CC BY
60
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДО-ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
РАЗНЫХ ВИДОВ ДРОЖЖЕЙ
Шаламитский Максим Юрьевич
аспирант, Национальный институт винограда и вина «Магарач», РФ, г. Ялта
E-mail: mshalamitskiy@yahoo. com
STUDYING ENDO-POLYGALACTURONASE ACTIVITY OF VARIOUS
YEASTS SPECIES
Shalamitskiy Maksym
post-graduate student, National Institute for Vine and Wine "Magarach", Russia,
Yalta
АННОТАЦИЯ
Изучено продуцирование полигалактуроназ различными видами дрожжей, находящимися на хранении в Национальной коллекции микроорганизмов для виноделия НИВиВ «Магарач». Наибольшую активность фермента показали дрожжи Kluyveromyces marxianus. Полученные данные согласуются с данными полученными другими исследователями по некоторым штаммам дрожжей. Изучение влияния условий хранения на способность синтезировать данные ферменты требует дальнейшего изучения, т. к. некоторые штаммы, исследованные ранее другими учёными, не показали ферментативной активности.
ABSTRACT
Polygalacturonase production by various yeast species had been studied. The highest activity of the enzyme showed yeast strain Kluyveromyces marxianus. Obtained data for some strains agree with the data received by other researchers. Studying of the influence of storage conditions on the ability to produce this enzyme requires further study, because some strains investigated previously by other scientists showed no enzymatic activity.
Ключевые слова: полигалактуроназа; дрожжи; вино. Keywords: polygalacturonase; yeasts; wine.
В настоящее время наблюдается тенденция к увеличению посадок комплексноустойчивых сортов винограда на территории стран Центральной и Восточной Европы. Так, за последние десятилетия, площади занимаемые данными сортами винограда составили более 10 тыс. га [11]. Комплексноустойчивые сорта винограда характеризуются способностью противостоять заболеваниям, вредителям и отрицательным воздействиям природных факторов.
Одной из причин, способствующей устойчивости сорта к низким температурам, является высокое содержание в винограде коллоидных веществ, среди которых важное место занимают пектиновые вещества. В то же время, по данным литературы, высокое содержание биополимеров отрицательно влияет на процесс осветления сусла при переработке винограда.
По данным различных исследователей, содержание пектиновых веществ в винограде колеблется в пределах 0,30—1,31 %. Так, исследованиями Бареевой и Донченко показано, что содержание пектина в таких комплексно-устойчивых сортах, как Цитронный Магарача, Первенец Магарача, Виорика, колеблется в от 1,85 % до 2,03 % [2]. В то же время, исследования С.С. Тюриной показали, что для успешного прохождения процесса осветления сусла, за счёт собственных ферментов виноградной ягоды, содержание суммы биополимеров не должно превышать 0,12 %, в т. ч. пектина не более 0,03 % [12].
Таким образом, при переработке сортов с повышенным содержанием пектиновых веществ одним из приёмов снижения их количества является применение ферментов. Так в практике современного виноделия для этой цели используют различные ферментные препараты пектолитического действия, такие как Пектофоетидин, Пектаваморин, Rapidase, Lallzyme и др.
В настоящее время имеется ряд исследований по изучению внеклеточных ферментов, вырабатываемых винными дрожжами, которые выделяют в культуральную среду гидролитические ферменты: эндо-полигалактуроназу, пектинэстеразу, протеиназу, гемицеллюлазы и др. [1]. Эндо-полигалактуроназа дрожжей способствует расщеплению а-1,4^-галактозидуронидных связей, что
влияет на снижение вязкости сусла за счёт разрушения полимерной сетки, удерживающей во взвешенном состоянии частицы мути. Благодаря этому происходит более быстрое и полное осветление [4; 9].
Как показывают исследования отечественных и зарубежных исследователей эндо-полигалактуроназная активность отмечается у разных видов дрожжей. Так, Энкер наблюдал действие пектолитических ферментов у дрожжей Saccharomyces vini [13], Мосиашвили и Патарая отмечали эндо-полигалактуроназную и пектинэстеразную активность у дрожжей Saccharomyces paradoxus и Saccharomyces oviformis [7], Мунгиевой была обнаружена ферментативная активность в культуральной жидкости дрожжей Sacch. Uvarum [8], Датунашвили было обнаружено наличие пектолитических ферментов у вида Kluyveromyces marxianus [5].
Цель исследования: изучение эндо-полигалактуроназной активности штаммов дрожжей из Национальной коллекции микроорганизмов для виноделия (НКМВ) НИВиВ «Магарач».
Объекты исследования — штаммы дрожжей из НКВМ НИВиВ «Магарач».
Методика исследования.
