ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ ЦИТОКІНА ЕМАР ІІ З β-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ МЕТОДАМИ ОПТИЧНОЇ СПЕКТРОСКОПІЇ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Фізика живого, Т. 20, No1, 2012. С17-21.

© Скоробогатов О.Ю., Бабенко Л. А.., Козлов А.В., Корнелюк О.І

УДК 577.32

ДОСЛІДЖЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ ЦИТОКІНА ЕМАР ІІ З Р-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ МЕТОДАМИ ОПТИЧНОЇ СПЕКТРОСКОПІЇ

Скоробогатов О.Ю., Бабенко Л.А., Козлов О.В., Корнелюк О.І.

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, вул. Академіка Заболотного, 150,

Київ, 03143, Україна email: skorobogatov. alx@gmail. com

Надійшла до редакції 20.03.2012

ЕМАР ІІ - ендотеліальний та моноцит-активуючий поліпептид ІІ, попередником якого є білок р43 - компонент високомолекулярного комплексу аміноацил-тРНК-синтетаз вищих еукаріот. Літературні дані свідчать про участь ЕМАР ІІ в патогенезі атеросклерозу, гіпоксичних станів, спадкової дегенерації сітківки, аутоімунних процесів. Відома його суттєва роль в запальних процесах, апоптозі та ангіогенезі пухлинних тканин. Біологічна активність ЕМАР ІІ створює передумови для його застосування в якості імуномодулюючого та протипухлинного препарату. В світовій фармакологічній практиці на сьогоднішній день широкозастосовуваним є в-циклодекстрин - олігомер залишків а-О-глюкози, який інтенсивно використовується при створенні лікарських препаратів в якості допоміжного агента, здатного знизити рівень агрегації білкової компоненти, підвищити стійкість до дії протеолітичних ферментів крові/ШКТ та збільшити розчинність. В даній роботі досліджено основні параметри зв’язування ЕМАР ІІ з в-циклодекстрином, та запропоновано можливий механізм їх взаємодії.

Ключові слова: ЕМАР ІІ, в-циклодекстрин, спектроскопія.

ВСТУП

Загальновідомо, що злоякісні пухлини займають друге місце серед причин смерті в економічно розвинутих країнах та третє - в країнах, що розвиваються. По різним статистичним даним до 70% чоловіків працездатного віку страждають хронічним простатитом.

Дослідження процесів, які лежать в основі взаємодії злоякісних новоутворень з тканинами організмом, є важливими для розробки нових антипухлинних препаратів і підходів до лікування онкологічних захворювань.

Кількість лікарських засобів стрімко зростає на фармацевтичних ринках всіх країн світу. Для профілактики та лікування багатьох захворювань все частіше використовують рекомбінантні білки, нуклеїнові кислоти та інші генноінженерні продукти.

ЕМАР ІІ - ендотеліальний та моноцитактивуючий поліпептид ІІ, попередником якого є білок р43 -компонент високомолекулярного комплексу аміноацил-тРНК-синтетаз вищих еукаріот. Відомо, що цей пептид здатен модулювати ряд властивостей ендотеліальних клітин, моноцитів та лейкоцитів in vitro [1,2]. Важливо звернути увагу також і на гальмування росту ксенографтів раку простату людини, імплантованих під капсулу нирки мишей при обробці їх препаратом ЕМАР ІІ [3,4]. Здатність ЕМАР ІІ інгібувати неоангіогенез та стимулювати апоптоз

ракових клітин стала основою для дослідження питання про те, чи може він бути використаний в якості протипухлинного лікарського засобу. Одним з перспективних напрямків таргетної терапії є використання антиангіогенних, прокоагулятивних та проапоптичних лікарських засобів, що стало основою для вибору в якості об’єкта досліджень протипухлинного цитокіна ЕМАР ІІ.

Створення лікарської форми препарату передбачає застосування допоміжних речовин. В якості таких сполук сьогодні використовують ряд полімерів, серед яких досить ефективним є гептамер залишків а-Б-глюкози - Р-циклодекстрин (рис. 1), що успішно застосовується у фармакології завдяки здатності функціонувати в якості допоміжного агента, здатного знизити рівень агрегації білкової компоненти, підвищити стійкість до дії протеолітичних ферментів крові/ШКТ та збільшити розчинність [5,6].

Метою роботи було дослідження можливості утворення комплексу між Р-циклодестрином та рекомбінантним білком ЕМАР ІІ з подальшою можливістю використання комплексу в майбутньому для створення лікарської форми препарату.

Скоробогатов О.Ю., Бабенко Л.А., Козлов О.В., Корнелюк О.І.

