CC BY
61Фізика живого, Т. 2Q, Nol, 2Q12. С.28-34. © Дринь Д.О.
УДК 576.32/.36
ВПЛИВ ГОЛОДУВАННЯ НА РІВЕНЬ ЕКСПРЕСІЇ ПРОТЕЇНІВ ДЕПО-ЗАЛЕЖНОГО ВХОДУ КАЛЬЦІЮ STIM1 ТА ORAI1 В КЛІТИНАХ РАКУ ПРОСТАТИ ЛЮДИНИ (РС-3)
Дринь Д.О.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Навчально-науковий центр «Інститут біології»,
кафедра біофізики, Київ Україна Університет наук та технологій міста Лілль, Франція Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, Україна e-mail: [email protected]
Надійшла до редакції 27.09.2012
Досліджено вплив голодування на рівень експресії протеїнів депо-залежного входу кальцію STIM1 та Orai1 в клітинах раку простати людини (РС-3). Експресія протеїнів депо-залежного входу кальцію STIM1 та Orai1 як на рівні мРНК, так і на рівні білків значно збільшилась у порівнянні з контролем. Подальші дослідження допоможуть дослідити роль цих білкових субодиниць в процесах проліферації, рухливості та метастазування ракових клітин в організмі людини, а також у перспективі дослідити функційні наслідки гіперекспресії білківSTIM1 ТА Сгаі1 за допомогою методів петч-клемп та кальціометрії.
Ключові слова: рак простати людини, протеїни депо-залежного входу кальцію STIM1 та ORAI1, голодання
ВСТУП
Канцерогенез — це велика група різних захворювань, за участю яких відбувається неконтрольоване зростання розміру та числа клітини. При канцерогенезі характерно ділення і ріст клітин безконтрольного характеру, що призводить до утворення та зростання злоякісних пухлини, що мігрують в інші частини організму дюдини[1].
Захворюваність на злоякісні пухлини безперервно зростає. Щорічно у світі реєструється близько 6 мільйонів нових випадків захворювання злоякісними пухлинами. Нині кожний 50-тий українець хворів чи хворіє певними онкологічним захворюванням. За прогнозами Всесвітньої організації охорони здоров'я, до 2020 року онкопатології вийдуть на перше місце, а за даними Американської асоціації госпіталів це станеться вже за 5 років. Злоякісні пухлини як причина смерті знаходяться на другому місці (20% загальної смертності) після серцево-судинних захворювань. Один з чотирьох жителів захворює на рак при загальній 5-річній виживаності 40%. [2, 3]. Рак простати (лат. Prostatic adenocarcinoma) —
злоякісне новоутворення, що виникає з епітелію альвеолярно-клітинних залоз. Рак простати є причиною майже 10 % смертей від раку у чоловіків та однією з головних причин смерті у похилих чоловіків. У США рак простати є третьою за частотою причиною смерті від злоякісних пухлин 3.
При канцерогенезі підвищується метаболізм та рівень енергетичних затрат клітини, в тому числі і
потреба в збільшеній кількості, надзвичайно важливого для нормальної життєдіяльності та функціонування клітини, мікроелемента як кальцію, однією з головних функцій якого є роль внутрішньоклітинної сигнальної молекули. Внаслідок активного використання внутрішньоклітинних макромолекул та мікроелементів виникає стан голодування клітин [13].
