CC BY
62
-ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ ~ -
УДК 582.28;634.8
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ДРОЖЖЕЙ БЛССИЛЯОМУСББ СБЯЕУ1Б1АЕ, ВЫДЕЛЕННЫХ С ВИНОГРАДНИКОВ ДАГЕСТАНА
© 2016 Д.А. Абдуллабекова, Е.С. Магомедова, Г.Г. Магомедов Прикаспийский институт биологических ресурсов ДНЦ РАН, г. Махачкала Статья поступила в редакцию 22.05.2016
Изучены физиолого-биохимические свойства дрожжей-сахаромицетов, ассоциированных с виноградом различных сортов, произрастающих в условиях Дагестана. Выявлена встречаемость среди природных популяций S.cerevisiae активных штаммов, биотехнологический потенциал которых перспективен для использования в виноделии при производстве натуральных вин. Исследована способность дрожжей к активному сбраживанию повышенных концентраций углеводов, продуцированию компонентов, влияющих на формирование качества вин. Полученные результаты показали целесообразность поиска среди природных дрожжей перспективных для использования в производстве спиртосодержащих напитков.
Ключевые слова: дрожжи, биопотенциал, виноград, вино
Виноградное растение является одним из естественных местообитаний дрожжевых грибов, среди которых встречается ценный и востребованный ресурсный вид Saсcharomyces cerevisiae. Изоляция этих дрожжей из природных локусов - реальный путь для поиска штаммов, способных эффективно воздействовать на формирование качества натуральных вин. Республика Дагестан располагает богатейшими виноградными насаждениями, культивируемыми в разнообразных почвенно-климатических условиях, которые могут влиять на качество винограда, а также свойства ассоциированных с ним дрожжей, что свидетельствует о целесообразности исследования их биоразнообразия и дальнейшего скрининга перспективных для биотехнологии штаммов.
Исследовали дрожжевые сообщества, приуроченные к винограду, произрастающему в условиях микрорайона, отличающегося обилием тепла и благоприятными для виноградного растения свойствами почвы, совокупное влияние которых способствует высокому накоплению углеводов в ягодах. Вызывало интерес изучение потенциала природных дрожжей, адаптированных к этому винограду при ферментации полученного из него высокосахаристого сусла, что важно в технологии различных категорий вин, в том числе натуральных.
Цель работы: исследование метаболизма дрожжей S.cerevisiae, выделенных из виноградников Дагестана в биотехнологическом аспекте.
Материалы и методы. Объектом исследования служили дрожжевые грибы, ассоциированные с виноградом сортов Траминер, Ркацители и Пино-гри. Грозди собирали и извлекали сок непосредственно на местах сбора с соблюдением необходимых мер стерильности, предусмотренных по микробиологии [1, 2]. Для выделения дрожжей спонтанно забродившее сусло рассевали на твердую питательную среду виноградное сусло-агар в чашках Петри и инкубировали при 18-200С. Выросшие изолированно колонии дрожжей с
Абдуллабекова Динаханум Абиляевна, кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник. [email protected] Магомедова Елена Селимовна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник. E-mail:[email protected] Магомедов Гаджи Гасайникадиевич, научный сотрудник. Email: [email protected]
помощью бинокулярной лупы разделяли на морфологические типы. При снятии результатов посева производили выделение только колоний, вероятно относящихся к роду Saccharomyces, в работе не рассматривались изоляты, характер роста которых на плотных средах (цвет, консистенция, форма колоний и штриха, а также размер колоний) явно не соответствовал описаниям представителей этого рода в специальной литературе и определителях [3].
Принадлежность выделенных культур к виду S. cerevisiae была подтверждена генетической идентификацией проведенной на основе анализа нуклеотидных последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 региона и D1/D2 доменов региона 26S (LSU) рДНК. Выделение ДНК и проведение ПЦР осуществляли по ранее описанной методике [4]. Для амплификации использовали прай-меры ITSlf (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA) и NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG). Секвенирование ампли-фицированного региона производили в Научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Видовая идентификация осуществлялась сравнением полученных нуклеотидных последовательностей с данными размещенными в генбанке NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) и базе данных CBS (cbs.knaw.nl). Полученную нуклеотидную последовательность D1/D2 доменов региона 26S (LSU) рДНК для одного из опытных штаммов S.cerevisiae использовали для построения филогенетического дерева (см. рис. 1). Филогенетический анализ выполняли с помощью программ MAFFT6 rfMEGA4.