Рис. 1. “Space-filling” (зліва) та хімічна (справа) моделі будови молекули ß-циклодекстрину.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Експресія та виділення рекомбінантного білка ЕМАР ІІ. З метою експресії та виділення рекомбінантного білка ЕМАР ІІ використовували методику, описану раніше [7]. Для експресії рекомбінантного білка в роботі було використано штам-продуцент, отриманий на основі реципієнта Esherihia coli BL21(DE3)pLysE. Штам трансформовано за загальноприйнятою методикою [8] сконструйованим нами плазмідним вектором рЕТ30а-ЕМАР ІІ, у якого під контролем промотора фага Е7 міститься ген, що кодує синтез цільового білка ЕМАР ІІ. Генетичним маркером плазміди рЕТ30а є ген kan, що забезпечує стійкість трансформованих клітин до дії канаміцину.

Одиничну колонію штама-продуцента

інокулювали в середовище Luria-Bertani (LB), яке містить г дріжжового екстракту, 10 г триптону, 10 г NaCl в 1 л з додаванням антибіотика канаміцину до кінцевої концентрації в розчині 30 мкг/мл та нарощували протягом ночі. Нарощену культуру інокулювали в свіже середовище LB та культивували при температурі 37 оС та інтенсивній аерації (150 об/хв) до досягнення нею оптичної густини 0,6 - 1,3

(залежно від часу культивування культури). Оптичну густину (ОГ600) визначали спектрофотометрично (спектрофотометр BioMate-5, Велика Британія) при довжині хвилі 600 нм.

Індукцію експресії рекомбінантного білка з промотора lacUV5 здійснювали шляхом додавання в культуральне середовище ізопропіл-ß-

тіогалактопіранозида (ІПТГ) до кінцевої концентрації 1 мМ.

Виділення та очистка рекомбінантного білка з клітин E. coli. На ультразвуковому дезінтеграторі проводили руйнування бактеріальних клітин (6 циклів: 20 сек сонікація, 20 сек перерва).

Рекомбінантний білок ЕМАР ІІ отримували із супернатанту лізованих клітин (буфер для лізису : 50 мМ Na-фосфат, 500 мМ NaCl, 10 мМ імідазол, 5 мМ ß-меркаптоетанол). Очистку рекомбінантного білка проводили методом металхелатуючої хроматографії на колонці з Ni-NTA-агарозою. Супернатант наносили на колонку з Ni-NTA-агарозою (Qiagen, США), білок елюювали буфером для елюції (50 мМ Na-фосфатний буфер, 150 мМ NaCl, 200 мМ імідазол, 5 мМ ß-меркаптоетанолу). Для фракцій, що містили цільовий білок, проводили діаліз.

Концентрацію очищеного білка визначали на спектрофотометрі BioMate-5 з урахуванням коефіцієнту молярної екстинції на довжині 280 нм, що складав 8730 см1 моль-1 (0,377 мг/мл). Коефіцієнт молярної екстинції визначали за даними амінокислотного аналізу за допомогою програми ProtParam (http://expasy.ch/cgi-bin/protparam).

Аналіз отриманого препарату проводили з допомогою SDS-гель-електрофорезу за методом Леммлі, використовуючи 12%-й розділяючий поліакриламідний гель із 0,1 % додецилсульфату натрію [9]. При цьому користувались сумішшю маркерних білків фірми Fermentas (Литва). Гелі фарбували барвником Coomassie blue R-250.

Дослідження взаємодії між рекомбінантним цитокіном ЕМАР ІІ та ß-циклодекстрином методом молекулярної адсорбційної

спектрофотометрії. Вимірювання зміни величин оптичної густини розчину рекомбінантного цитокіна ЕМАР ІІ при титруванні його розчином ß-циклодекстрину в буфері, що містив 50 мМ NaCl та 150 мМ NaP, рН=8,0, проводили на спектрофотометрі BioMate 5 (Англія) на довжині хвилі X = 280 нм в кварцевих кюветах з довжиною оптичного шляху l =

1 см. Початковий об’єм розчину білка в кюветі становив 100 мкл.

Методика флуоресцентних вимірювань для дослідження взаємодії між ЕМАР ІІ та ß-циклодекстрином. Для вивчення взаємодії досліджуваного білка з ß-ЦД проводили титрування розчину білка розчином ß-ЦД в буфері, що містив 50 мМ NaCl та 150 мМ NaP, рН=8,0. Спектри флуоресценції реєстрували на спектрофлуориметрі Hitachi Model 850 (Японія), обладнаному термостатованим кюветотримачем, температуру

зразка в якому визначали за допомогою хромель-алюмелевої термопари з точністю ± 0,2 оС.