I) Способность к синтезу эндо-полигалактуроназы исследуемыми штаммами изучали с помощью «тарелочного» теста [14; 15]: штаммы дрожжей рассевали на чашки Петри с агаризованной средой YBN без аминокислот, содержащей 0,5 % глюкозы и 0,5 % полигалктуроновой кислоты. Инкубирование проводили в термостате при t = (30 ± 0,5)°С. Двухсуточные колонии обрабатывали 6М раствором соляной кислоты. Наличие зон просветления вокруг колоний свидетельствовало о наличии эндо-полигалактуроназной активности у исследуемых штаммов.
II) Эндо-полигалактуроназную активность дрожжей определяли: штаммы культивировали на виноградном сусле, разбавленном дистиллированной водой до содержания массовой концентрации сахаров 90—100 г/дм . После инокуляции штаммы культивировали в термостате при t = (26 ± 0,5) °С в
течение 7 дней. Дрожжевой осадок удаляли путем центрифугирования. Эндо-полигалактуроназную активность определяли в надосадочной (культуральной) жидкости проводили вискозиметрическим методом Лифшиц Д.Б. [6] в модификации Тюриной С.С. [12]. Данный метод основан на измерении снижения вязкости раствора пектина в процессе его гидролиза ферментами.
В качестве субстрата использовали 0,8 %-ный раствор цитрусового пектина (Sigma) в ацетатном буфере (рН 5.1).
За единицу активности принимали такое количество фермента, которое гидролизует 1 мг пектина в минуту при температуре 30 °С и рН 5.0 со снижением вязкости раствора субстрата на 20 %.
Расчет проводили по формуле:
64
Апг = ——— (1)
пг Т20о/охИ '
где: 64 — количество субстрата в реакционной среде, мг;
Т2о% — время, в течение которого вязкость субстрата снижается на 20 %,
мин;
3
V — количество фермента, внесенного в реакционную среду, см .
Результаты исследования
Первоначальный анализ имеющихся данных о коллекционных культурах НКВМ показал, что в коллекции хранятся более пятидесяти культур дрожжей, способных синтезировать эндо-полигалактуроназу. Для исследований отобрали 66 штаммов дрожжей следующих видов: Saccharomyces vini — 12, Saccharomyces paradoxus — 6, Saccharomyces uvarum — 9, Saccharomyces oviformis — 1, Zygosaccharomyces sp — 7, Zygosaccharomyces bailii — 5, Kluyveromyces marxianus — 20, Kluyveromyces sp. — 6.
«Тарелочный» тест позволил исключить из общего числа исследуемых культур 32 штамма дрожжей, которые не синтезировали данный фермент.
В табл. 1 представлены результаты вискозиметрического анализа 34 штаммов дрожжей по их способности синтезировать эндо-полигалактуроназу: S.
vini — 6, S. paradoxus — 6, S. uvarum — 6, S. oviformis — 1, Kluyveromyces marxianus — 15.
Таблица 1.
Коллекцион ный номер штамма, род Активность фермента, ед./см3 Коллекционный номер штамма, род Активность фермента, ед./см3
I-5 S. uvarum 0,76 III-201 S. paradoxus 4,57
I-324 S. uvarum 1,07 III-202 S. paradoxus 0,64
I-421 S. oviformis 1,78 III-203 S. paradoxus 64,00
I-438 S. vim 0,58 III-204 S. uvarum 128,00
I-472 S. uvarum 0,91 III-205 S. uvarum 1,19
III-68 Kl.marx. 1066,67 III-206 S. uvarum 1,28
III-69 Kl.marx. 800,00 III-238 S. vim 2,13
III-70 Kl.marx. 581,82 III-239 S. vim 2,11
III-71 Kl.marx. 627,45 III-240 S. vim 4,00
III-72 Kl.marx. 492,31 III-241 S. vim 5,33
III-73 Kl.marx. 278,26 III-242 S. vim 3,20
III-74 Kl.marx. 1673,33 III-358 Kl.marx. 1306,12
III-75 Kl.marx. 1163,64 III-359 Kl.marx. 1280,00
III-76 Kl.marx. 1422,22 III-360 Kl.marx. 1422,22
III-198 S. paradoxus 6,40 III-361 Kl.marx. 1438,20
III-199 S. paradoxus 4,51 III-362 Kl.marx. 1454,55
III-200 S. paradoxus 4,00 III-363 Kl.marx. 1391,30
Анализ полученных результатов показал, что наивысшей активностью фермента обладают штаммы рода Kluyveromyces marxianus. Ферментативная активность варьировалась в пределах от 278 единиц у штамма III-73, до 1673 у штамма III-74. Ферментативная активность эндо-полигалактуроназы у дрожжей сахаромицетов была на порядки ниже и варьировалась в пределах 0,58 до 6,4, за исключением двух штаммов, которые показали высокую активность в 64 и 128 единиц.