У спокої концентрація іонів кальцію в цитоплазмі підтримується на дуже низькому рівні у порівнянні з іншими іонами внутрішньоклітинного середовища - 10-7М, і тому може бути швидко збільшена (Parekh et al., 2005). Клітина може збільшувати концентрацію кальцію в цитоплазмі за рахунок виходу кальцію з внутрішньоклітинних депо або за рахунок входу кальцію з позаклітинного середовища через плазматичну мембрану (ПМ) [4]. Швидкий вихід кальцію з внутрішньоклітинних сховищ відбувається через активацію фосфоліпазного шляху (PLC) та рецептори інозитол 1,4,5-трісфосфата (IP3R), які є кальцієвими каналами ендоплазматичного ретикулуму (ЕР), і відкриваються після зв'язування з інозитол -1,4,5-тріфосфатом (IP3). У незбудливих клітинах один з основних шляхів входу кальцію з позаклітинного середовища - це депо-керовані канали (store-operated channels - SOC), які активуються у відповідь на спустошення внутрішньоклітинних кальцієвих депо [5, 6]. На сьогоднішній день відомо декілька сімейств депо-керованих трансмембранних білків, одним іх них являються представники сімейства Orai. Механізм
передачі сигналу від спустошеного депо до каналів ПМ залишається маловивченим. Нещодавно були виявлені білки сімейства STIM1 [7, 8], які служать кальцієвими сенсорами ЕР (Liou et al., 2005) [9]. При спустошенні депо білки STIM гомоолігомерізуются і переміщаються в puncta, випинаючись в ПМ, що призводить до активації депо-керованих каналів. Основний механізм передачі сигналу від спустошеного депо до каналів плазматичної мембрани
- це шлях конформаційнного сполучення, що веде до прямої взаємодії білків ПМ (Orai) з білками ЕР (STIM) (Parekh та ін, 2005;. Wang та ін, 2009.) [10]. У нещодавніх роботах було експериментально доведено колокалізацію елементів депо-керованого входу, а саме взаємодію кальцієвої АТФази - SERCA (закачує кальцій в депо) з IP3R (через який викидається кальцій з депо) далі зі STIM (що є кальцієвим сенсором ЕР) і білками ПМ, що формують пору SOC (Wang і співавт., 2009; Manjarms та ін, 2010) [11].
Orai1 (або CRACM1, TMEM142a) також є одним із представників нового класу іонних каналів , що активується вивільненням іонів кальцію і належить до групи CRAK-каналів (Calcium Release-Activated channel(s)) (Hoth, Penner, 1992; Zweifach, Lewis, 1993) Коли в депо ендоплазматичного ретикулюма значно знижується кількість іонів кальцію, відбувається повільна активація каналів групи CRAK, та повільне поповнення первинного рівня кальція. Білки Orai формують пору CRAK -каналу. Відомо, що CRAK -каналам властива іонопровідність типова для
потенціал залежних кальцієвих каналів та
надзвичайна селективність до іонів кальцію[12, 19]. Крім Orai1 виявлено ще два представники сімейства CRAK -каналів - це Orai2 (або CRACM2, TMEM142b) та Orai3 (CRACM3, TMEM142c). До сімейства сенсорних трансмембранних білків ЕР належать STIM1 та STIM2. Спряжена дія та коекспресія протеїнів STIM1 та Orai1 призводить до виникнення надзвичайно потужного Icrak - кальцієвого струму [19]. Слід зазначити, що молекулярна природа спустошення депо ендоплазматичного ретикулюма та роль в цих процесах SOC та CRAK-каналів ще до кінця не вивчена.
Загальновідомо, що одним із проявів канцерогенезу є метастазування пухлини у інші частини організму, що є однією з основних причин смерті хворих на рак. Відомо, що Orai1 і STIM1, обидва з яких беруть участь в процесі надходження кальцію, необхідних для міграції клітин пухлини та їх метастазування, також відіграють важливу роль в цих процесах. Пригнічення синтезу білкових субодиниць Orai1 або STIM1 за допомогою РНК-інтерференції в сильно метастазуючих клітинах раку молочної залози людини або лікування фармакологічними інгібіторами депо-керованих кальцієвих каналів знижувало рівень метастазування пухлини на тваринних моделях. Нещодавно отримані дані показують важливу роль Orai1 і STIM1 в розвитку пухлинних метастазів, що дає змогу розглядати ці білкові субодиниці як
потенційні терапевтичні мішені в процесі лікування раку [14,15].
