- (Зв’язаний ліганд) (1)
Описується виразом:
- = К (1 - п )
1 - п
1 - (п - 1)г
(2),
де г = [комплекс] / [ДНК0] - це щільність зв’язування, тобто відношення числа молей зв’язаних лігандів до загального числа пар основ матриці, т - молярна концентрація вільних лігандів, п - число основ пар ДНК, які займає одна зв’язана молекула ліганду, і які виключаються із взаємодії з іншими молекулами ліганду, К - константа рівноваги, яку отримують із залежності г/т від г при екстраполяції г до нуля.
Поглинання А при фіксованій довжині хвилі залежить від концентрації доксазози-ну Р та пар основ ДНК відповідно до рівняння:
А = Єсвоб И + Єсвя3 \коМПЛЄКС] = Є соб [Р ]„ + (є „я, - Є соб )[ДНК ]0 Г (3),
п-1
т
де 8 . та є - молярні коефіцієнти по-
^ своб связ ^ ^ '
глинання вільного та зв’язаного доксазо-зину, [Р0] та [ДНК]0-вихідні концентрації доксазозину та нуклеїнової кислоти (в парах основ). Величина є може бути розрахована
связ
шляхом екстраполяції значень А до високих концентрацій ДНК.
Величини г та т розраховуються з набору експериментальних значень оптичного поглинання розчину доксазозину при фіксованій довжині хвилі (А) від вихідної концентрації ДНК ([ДНК]0):
т = [Р]о - г[ДНК]о (4),
г = [Ро]/[ДНК]о * (А - А)/(Лю - А)
В даному рівнянні А - це значення оптичного поглинання при відповідній сумарній концентрації ДНК, а А0 та Ам-ці ж значення в початковій та кінцевій точках кривої титрування.
З залежності величини оптичного поглинання А доксазозину при довжині хвилі, відповідній максимуму поглинання цієї сполуки, від концентрації ДНК ([ДНК0]), вираженої в парах основ, за допомогою рівнянь (2) та (4) були розраховані значення К та п, представлені в таблиці. Розрахунок проводили автоматично, за допомогою програми wScatFit [12].
Для проведення гель-електрофорезу ДНК використовували агарозний гель з трис-борат-ЕДТА буфером при рН 8, 1 - 8, 2 та бромистим етидієм (0, 5 мкг/мл) в якості барвника. Маркерну ДНК (фрагменти розміром від 50 до 1000 пар основ) брали з набору O'GeneRuler™ 50 Ьр DNA Ladder, ready-to-use в концентрації 0, 1 мг/мл. До досліджуваної ДНК додавали розчин доксазозину в буферному розчині в концентрації 5, 20, 40 цМ. Маркерну ДНК змішували з буферним розчином та вносили разом з досліджуваною ДНК до камери з агарозним гелем у кількості 200 нг. Проводили електрофорез при градієнті напруги 1 В на 1 см геля протягом 1 години. Результати продивлялись в УФ-опроміненні та фотографували.
Результати досліджень та їх обговорення. УФ-спектр поглинання доксазозину та його сумішей з ДНК представлений на рис. 1. Доксазозин має максимуми поглинання при довжинах хвиль 246 та 332 нм. Оскільки максимум поглинання ДНК становить 260
нм, то дослідження комплексоутворення доксазозину з ДНК проводили по значенням поглинання при довжині хвилі 332 нм (де поглинання ДНК наближується до нуля).
Рис. 1. УФ-спектр поглинання доксазо-зину (верхня крива) та його сумішей з ДНК (нижні 7 кривих). Концентрація доксазозину - 40 цМ, концентрації ДНК - 1, 25; 1, 8; 2, 8; 4, 2; 6, 3; 9, 5; 14, 25 цМ. Максимуми поглинання доксазозину спостерігаються при довжинах хвилі 246 та 332 нм. Показовим є максимум 332 нм. Додавання ДНК до розчину доксазозину в концентрації від 1, 25 до 14, 25 цМ зменшує поглинання даного розчину при 332 нм.