Вимірювання проводили в кварцевих прямокутних кюветах з довжиною оптичного шляху 1 см. Спектральна ширина щілин для монохроматора збуджуючого світла та реєструючої системи становила 5 - 10 нм. Реєстрацію спектрів

флуоресценції білка в присутності ß-ЦД здійснювали при довжині хвилі збудження 280 нм. Спектри флуоресценції записували за допомогою автоматичного сканування в інтервалі довжин хвиль 300-400 нм. Реєстрацію флуоресценції проводили під кутом 90о до напрямку пучка збуджуючого світла при кімнатному значенні температури ^імн = 23°С.

Вимірювані значення інтенсивності флуоресценції корегували на розведення білка, використовуючи поправочний коефіцієнт:

розведення

F

білка

(1)

де Убілка i ¥дод - початковий об’єм білка та доданої речовини відповідно. Початковий об’єм розчину білка в кюветі становив 100 мкл.

Розрахунок параметрів зв’язування рекомбінантного цитокіну ЕМАР ІІ з 0-циклодекстрином. Значення параметрів зв’язування

- стехіометрії (n) та константи асаоціації (Ka) - було розраховано із застосуванням раніше описаної методики [10, 11] та наведеного нижче рівняння:

(р - р \

log

F

= l0g(Ka ) + nl0g([P - OA ]) , (2)

v F J

де F0 та F - інтенсивність флуоресценції флуорофору - ЕМАР ІІ - на довжині хвилі X = 337 нм відповідно за відсутності та в присутності ліганду, Ka

- константа асоціації, а n - стехіометрія комплексу, в программі OriginPro версії 8.0. Для отримання числових значень досліджуваних величин застосовано функцію Analysis ^ Fitting ^ Fit Linear, в результаті чого було отримано рівняння типу y = a + bx, де у та x

тотожні виразам log

( F _ F Л

F

та log([ß _ ÖÄ ]), в

v " /

той час як а та b - log (K,) та n відповідно.

Розрахунок енергетики процесу утворення комплексу ЕМАР II та ß-ЦД. Для цього використовували формулу розрахунку зміни

стандартної вільної енергії Гіббса AG° = -RTlnKa, де R

- газова стала, що є рівною 8,31 Джмоль-1К-1, Т -абсолютна температура (T = 296 К), Ка - константа рівноваги,

Статистична обробка результатів. Дані,

отримані в результаті проведеної роботи, виявилися статистично достовірними, про що свідчить

розрахунки критерію Стьюдента (t-тест) в пакеті програм STATISTICA 7.0, p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Виділення та очистка рекомбінантного білка з клітин E. Coli. Препарат рекомбінантного цитокіна EMAP II, виділеного за описаною вище методикою, було досліджено на чистоту використовуючи методику SDS-гель-електрофорезу за Леммлі. (рис. 2).

Рис. 2. Електрофоретичний контроль чистоти отриманого білка EMAP II (12%-ий розділяючий гель):

1 - рекомбінантний білок ЕМАР ІІ після діалізу;

2 - маркерна суміш (лізоцим, ЕМАР ІІ, овальбумін, бичачий сироватковий альбумін).

Чистоту отриманого препарату вважали більшою за 95%. На високий ступніь чистоти отриманого препарату вказують також значення оптичного

поглинання на довжинах хвиль 260 та 280 нм (OD260 та OD280 відповідно), величина відношення яких

(OD280/OD260) є індикатором відсутності домішок нуклеїнових кислот у отриманому розчині цільового білка. У нашому випадку вона становила 1,74.

Дослідження взаємодії між рекомбінантним цитокіном ЕМАР ІІ та ß-циклодекстрином

методом молекулярної адсорбційної

спектрофотометрії. В результаті дослідження зміни показника оптичної густини розчину рекомбінантного цитокіну ЕМАР ІІ, при титруванні його розчином ß-ЦД, виявилося, що досліджувана величина збільшується при підвищенні концентрації ß-ЦД (рис. 3). Величини оптичної густини, було

скореговано на оптичну густину розчину ß-ЦД відповідної концентрації на аналогічній довжині хвилі за умов відсутності білка ЕМАР ІІ.

З наведеного вище графіку видно, що оптична густина збільшується при підвищенні коцнентрації ß-ЦД до моменту досягнення еквімолярності

концентрацій рецептору та ліганду, після чого майже не змінюється, що свідчить про насичення всіх центрів зв’язування в складі ЕМАР ІІ.

На основі даних, отриманих врезультаті проведеного досліду, можливо висунути гіпотезу про наяність лише одного центу зв'язування в складі досліджуваного білка.