Вплив хіміотерапії на ракові клітини призводить до порушення активності кальцієвої помпи, що в свою чергу веде до зменшення кількості іонів кальцію в цитоплазмі. Експресія протеїнів депо-залежного входу кальцію STIM1 та Orai1 значно підвищується за умов зниження концентрації іонів_кальція в клітині, що підвищує рівень виживання клітин при лікуванні методом хіміотерапії [16, 17].
Метою даної роботи було дослідити вплив умов голодування на рівень експресії протеїнів депо-залежного входу кальцію STIM1 та Orai1 в ракових клітинах простати людини (PC-3), а також на роль протеїнів в розвитку та виживанні ракових клітин за умов нестачі поживних речовин.
Об'єктом досліджень ролі CRAK-каналів в процесах утворення та розвитку раку простати людини було вибрано найбільш вивченого представника сімейства - Orai1, а серед сенсорів ЕР -STIM1. Роль білкових субодиниць Orai1 і STIM1 в розвитку раку простати людини та процесах його метастазуваннях до кінця ще не з'ясовано.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Лінії клітин. В роботі використовувалися клітини раку простати людини (PC-3). Клітини культивувалися в середовищі RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium, USA) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS from Gibco ®, Велика Британія) і 1% L-глутаміну при температурі 370 С в атмосфері 5% СО2.
Виділення тотальної РНК. Виділення тотальної РНК з культури клітин раку простати здійснювали за допомогою реактиву TRI® Reagent (Sigma, США) згідно з протоколом виробника. Для виключення контамінації кДНК домішками чужорідної ДНК тотальну РНК оброблювали ДНКазой “Turbo” (Ambion, США). Для реакції зворотної транскрипції використовували гексануклеотидні праймери.
УФ - спектрофотометрія РНК. Максимум поглинання всіх нуклеотидів 260 нм (окрім цитидіну, 270 нм). Вимірювання проводили на спектрофотометрі NanoDrop1000 (США). На вимірювальну поверхню наносили 1 мкл досліджуваної проби та вимірювали поглинання у діапазоні 200-400 нм. Концентрацію РНК брали з розведенням 2 мкл РНК в 60 мкл деіонізованої води dH2O.Перевірка якості та концентрації виділеної тотальної РНК перевіряли за допомогою РНК гель електрофорезу.
РНК гель електрофорез. Для приготування гелю використовували 1 г агарози 25 мл 1Х ТВЕ буферу для отримання необхідної щільності гелю 1%. Для візуалізації фрагментів додавали бромістий етидій, що інтеркалюється між азотистими основами і флюоресцюює в УФ-променях у концентрації 0,1 мкМ. До проб додавали суміш низькомолекулярних
барвників бромфенолового синього та ксилен ціанолу, щоб візуалізувати хід електрофорезу. Камеру, де проходить електрофорез, заповнювали буферним розчином TВЕ (склад буферу: містить ЕДTА, тріс та борну кислоту).
Зворотня транскрипція (ЗТ)(кДНК). Для отримання кДНК при проведенні реакції зворотньої транскрипції до виділеної тотальної РНК додавали випадкові праймери (Random hexamers, invitrogen) та деіонізовану воду, нагрівали суміш до 700C, потім готували суміш з ферментом зворотньою транскрипатзою 50 U/uL (MULV rt, Invitrogen), для попередження пошкоджень отриманої тотальної РНК додавали інгібітор РНКази 20 U/^L (RNase inhibitor, invitrogen), 2,5 ммоль дАТФ, дГTФ, дTTФ, дЦГФ, буфер 10Х без Mg2+, 25 ммоль MgCI2, 0,01 %, суміш розігрівалася до 420 та 700 С0, отриманий продукт зберігали у холодильній камері при -200 С0.