Так дрожжи Kluyveromyces обладают на порядок большей активностью, чем дрожжи сахаромицеты.
Проведенное исследование показало, что культуры I-421 (Ужгород 231-1) и I-438 (Берегово 2-10), штамм III-360 (штамм ВКМ У-848) при длительном хранении в музее сохранили свою эндо-полигалактуроназную активность, т. к. полученные нами данные совпадают с ранее опубликованными [3; 10], в то же время имеются штаммы, у которых данная активность пропала.
В результате проведенного исследования нами были отобраны штаммы дрожжей Kluyveromyces (III-74, III-76, III-360) с целью изучения их влияния на снижения содержания пектина в сусле на стадии настаивания и осветления сусла.
Список литературы:
1. Абдуразакова С.Х. Изучение внеклеточных ферментов винных дрожжей и пути индуцированного их образования при спиртовом брожении / С.Х. Абдурозакова, Х.Т. Саломов, Т.М. Фомичева // Вопросы биохимии винограда и вина. 1975. М.: Пищевая промышленность — с. 266—269.
2. Бареева Н.Н., Донченко Л.В. Оценка сортов винограда нового поколения как сырья для комплексной переработки/ Научный журнал КубГАУ. — 2006. — № 18 (02) [Электронный ресурс] — Режим доступа. — URL: http://ej.kubagro.ru/2006/02/pdfZ11 .pdf
3. Бутова С.Н. Разработка биотехнологических основ деградации отходов растительного сырья ферментами пектолитического комплекса: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М.: МГУПП, 2005. — 11—12 с.
4. Датунашвили Е.Н. Ферменты виноградной ягоды, гидролизующие высокомолекулярные углеводы / Е.Н. Датунашвили, С.С. Тюрина, Ф.М. Бутова // Физиология растений. — 1977. — т. 24. — вып. 2. — с. 285—290.
5. Датунашвили Е.Н., Астапович Н.И., Лебедев В.В. Изучение условий биосинтеза полигалактуроназы дрожжами Fabospora fragilis /Е.Н. Датунашвили, Н.И. Астапович, В.В. Лебедев // Депонированная рукопись представлена в ВНИИВиВ «Магарач». 1980, Ялта. — 17 с.
6. Лифшиц Д.Б. Унифицирование методов определения активности ферментных препаратов производственного назначения / Д.Б. Лифшиц. Киев: Украинский НИИНТИ и ТЭИ, 1967. — с. 33—52, 83—90.
7. Мосиашвили Г.И., Исследование дрожжей вида Saccharomyces paradoxus / Г.И. Мосиашвили, М.С. Патарая // Виноделие и виноградарство СССР. — 1969. — № 6. — с. 18—19.
8. Мунгиева Н.А. Получение чистой дрожжевой полигалактуроназы и изучение условий её применения в виноделии: Дис. ... канд. техн. наук. Ялта: ИВиВ «Магарач», 1980. — 24—25 с.
9. Сапожникова Е.В. Пектиновые вещества и пектолитические ферменты / Е.В. Сапожникова М.: Москва, 1971. — 45 с.
10. Сонина Е.Г Совершенствование технологии производства виноградного сока и виноматериалов на основе использования пектолитических ферментов дрожжей: Дисс... канд. техн. наук. Ялта: ИВиВ «Магарач», 1990. — 47—51 с.
11. Трошин Л.П. Ампелографическая и селекционная научно-исследовательская работа Кубанского госагроуниверситета/ Научный журнал КубГАУ. — 2012. — № 81 (7) [Электронный ресурс] — Режим доступа. — URL: http://ej.kubagro.ru/2012/07/pdf/39.pdf
12. Тюрина С.С. Исследование пектолитических ферментов виноградной ягоды: Автореф. дис... канд. биол. наук. М., 1977. — 17 с.
13. Энкер П.Б. Ферментативное разрушение пектиновых веществ ягод с участием винных дрожжей: Автореферат дис. ... канд. биол. наук. Алма-Ата: АН КазССР, 1968. — 16 с.
14. Production and partial characterization of an endopolygalacturonase from Saccharomyces cerevisiae / Blanco P. [et al.] // Canadian Journal of Microbiology. — 1994. — № 40. — p. 974—977.
15. Schwan R.F., Cooper R.M., Wheals A.E. Endo-polygalacturonase secretion by Kluyveromyces marxianus and other cocoa pulp-degrading yeasts / R.F. Schwan, R.M. Cooper, A.E. Wheals // Enzyme and Microbial Technology. — 1997. — № 21. — p. 234—244.