Додавання ДНК до розчину доксазозину в концентрації від 1, 25 до 14, 25 цМ поступово зменшувало поглинання даного розчину при 332 нм. Це явище можна пояснити зниженням концентрації доксазозину у розчині за рахунок утворення комплексів з ДНК, які відрізняються спектром оптичної густини від чистого розчину доксазозину. Розрахована константа стійкості (К) комплексу до-ксазозину та ДНК становить 99 (±0, 6) М-1, а кількість пар основ ДНК, що приймають участь у зв’язуванні доксазозину - 1, 7 (±0, 3).
Для підтвердження та більш наочного відображення фізико-хімічної взаємодії доксазозину з ДНК було також проведено дослідження оптичної густини сумішей док-сазозину з ДНК в високих концентраціях. Результати цього дослідження представлені на рис. 2.
Рис. 2. Фрагмент (З50 - 400 нм) УФ-спектру поглинання доксазозину (верхня крива) та його сумішей з ДНК (нижні З криві). Концентрація доксазозину - 40 цМ, концентрації ДНК - 156, 78 та З9 цМ. Додавання ДНК до розчину доксазозину поступово (залежно від концентрації ДНК) зменшує поглинання даного розчину при ЗЗЗ нм.
Для дослідження можливості пошкоджуючого впливу доксазозину на ДНК була проведена інкубація ДНК з доксазозином з наступним електрофорезом. Результати гель-електрофорезу наведені на рис. З. За результатами гель-електрофорезу видно, що під дією доксазозину в концентраціях 5, З0, 40 ]іМ ДНК втрачає свою нативну структуру.
Рис. З. Результати гель-електрофорезу суміші ДНК та доксазозину: 1-маркерна
ДНК (фрагменти розміром від 50 до 1000 пар основ); З - контроль ДНК; З - контроль до-ксазозину; 4, 5, 6-суміші ДНК та доксазо-зину в концентрації 5, З0, 40 цМ відповідно. ДНК під дією доксазозину втрачає свою на-тивну структуру.
Експериментальні дослідження впливу до-ксазозину та інших альфа-адреноблокаторів на ДНК інтенсивно проводяться в усьому світі протягом останніх п’яти років. В роботі [5] досліджували експресію генів в клітинах людської андроген-залежної пухлини простати (лінія LNCaP) після впливу доксазози-ну методом біочипів, щоб краще зрозуміти механізми проапоптотичної дії даного препарату. В результаті проведених досліджень було встановлено, що доксазозин викликає апоптоз після З4-годинного лікування в концентраціях вище 5 цМ. Оскільки цей ефект не зникає при попередній обробці клітин не-зворотнім альфа-адреноблокатором фенокси-бензаміном (який не має власного проапоп-тотичного ефекту), зроблено висновок про те, що індукція апоптозу доксазозином не залежить від блокади адренорецепторів. Після 8- та З4-годинного лікування клітин З0 цМ розчином доксазозину змінюється рівень експресії 74 та 96 генів відповідно. Оскільки вказані гени відповідають за різноманітні процеси в клітині, такі як регуляція клітинного циклу, клітинна адгезія, міжклітинна передача сигналів, зрозумілим є широкий спектр впливу доксазозину на досліджувану клітинну лінію. Цікаво, що одним з генів, експресія яких підвищується під впливом доксазозину, є ген GADD45A, який зазвичай активується при руйнуванні ДНК. В експерименті з топоізомеразою І та плазмідною ДНК доксазозин викликав зміну розподілу топоізомерів ДНК в агарозному гелі, подібну до камптотецину - відомого інгібітора топо-ізомерази І. Однак при попередньому культивуванні топоізомерази І з доксазозином її активність не порушувалась. З проведених досліджень зроблено висновок про безпосереднє зв’язування та руйнування ДНК до-ксазозином, як механізм проапоптотичного впливу даного медикаменту [6]. В даній роботі результати гель-електрофорезу підтверджують таку теорію.