Полімеразна реакція (ПЛР). ПЛР проводили на ампліфікаторі (Perkin Elmer 480 DNA Thermal Cycler PCR System). До компонентів реакційної суміші об’ємом 25 мкл входили: ПЛР буфер 10Х без Mg2+, 67 мМ трис-НСІ (рН 8,6), 16,6 мМ (Nh4)2SO4, 25 мМ MgCI2, по 2,5 мМАТФ, дГTФ, дTTФ, дЦГФ, по 1,5 мкл кожного з специфічних праймерів, 2 од. TаqGold-полімерази (Sigma®), по 10 мкл зразків виділеної кДНК. Кількість циклів ампліфікації складала 35 . Кожний цикл, в свою чергу, складався із таких етапів: денатурація кДНК при 95°С — 30 сек.; відпал праймерів при температурі 60°С — 30 сек.; синтез комплементарних ланцюгів при 72°С — 40 сек. В якості внутрішнього контролю використовували гени «домашнього хозяйства» (housekeeping genes) HPRT Початкову стадію денатурації та кінцеву стадію елонгації було подовжено до 5 і 7 хвилин, відповідно.
ДНК гель електрофорез. Детекцію продуктів ампліфікації проводили методом електрофорезу в агарозному гелі, забарвленому бромідом етидія, з використанням трис-боратного буфера при градієнті напруги 10 В/см. Для приготування гелю для електрофорезу для розділення продуктів ампліфікації, додавали до 1 г агарози 25 мл 1Х TВЕ буферу для отримання необхідної щільності гелю 1%, виходячи з розміру отриманої ДНК. Для візуалізації фрагментів додавали до агарозного гелю бромістий етидій, що інтеркалюється між азотистими основами і флюоресцюює в УФ-променях у концентрації 0,1 мкМ. Визначення розміру фрагментів проводили шляхом порівняння з ДНК-лінійкою, що містила лінійні фрагменти відомої довжини. До зразків додавали суміш низькомолекулярних барвників бромфенолового синього та ксилен ціанолу, щоб візуалізувати хід електрофорезу. Електрофорез проводили при напрузі на електродах 120 В та при силі струму 150 мА протягом 30 хв. Камеру, де проходив електрофорез, заповнювали буферним розчином TВЕ (склад буферу: містить ЕДTА, тріс та борну кислоту). Результати оцінювали при перегляді
гелю після електрофорезу на трансілюмінаторі під УФ-світлом по наявності (або відсутності) червоно-помаранчевих фрагментів ДНК певного розміру. Специфічність ампліфікованого фрагмента ДНК визначали його положенням (за розміром) по відношенню до фрагментів стандартних маркерів.
Виділення білку. До чашок Петрі з культурою клітин додавали 2 мл фосфатно-сольового буферу (PBS), потім лізували їх розчином RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay buffer) (містить: RIPA, NaОV, інгібітори протеаз (Sigma®)). білок інкубували на льоду та проводили сонікацію.
SDS - PAGE електрофорез. Аналітичний гель-електрофорез (SDS-PAGE) виконували за модифікованою методикою Лемлі. Використовували такі буферні розчини: анодний буфер: 0,2 М трис-НО, рН 8,9; катодний буфер: 0,1 М трис, 0,1 М трицин, рН 8,25; буфер для концентруючого гелю: 0,71 М трис-НСІ, рН 8,45, 0,1% SDS; буфер для розділяючого гелю: 1 М трис-НСІ рН 8,45, 0,1% SDS; акриламід та метилен-біс-акриламід - у вигляді “Acryl/Bis 37,5 : 1 Solution 30%” (“Anachem”, США). Смуги білків забарвлювали Кумасі блакитним R-250 (“Sigma”, США). Використовували маркери молекулярної маси “Ultra-low Range Molecular Weight Marker (1,06-26,6)” (“Sigma”, США).