Скоробогатов О.Ю., Бабенко Л.А., Козлов О.В., Корнелюк О.І.

Рис. 3. Залежність величини оптичного поглинання розчину рекомбінантного цитокіна ЕМАР Hf від концентрації додаваного Р-ЦД.

Дослідження взаємодії між ЕМАР ІІ та Р-циклодекстрином методом флуоресцентної спектроскопії. Дані, отримані після проведення досліду з вимірювання величини інтенсивності флуоресценції розчину рекомбінантного цитокіну ЕМАР ІІ при підвищенні концентрації додаваного Р-ЦД, вказують на зменшення досліджуваної величини зі збільшенням концентрації ліганду (рис. 4).

Рис. 4. Графік залежності величин інтенсивності флуоресценції розчину рекомбінантного цитокіну ЕМАР ІІ на довжині хвилі емісії X = 334 нм від концентрації додаваного ліганду.

Очевидно, що останній викликає зниження

інтенсивності флуоресценції, що дає підстави стверджувати про наявність явища гасіння

флуоресценції досліджуваного білка, або зарахунок безпосереднього зв’язування з залишком відповідного хромофору, або з ділянкою на поверхні білкової глобули, що знаходиться недалеко від флуоресцентної амінокислоти та певних, індукованим цим

зв’язуванням, конформаційних перебудов.

Важливо зауважити також, що довжина хвилі збудження в даному досліді складала Хех = 280 нм, а, як відомо, при цих значеннях довжин хвиль екстинції збуджуються одночасно і тирозинові і триптофанові залишки. Тому можливий сайт зв’язування з молекулою в-ЦД може містити обидві амікислотні залишки.

Розрахунок параметрів зв’язування

рекомбінантного цитокіну ЕМАР ІІ з Р-циклодекстрином. Використовуючи дані було

побудовано графічну залежність величини 1§{(Іо-Ін)/Ін} від ^{[Б-СБ]}, де Іо та Ін - інтенсивності флуоресценції розчину білка ЕМАР ІІ за відсутності та при додаванні ліганду відповідно, які надалі використовувалися для розрахунку параметрів

зв’язування білка та ліганду (рис. 5).

Аналізуючи рис. 5, а саме таблицю, представлену на ньому, маємо рівняння прямої 2, де а = 4,97081 = 1§Ка,Ь = 1,04 = п, де Ка та п - костанта зв’язування та стехіометрія комплексу ЕМАР ІІ - в-ЦД відповідно.

Рис. 5. Графічна залежність величини ^{(Іо-Ін)/Ін} від lg{[B-CD]}. Пряма побудована шляхом використання функції Analysis ^ Fitting ^ Fit Linear в програмі OriginPro 8. В таблиці, наведеній на рисунку, представлено рівняння прямої типу y = a + b*x, та величини параметрів а та b.

Таким чином, константа виявилася рівною Ka = 9,3-104 моль-1, а стехіометрія комплексу ЕМАР ІІ - Р-ЦД П = 1,04.

Розрахунок енергетики процесу утворення комплексу ЕМАР II та Р-ДД. В результаті проведених експериментів, вдалося встановити AG° для реакції ЕМАР Hf + P-CD ^ EMAP II - Р-CD, що виявилася рівною AG° = -28,153 кДж моль-1, що свідчить про самочинність та екзергонічність даної реакції.

ВИСНОВКИ

Отримані флуоресцентні дані свідчать про наявність 1 центру зв’язування Р-ЦД в складі білка ЕМАР ІІ, що добре узгоджується з результатами,

гетеротрансплантантов рака простаты человека // Короткі повідомлення. - 2008. - Т. 14, № 4. - С. 719 - 479.

5. Клочков С. В., Компанцева Е. В. Бердник Е. Н., Ботезат-Белый Ю. К., Бабилев Ф. В. Исследование клатрообразования р-циклодекстрина с метапрогеролом // Хим.-фарм. журнал. - 1991. - 25, № 11. - C. 67-69.

6. Беликов В. Г., Компанцева Е. В., Гаврилин М. В., Умнова Э. Ф. Использование возможности бета-циклодекстрина для совершенствования процесса получения преднизалона // Хим.-фарм. журнал. - 1991. - № 2. - С. 48-49.

7. Л. А. Бабенко, О. Ю. Скоробогатов, О. Л. Дубровський, О. І. Корнелюк. Оптимізація бактеріальної експресії протипухлинного цитокіна ЕМАР ІІ в клітинах Esherichia Coli BL21(DE3)pLysE. Мікробіологія і біотехнологія.