В іншому експериментальному дослідженні [4] встановлювали, чи викликає до-ксазозин апоптоз в культурах різних типів кардіоміоцитів. В роботі також досліджували інші альфа1-адреноблокатори - празозин, теразозин та 5-метилурапідил (селективний альфа1А-адреноблокатор). Культури кардіоміоцитів (типу HL-1, а також неонатальні кардіоміоцити людини та щурів) обробляли
лікарськими засобами в концентрації від 0, 1 до 50 цМ протягом 48 годин. Встановлено, що празозин та доксазозин викликають апоптоз в культурі кардіоміоцитів дозозалежно, в той час як теразозин та 5-метилурапідил такого ефекту не мають. Доксазозин проявляє про-апоптотичний вплив в концентрації від 0, 1 цМ після 7З годин, цей вплив є статистично достовірним при концентрації доксазозину 1 цМ після 48 годин. Концентрація 1 цМ досягається в клітинах людського організму (тобто, in vivo) в фізіологічних умовах при дозі препарату 8 мг (концентрація в плазмі крові 0, 1ЗЗ цМ) або 16 мг (відповідно, 0, З44 цМ) на добу. В цих дозах доксазозин та празозин, лікування пацієнтів якими може тривати дуже довгий час, викликають загибель кардіоміоцитів вже після кількох діб.
В таблиці показані константи стійкості комплексів лікарських засобів різних фармакологічних груп з ДНК. Порівняно з таким відомим антинеопластичним препаратом, як цисплатин, доксазозин має низьку константу стійкості з ДНК, на відміну від іншого адренергічного препарату - адреналіну. В роботі [11] встановлено, що після 1 години обробки адреналіном змінюється експресія 5, 7% генів, а після 18 годин - З0, 7% в клітинах ре-комбінантних фібробластів. При цьому найвиразніше зменшується експресія генів, які приймають участь в контролі клітинного циклу, що вказує на більш складний механізм впливу адреналіну на геном, ніж безпосередня взаємодія адреналіну з ДНК.
Висновки.
1. За даними спектрофотометричного титрування доксазозин проявляє фізико-хімічну взаємодію з ДНК, константа зв’язування доксазозину з ДНК становить 99 (±0, 6) М-1, а кількість пар основ ДНК, що приймають участь у зв’язуванні доксазозину - 1, 7 (±0, З).
З. За результатами гель-електрофорезу встановлено, що під дією доксазозину в концентраціях 5, З0, 40 цМ ДНК втрачає свою нативну структуру.
Попереднє введення агоністів або незворот-ного антагоністу феноксибензаміну (який не проявляє власного проапоптотичного ефекту) ніяк не впливає на клітинну загибель під дією празозину та доксазозину. Отже ці препарати викликають апоптоз кардіоміоцитів через механізм, не пов'язаний з блокуванням альфа-адренорецепторів. Описана клітинна загибель також не пов’язана з кальциневри-ном - відомим регулятором апоптозу кардіоміоцитів. Недослідженим залишається питання про можливість впливу доксазозину та празозину на процеси інтегрин-індукованого зв’язування кардіоміоцитів з зовнішньоклі-тинним фібронектином. Не виключено, що вплив доксазозину на кардіоміоцити реалізується саме через безпосередню взаємодію цього лікарського засобу з ДНК.
Перспективи подальших досліджень. Очевидною є необхідність подальших ґрунтовних експериментальних досліджень взаємодії як альфа-адреноблокаторів, так і препаратів інших фармакологічних груп з нуклеїновими кислотами, оскільки така взаємодія може пояснити механізми розвитку терапевтичних ефектів лікарських засобів і причини багатьох побічних ефектів. Одним із перспективних підходів до вивчення механізмів взаємодії препаратів з нуклеїновими кислотами є квантово-фармакологічне моделювання [З, З].
список літератури
1. Конъюгат порфирина с псораленом - новый ДНК-лиганд I К. Ванг, О.С. Федорова, В.Р. Трамбл [та ін.] II Биоорга-ническая химия. - 1999. - Т. 25, № 3. - С. 220 - 225.
2. Чекман І. С. Квантово-фармакологічні властивості адреналіну I І. С. Чекман, Т. Ю. Небесна II Доповіді Національної академії наук України. - 2007. - Т. 7. - С. 197
- 202.
3. Cheatham T.E. Simulation and modeling of nucleic acid structure, dynamics and interactions I T.E. Cheatham II Curr Opin Struct Biol. - 2004. - Vol. 14. - P. 360-367.
4. Doxazosin induces apoptosis in cardiomyocytes cultured in vitro by a mechanism that is independent of a1-adrenergic blockade I J. R. Gonzalez-Juanatey, M. J. Iglesias, C. Alcaide [et al.] II Circulation. - 2003. - Vol. 107. - P. 127-136.