Вестерн-блот аналіз (імуноблотаналіз). Після електрофорезу здійснювали електроперенесення білків з поліакриламідного гелю на нітроцелюлозну мембрану Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Швеція) у наступній буферній системі: 48 мМ трис; 39 мМ гліцин; 0,037% SDS; 20% метанол. Після блокування вільних місць зв’язування за допомогою знежиреного молока, мембрану поміщали на всю ніч при 0оС у розчин моноклональних антитіл миші (BD Biosciences, San Jose, CA) та кролика (ProSci, Poway, CA) з TNT проти досліджуваних білків STIM1 та ORAI1, відповідно, а потім у розчин вторинних антитіл проти антитіл миші та кроля (Santa Cruz Biotech., CA, USA). Після цього мембрану інкубували в системі детекції ECL (Santa Cruz Biotech., CA, USA) (0,125 мл кожного реагенту ECL на 1см2 мембрани). Після 2-хвилинної інкубації мембрану прикладали до рентгенівської плівки (Kodak, USA). Експозиція тривала 2 хв. при кімнатній температурі. Дані Вестерн-блотінгу було оброблено за допомогою комп’ютерної програми TotalLab.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Було проведено дослідження на клітинах раку простати людини (PC-3) за умов нестачі поживних речовин, що викликало стан голодування. Умови голодування створювалися шляхом культивування ракових клітин у середовищі RPMI без бичачої сиворотки та L-глутаміну, контрольна група вирощувалася за оптимальних для життєдіяльності умов. Було показано, що при нестачі поживних
нутріентів зовнішня морфологія клітин раку простати людини (РС-3) трансформується з веретеноподібної на ромбоподібну. За літературними даними такі зміни форми цитоскелету клітини свідчать про нестачу поживних речовин і є одним з маркерів голоду (Рис. 1) [18].
За допогою TRIzol ® Reagent (Invitrogen, США) клітини раку простати лізували та виділяли тотальну РНК, після виділення обробляли її ДНКазами для запобігання забруднення чужерідною генномною ДНК, що дуже важливо перед зворотньою транскрипцією. Вимірювання концентрації РНК у пробах на спектрофотометрі проводили на наступний день після виділення мРНК, оскільки молекули РНК дуже повільно повністю розчинюється у воді, а це може спричини неточності у вимірах і неправильні розрахунки на подальших етапах досліду. Після вимірювання концентрації в пробах, для визначення чистоти та стану структури РНК, проводили РНК гель електрофорез. На кожну доріжку гелю наносили РНК в кількості 500 нг На електрофореграммах було визначено, що РНК не деградувала після виділення і концентрація на спектрофотометрі була виміряна правильно. (Рис. 2) Виділення тотальної мРНК з контрольної групи і групи без додавання необхідних нутріентів проводили через 24 г, 48 г та 72 г культивування в середовищі. Полімеразну рекцію проводили с праймерами до генів «домашнього хозяйства» (housekeeping genes) HPRT, STIM1 та Orai1. Розмір фрагментів STIM1 складав 470 п.н, Orai1 280 п.н, а контролю HPRT 112 п.н.
Після ПЛР реакції та ДНК гель електрофорезу продемонстровано, що експресія генів STIM1 та Orai1 через 24 г культивування у середовищі без поживних речовин значно збільшувалася у порівнянні з контролем, в той час як рівень експресії контрольного гену HPRT залишилася незмінним (Рис. 3).
Рис.1. а) контрольна група клітин раку простати людини голодування 24 г
Аналіз експресії генів STIM1 та Огаїї за умов голодування протягом 48 г експерименту показав незначні кількісні зміни у порівнянні з групою голодування протягом 24 г, також майже немає відмінності у рівні експресії з контрольною групою клітин 48 (Рис.3)
У досліді на 72 г без нутріентів виявлена разюча кількісна відмінність між контрольною групою 72 год та експериментальною групою ампліфікатів. Рівень експресії генів у дослідній групі голодування 72 г кількісно значно перевищує контроль 72 г (Рис.4).
Виділення білку, електрофоретичне розділення та вестерн-блот аналіз білків STIM1 та Ога11 проводили. через 24 г, 48 г та 72 г культивування в середовищі без поживних речовин .