8. Маниатис Т., Фрич Э., СємбрукДж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984.

- 479 с.

9. Laemmli U. K Cleavage of structural proteins during the aasembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. -277. - № 259. - P. 680-685.

10. FengXZ, Lin Z, Yang L J, Wang C andBai C L. Investigation of the interaction between acridine orange and bovine serum albumin // Talanta. - 1998. - Vol. 47. - P. 1223.

11. Barik A, Priyadarsini KI and Mohan H. Photophysical Studies on Binding of Curcumin to Bovine Serum Albumin // Photochem. Photobiol. - 2003. - Vol.77. - P. 597.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАЕМОДЕЙСТВИЯ ЦИТОКИНА ЕМАР II С р-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ МЕТОДАМИ ОПТИЧЕСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Скоробогатов А.Ю., Бабенко Л.А., Козлов А.В., Корнелюк А.И.

ЕМАР II - эндотэлиальный и моноцит-активирующий полипептид II, предшествинником которого является белок р43 -компонент высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз высших эукариот. Литературные даные свидетельствуют о том, что ЕМАР II учавствует в патогенезе атэросклероза, гипоксических осложнениях, наследственной дегенерации сетчатки, аутоимунных процесах. Известна его важная роль в воспалительных процесах, апоптозе и ангиогенезе опухолевых тканей. Биологическая активность ЕМАР II создает предпосылки для использования его в качестве иммуномодулирующего и противоопухолевого препарата. В мировой фармокологической практике на сегодня широко используется p-циклодекстрин - олигомер остатков a-D-глюкозы, который интенсивно используют в процесе создания фармакологических препаратов в качестве вспомогательного агента, способного снизить уровень агрегации белковой компоненты, повысить его стойкость к действию протэолетических ферментов крови и ЖКТ и увеличить расстворимость. В даной работе исследовано основные параметры связывания ЕМАР II с p-циклодекстрином и предложен возможный механизм их взаемодействия.

Ключевые слова: ЕМАР II, p-циклодекстрин, спектроскопия.

INVESTIGATION OF B-CYCLODEXTRIN INTERACTION WITH CYTOKINE EMAP II USING OPTICAL SPECTROSCOPY METHODS

Skorobogatov O.Yu., Babenko L.A., Kozlov O.V., Kornelyuk O.I.

EMAP II - endothelial and monocyte-activating polypeptide II, precursor of which is protein p43 - component of macromolecular complex of aminoacyl-tRNA-synthetase of higher eukaryotes. It is known from literature sources, that EMAP II plays an important role in atherosclerosis pathogenesis, hypoxic states, inherited retinopathy and autoimmune processes. Its key role in inflammatory processes, apoptosis and tumor tissues apoptosis has been proven as well. Background of using EMAP II as an immunomodulating and antitumor compound has emerged due to its many-sided biological activity. B-cyclodextrin - oligomer of a-D-glucose residues -is being widely used in worldwide pharmacology practice. It acts as a helper agent during the process of pharmacological compounds development. It is capable of decreasing the protein component aggregation rate, increasing its sustainability to gastrointestinal tract and blood enzymes, increasing the solubility. Main binding properties of EMAP II and p -cyclodextrin were investigated and possible interaction mechanism was suggested in this study.

Key words: EMAP II, p-cyclodextrin, spectroscopy

отриманими методом адсорбційної

спектрофотометрії. Вірогідно, взаємодія Р-ЦД з ЕМАР ІІ може приводити до стабілізації структури цитокіна в комплексі , що є предметом подальших досліджень.

Література

1. Kao J., Ryan J., Brett G., Chen J., Shen H., Fan Y., Godman G., Familetti P. C., Wang F., Pan Y. E., Stern D., Clauss M. Endothelial monocyte-activating polypeptide II. A novel tumor-derived polypeptide that activates host-response mechanisms // J. Biol. Chem. - 1992. - 267. - P.20239 - 20247.

2. Tas M. P., Murray J. C. Endothelial-monocyte-activating polypeptide II // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 1996. - 28.

- P. 837 - 841.

3. Reznikov A. G., Chaykovskaya L. V., Polyakova L. I., Kornelyuk A. I. Antitumor effect of endothelial monocyte-activating polypeptide-II on human prostate adenocarcinoma in mouse xenograft model // Exper. Oncol. - 2007. 29, N 4.

- P. 267 - 271.

4. Возианов А. Ф., Резников А. Г., Корнелюк А. И., Романенко А. М., Чайковская Л. В., Полякова Л. И., Григоренко В. Н. Влияние препаратов рекомбинантного белка ЕМАР II на рост, гистологические и гистохимические характеристики