Изучение изолятов с последующим скринингом потенциально перспективных для виноделия штаммов проводили по свойствам, играющим важную роль в формировании качества натуральных вин. В сброженных субстратах определяли концентрацию этанола, остаточных сахаров, титруемых и летучих кислот, диоксида серы и редуктонов. Использовались методы анализов, принятые в энохимии и описанные в специальной литературе [5]. Комплекс летучих компонентов определяли на газовом хроматографе «Кристалл-200М» с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке HP - FFAP (50м Х 0,32 мм) с 10%-ным ди-этиленгликольсукцинатом, газ-носитель-азот (1,8-2,7 дм/ч3).
Результаты и обсуждение. Одна из важных характеристик метаболической активности дрожжевой культуры - энергия брожения. Существует мнение, что клетки, выделенные из природы, не обладают высокой бродильной активностью, поэтому часто проводят направленную селекцию с целью ее повышения за счет снижения аэробного дыхания. Для определении скорости разложения сахаров природных культур, опыты ставили на 5 штаммах в склянках, вместимостью 100 см3, закрытых пробками с отверстием, куда вставляли трубку с тонко оттянутым концом для выхода углекислого газа и предотвращения испарения бродящего
сусла. Двухсуточные дрожжевые разводки инокулиро-вали в склянки с виноградным суслом из расчета 3 млн. клеток на 1 см3 и по ежедневной убыли в массе, соответствующей количеству выделившегося диоксида углерода судили о скорости сбраживания сахаров. Объем сусла в склянках составлял 70 мл, массовая концентрация сахаров в первом варианте была на уровне 21,5 г/100 см3(контроль), а во втором концентрация сахаров за счет введения глюкозы доводилась до 27,7 г/100 см3(опыт). Температура брожения колебалась в пределах 25-270С.
74 IAY048172 Saccharomyces pastorianus NRRL Y-27171NT
н
AY048156 Saccharomyces bayanusvar. bayanus Y-12624T AY130339 Saccharomyces bayanus var. uvarum Y-17034T
-AF398480 Saccharomyces kudriavzevii NRRL Y-27339T
-EF580918 Saccharomyces arboricolus CBS 10644T
AY048155 Saccharomyces paradoxus NRRL Y-17217NT AF398478 Saccharomyces cariocanus NRRL Y-27337T I Saccharomyces cerevisiae (strain №2)
97 1AY048154 Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632NT — AF398479 Saccharomyces mikatae NRRL Y-27341T
-AY048157 Kazachstania servazzii NRRL Y-12661T
Рис. 1. Филогенетическое положение штамма S. cerevisiae (№2) полученное методом максимальной экономии (Maximum Parsimony analysis) на основании выровненных нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов 26SрДНК. Номера, данные над
разветвлениями, соответствуют частоте (>55%) соединения таксонов при 1000 построений. Шкала показывает число замен на длину используемых для анализа нуклеотидных последовательностей (567 п.н.). U72163 Zygosaccharomyces rouxii NRRL Y-229T - скрытая внешняя группа
Согласно полученным результатам, энергия брожения зависела от индивидуальных физиологических свойств штаммов и массовой концентрации сахаров в среде. Динамика процесса выявила общую закономерность - первые трое суток скорость разложения сахаров в контрольных образцах превышала опытные в 1,5-1,9 раза, далее в опыте она была выше, чем в контроле, а через 15-18 суток уровень выброженных сахаров в обоих вариантах практически совпадал. Высокая бродильная активность у штаммов, наблюдаемая в контроле и опыте в течение 6 и 9 суток, соответственно, сменялась медленным дображиванием. Количество сброженных углеводов за этот период составило - в опыте 76,5-82,5%, в контроле - 86-90%. В контрольном варианте все штаммы, кроме одного завершили брожение насухо через 15-18 суток, а в опыте через 39 суток при остаточных сахарах от 3,8-5,4 г/100 см3, что объяснимо анаэробными условиями, созданными в эксперименте и образующимся спиртом, угнетающим жизнедеятельность дрожжей. Таким образом, физиологическая активность клеток в условиях высокой концентрации сахаров, степень проявления которой зависит от индивидуальных особенностей исследованных штаммов, свидетельствовала об их быстрой адаптации к факторам, ингибирующим метаболизм дрожжей -осмотическому давлению и спирту.