Кількісна зміна рівня експресії білку STIM1, збільшувалася на 24 г та 48 г експерименту, через 72 г голодування вона дещо зменшувалася у порівнянні з 24 г і 48 г.У контрольній групі кількість продукту дуже незначна за кожних з умов. Молекулярна вага протеїну становить 82 кДа, що відповідало очіковану розміру. (Рис. 5)
Білок Ога11, молекулярна вага якого складає 42 кДа, за умов нестачі поживних речовин, показав значне збільшення експресії за 24 г та 48 г експерименту, а на 72 г , як у випадку зі STIM1 синтез протеїну дещо знижувався, що, можливо, ще раз доводить функціональну взаємозалежність, спряженість їх дії та коекспресію цих протеїнів у випадку спустошення депо ендоплазматичного ретикулюма та потребі поповнення іонів кальцію ззовні, що, напевно, здійснюється через представника сімейства СИАС-каналів Ога11. Контрольна група білку Ога11 кількісно не відрізняється один від одного і значно менша за експериментальну (Рис.6).
Кожен дослід як на рівні генів, так і на рівні білків проводили у кількості не менше трьох раз.
(PC-3); б) клітини раку простати людини (PC-3) за умов
Рис.2. Перевірка якості та концентрації виділеної тотальної РНК клітин раку простати людини (РС-3) за допомогою РНК гель електрофорезу
Рис.3. ДНК гель електрофорез після ЗТ-ПЛР за умов 48 г голодування, Orail (270 п.н.), STIM1 (470 п.н.) , HPRT (113 п.н.)
Рис.4. ДНК гель електрофорез після ЗТ-ПЛР за умов 72 г голодування, Orail (270 п.н.), STIM1 (470 п.н.) , HPRT (113 п.н.)
470 п.н
280 п.н
113 п.н
Рис.5. Вестерн-блот аналіз білку STIM1, білок розміром 82 кДа, а ) рівень експресії контрольної групи білків STIM1 24г, 48г, 72 г; б) рівень експресії білків STIM1 за умов голодування 24г, 48г, 72 г
а).
24г
б).
48г
72г
Рис. 6. Вестерн-блот аналіз білку ОгаіІ, білок розміром 42 кДа, а ) рівень експресії контрольної групи білків Огаіі 24г, 48г, 72 г; б) рівень експресії білків Огаіі за умов голодування 24г, 48г, 72 г
Таким чином, експресія БТІМІ та ОЯЛІІ каналів як на рівні мРНК, так і на рівні білків під час голодування клітин значно збільшилась у порівнянні з контролем.
У перспективі важливо провести подальші дослідження на клітинах раку простати людини, зокрема створення умов голодування протягом 96 г та аналіз рівня синтезу протеїнів депо-залежного входу кальцію БТІМІ та ОгаіІ як на генетичному рівні, так і на протеїновому.
Оскільки отриманні дані ще не можуть переконливо доводити важливу роль БТІМІ та ОгаіІ у процесах виживання ракових клітин простати людини при лікуванні методом хіміотерапії, важливими є наступні дослідження проведені за допомогою методів петч-клемп та кальціометрії, що дозволить спостерігати за активністю цих білкових комплексів. Також важливим моментом є реєстрація струмів через СЯЛК (Ісгак) або БОС (І,ос) при такому чиннику як голодування, що призведе до виходу іонів кальцію з депо. У майбутньому перспективно буде дослідити нові шляхи регуляції синтезу протеїнів депо-залежного входу кальцію БТІМІ та ОЯЛІІ, що, можливо, зможе підвищить ефективність хіміотерапії раку простати людини.
ВИСНОВКИ
1. Було досліджено вплив голодування на рівень експресії протеїнів депо-залежного входу кальцію БТІМІ та ОгаіІ в клітинах раку простати людини (РС-3).