5. Doxazosin induces apoptosis in LNCaP prostate cancer cell through DNA-dependent protein kinase down-regulation I J.
Таблиця
Константи стійкості комплексів лікарських засобів з ДНК
№ Назва лікарського засобу Фармакологічна група Константа стійкості комплексу лікарського засобу з ДНК
Цисплатин [З] Антинеопластичний ЛЗ 1, 72 x 104 M-1
Занамавір [8] Противірусний ЛЗ 1, ЗО x 104 M-1
Адреналін [З] Адреноміметик З, З x 10З M-1
Карвакрол [10] Компонент ефірної олії чебрецю 1, 55 x 10З M-1
Ферроцен [7] Експериментальний антинеопластичний ЛЗ З, 07 x 102 M-1
Доксазозин Адреноблокатор 0, 99 x 102 M-1
M. Arencibia, M. Rio, A. Bonnin [et al.] // International J. of oncology. - 2005. - Vol. 27. - P. 1617 - 1623.
6. Doxazosin-induced clusterin expression and apoptosis in prostate cancer cells / Y. H. Youm, H. Yang, Y. D. Yoon [et al.] // Urol Oncol. - 2007. - Vol. 25, № 6. - P. 483 - 488.
7. Electrochemical and spectroscopic investigations of protonated ferrocene-DNA Intercalation / A. Shah, R. Qureshi, N. K. Janjua [et al.] // Anal Sci. - 2008. - Vol. 24, №
11. - P. 1437-1441.
8. Interaction of zanamivir with DNA and RNA: Models for drug-DNA and drug-RNA bindings / N. Shohreh, F. G. Kahangi, A. Ebrahim [et al.] // Journal of molecular structure. - 2007. -Vol. 830, № 1-3. - P. 182 - 187.
9. McGhee J. Theoretical aspects of DNA-protein interactions: co-operative and non-co-operative binding of large ligands
to a one-dimensional homogeneous lattice / J. McGhee, P. von Hippel // Journal of Molecular Biology. - 1974. - Vol. 86.
- P. 469-489.
10. Nafisi Sh. Thymol and carvacrol binding to DNA: model for DRUG-DNA interaction / Sh. Nafisi, A. Hajiakhoondi, A. Yektadoost // Biopolymers. - 2004. - Vol. 74, № 5. - P. 345
- 351.
11. Novel a1-adrenergic receptor signaling pathways: secreted factors and interactions with the extracellular matrix / T. Shi, Z.-H. Duan, R. Papay [et al.] // Molecular pharmacology. -2006. - Vol. 70. - P. 129 - 142.
12. Photophysical and direct determination of binding constants of ethidium bromide complexed to E. coli DNA / E. M. Talavera, P. Guerrero, F. Ocana [et al.] // Applied Spectroscopy. - 2002. - Vol. 56, № 3. - P. 314 - 320.
УДК 615.011.4:615.225.2
исследование физико-химического взаимодействия доксазозина с днк: фармакологический аспект
Чекман И.С., Небесная Т.Ю.
Резюме. Доксазозин - лекарственное средство с альфа1-адреноблокирующей активностью, которое используется для лечения артериальной гипертензии и доброкачественной гиперплазии простаты. В работе исследована возможность физико-химического взаимодействия между доксазозином и ДНК методами спектрофотометрического титрования и гель-электрофореза. Установлено, что доксазозин проявляет физико-химическое взаимодействие с ДНК, под действием препарата в концентрациях 5, З0, 40 цМ ДНК утрачивает нативную структуру.
Ключевые слова: доксазозин, ДНК, комплекообразование.
UDC 615.011.4:615.225.2
INVESTIGATION Of Physical-chemical DOXAZOSIN-DNA INTERCALATION: Pharmacological ASPECT
Chekman I.S., Nebesna T.Yu.
Summary. Doxazosin is alpha^adrene^ic blocking agent, used &г treatment of arterial hypertension and benign prostatic hype^lasia. In the article possibility of physico-chemical inte^ action between doxazosin and dNa is studied by spectrophotometric titration and gel-electro-phoresis. It was shown that doxazosin has physico-chemical interaction with DNA, DNA loses its native confoгmation in presence of doxazosin in concentrations 5, З0, 40 цМ.
Key words: doxazosin, DNA, complexation.
Стаття надійшла 12.10.2009 р.