2. За умов нестачі важливих поживних нутрієнтів
протягом 24г, 48г та 72 г спостерігалося
підвищення експерсії сенсору БТІМІ та каналу ОгаіІ як на генному рівні, так і на білковому в клітинах раку простати людини (РС-3).
3. Подальші дослідження допоможуть дослідити роль цих білкових субодиниць в процесах проліферації, рухливості та метастазування ракових клітин в організмі людини, а також необхідно дослідити функційні наслідки гіперекспресії білків БТІМІ ТА ОгаіІ за допомогою методів петч-клемп та кальціометрії.
ПЕРСПЕКТИВИ ПОДАЛЬШИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Отримані результати буде використано у наступних дослідженнях вивчення ролі протеїнів депо-залежного входу кальцію STIM1 та Oraii в процесах канцерогенезу в організмі людини. Експериментальні дані будуть в подальшому використовуватися у дослідженнях підвищення ефективності хіміотерапії із застосуванням природних селективних фармакологічних модуляторів протеїнів депо-залежного входу кальцію STIM1 та Oraii. Розуміння молекулярних механізмів, що лежать в основі допоможуть дослідити роль цих білкових субодиниць в процесах проліферації, рухливості та метастазування ракових клітин в організмі людини, а також необхідно дослідити функційні наслідки гіперекспресії білків STIM1 ТА Oraii за допомогою методів петч-клемп та кальціометрії.
ПОДЯКА
Преварській Н., Кондрацькому А., лабораторія фізіології клітини, Університет наук та технологій міста Лілль, Франція за надану фінансову підтримку на проведення досліджень та можливість виконання робіт на устаткуванні в лабораторіях університету
Література
1. Kinzler, Kenneth W.; Vogelstein, Bert. The genetic basis of human cancer (2nd, illustrated, revised ed.). - New York: McGraw-Hill, 2002. - P.5
2. WHO . "Cancer". World Health Organization. Retrieved 5 January, 2011.
3. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics .// CA: a cancer journal for clinicians.-2011. - Vol. 61, N 2.- P. 69-90.
4. Parekh AB, Putney JW Jr. Store-operated calcium channels // Physiol Rev. -2005.- Vol. 85, N 2. - P.757-810.
5. Lewis RS., The molecular choreography of a store-operated calcium channel // Nature.- 2007 - Vol. 446, N 7133.
- P.284-287.
6. T. Hewavitharana, X. Deng, J. Soboloff and D. L. Gill, Role of STIM and Orai proteins in the store-operated calcium signaling pathway // Cell Calcium - 2007- Vol. 42, N 2. - P. 173-182.
З4
7. Williams RT, Manji SS, Parker NJ, Hancock MS, Van Stekelenburg L, Eid JP, Senior PV, Kazenwadel JS, Shandala T,
Saint R, Smith PJ, Dziadek MA . Identification and characterization of the STIM (stromal interaction molecule) gene family: coding for a novel class of transmembrane proteins //
Biochem. J. - 2001 - Vol. З57, N З.-P. б7З-б85.
8. Roos J, DiGregorio PJ, Yeromin AV, Ohlsen K, Lioudyno M,
Zhang S, Safrina O, Kozak JA, Wagner SL, Cahalan MD,
Veli3elebi G, Stauderman KA.. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function //
J.Cell.Bio. - 2005- . VoI.169, Ж - P. 4З5-45.
9. Liou, J., Kim, M. L., Heo, W. D., Jones, J. T., Myers, J. W.,
Ferrell, J. E., Jr., and Meyer, T. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx // Curr. Biol. -2005. - Vol. 15 - P. 12З5-1241.
10. Park CY, Hoover PJ, Mullins FM, Bachhawat P, Covington ED,
Raunser S, Walz T, Garcia KC, Dolmetsch RE, Lewis RS..
.STIM1 Clusters and Activates CRAC Channels via Direct Binding of a Cytosolic Domain to Orail // Cell. - 2009. - Vol.
1Зб, N 5. - P. 87б-890.
11. Jousset H, Frieden M, Demaurex N.STIM1 knockdown reveals that store-operated Ca2+ channels located close to sarco/endoplasmic Ca2+-ATPases (SERCA) pumps silently refill the endoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. - 2007.
- Vol. 282, N 15. - P. б4.
ВЛИЯННИЕ ГОЛОДАНИЯ НА УРОВЕНЬ ЕКСПРЕСИИ ПРОТЕИНОВ ДЕПО-ЗАВИСИМОГО ВХОДА КАЛЬЦИЯ STIM1 ТА ORAI1 В КЛЕТКАХ РАКА ПРОСТАТІ ЧЕЛОВЕКА (РС-3)
Дрынь Д.О.
Исследовано влияние голодания на уровень экспрессии протеинов депо-зависимого входа кальция STIMl и Orail в клетках рака простаты человека (РС-3). Экспрессия протеинов депо-зависимого входа кальция STIMl и Orail как на уровне мРНК, так и на уровне белков значительно увеличилась по сравнению с контролем. Дальнейшие исследования помогут исследовать роль этих белковых субъединиц в процессах пролиферации, подвижности и метастазирование раковых клеток в организме человека, а также необходимо исследовать функциональные последствия гиперекспресиии билкивSTIM1 И Orail с помощью методов Пэтч-клэмп и кальциометрии.
Ключевые слова: клетки рака простаты человека (РС-3), протеины депо-зависимого входа кальция STIMl и Orail, голодание.
INFLUENCE OF STARVATION ON THE EXPRESSION LEVELS OF CAPACITATIVE CALCIUM ENTRY DEPENDING PROTEINS STIM1 AND ORAI1 IN HUMAN PROSTATE CANCER (PC-3) CELLS
Dryn D.O.
We investigated the influence of starvation on the expression levels of capacitative calcium entry depending proteins STIM1 and Orail in human prostate cancer cells (PC-З). Expression of the capacitative calcium entry depending proteins STIMl and Orail at both the mRNA and protein level increased significantly compared with the control . Further research will help to investigate the role of the protein subunits in the processes of cell proliferation, motility and metastasis of cancer cells in the human body, as well as to explore the functional consequences of upexpression of proteins STIMl and Orail by using methodg Patch-Clamr and calcium imaging..
Key words: human prostate cancer, capacitative calcium entry depending proteins STIMl and Orail, starvation.
12. Feske S, Gwack Y, Prakriya M, Srikanth S, Puppel SH, Tanasa B, Hogan PG, Lewis RS, Daly M, Rao A . A mutation in Orail causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function // Nature - 200б. - Vol. 441. - P. 179-185.
13. How many different types of cancer are there? // Cancer Research UK : CancerHelp UK. Retrieved - 2012 - 90 p..
14. American Cancer Society ACS: What Is Prostate Cancer? // Information and Resources for Cancer: Breast, Colon, Prostate, Lung and Other Forms,.Retrieved - 2010. - 220 p.
15. Shengyu Yang, J. Jillian Zhang and Xin-Yun Huang .Orail and STIM1 Are Critical for Breast Tumor Cell Migration and Metastasis // Cancer Cell. - 2009. - Vol.15, Issue 2. - P.124-B4.
16. Shapovalov G, Skryma R, Prevarskaya N Calcium Channels and Prostate Cancer // Recent Pat Anticancer Drug Discov. - 2012. -99 p.
17. Prevarskaya N, Skryma R, Shuba Y.Ion channels and the hallmarks of cancer // Trends Mol Med/ Review - 2010 -Vo1.16,N З. - P. 107-121.
18. Marshall Cancer Cells Change Shape to Spread Fast in Body -2008. - 220 p.
19.
Шуба Я. М. Основи молекулярної фізіології іонних каналів - К.:
Наук. Думка, 20l0. - 447 с.