Согласно полученным данным, среди сахаромицетов, выделенных с винограда, встречаются культуры, обладающие достаточно высокой энергией брожения, что, возможно, возникает в процессе естественной селекции дрожжей при акклиматизации к среде обитания. Изучение штаммовых признаков природных изолятов включало также определение их
способности к синтезу летучих соединений, играющих важную роль, как в обмене веществ дрожжевой клетки, так и в создании ароматообразующего комплекса вин. Известно, что дрожжи способны продуцировать летучие соединения различного химического состава -эфиры, кетоны, альдегиды, кислоты и спирты, каждое из которых индивидуально или в сочетании друг с другом может создавать нюансы аромата. Качественный состав, общая сумма и доля в ней каждого из этих компонентов, в определенной мере являются индикатором характера брожения. Механизм биосинтеза летучих соединений дрожжевой клеткой сложен, протекает по различным схемам и зависит от многих факторов -физико-химического состояния сбраживаемого сусла, в значительной мере обусловленного сортом винограда, индивидуальных физиолого-биохимических свойств штамма, условий и режимов протекания брожения.
Наша задача состояла в изучении способности опытных дрожжей, выделенных с винограда, к продуцированию летучих соединений при их культивировании на высокосахаристом сусле, используемом для производства натуральных вин. Дрожжевые клетки культивировали на пастеризованном сусле из двух сортов винограда - Ркацители и Траминер с концентрацией сахаров 28,0 г/100 см3, для достижения которой вводили глюкозу. Двухсуточные дрожжевые разводки инокулировали в количестве 3% и проводили брожение до его естественной остановки. Концентрация остаточных сахаров в сброженном субстрате колебалась в пределах 0,4-2,4 г/100 см3, в зависимости от индивидуальных свойств штаммов.
Исследования биосинтезирующей способности дрожжей по изучаемому признаку, проведенные на 4
Общая биология
разных штаммах, два из которых -№№1,2, вводили в сусло Ркацители, а два других - №№3,4 - в Траминер, показали, что качественный состав идентифицированных альдегидов, кетонов, сложных эфиров и высших спиртов во всех образцах был идентичен и характерен для белых вин, полученных на дрожжах вида S. cerevisiae, а их количество варьировало по вариантам (табл. 1). Согласно полученным данным, карбонильные соединения представлены ацетальдегидом и ацетоном, продуцируемыми в количествах, мг/дм3 -13,5-24,2 и 0,3-1,2, соответственно. В группе сложных эфиров, образуемых при брожении под действием эстераз дрожжей, этилацетат закономерно превалировал во всех вариантах в 9-17 раз по отношению к метилацета-ту. Высшие спирты, наряду с этанолом синтезируемые при брожении, с одной стороны способствующие образованию аромата вин, а с другой, являясь токсичными примесями, значительно преобладали во всех образцах. Основная доля в их сумме приходилась на изо-амиловый спирт, за ним следовали изобутанол и 1-пропанол, что в основном характерно для сивушных спиртов. Из алифатических спиртов также обнаружены 1-бутанол и гексанол, в практически равных количествах, мг/дм3: 1,2-2,1 и 1,4-1,8, соответственно. Штаммы незначительно различались по способности к продуцированию ароматического спирта фенилэтанола, наличие которого отмечалась в пределах 27,5-34,2 мг/дм3.
Вопрос об участии того или иного компонента в аромате и букете вин обычно рассматривается в тесной связи с его запахом, уровнем в среде и пороговой концентрацией. Известно, что из идентифицированных продуктов брожения неблагоприятное воздействие, в силу их резких неприятных, удушливых запахов могут оказать ацетальдегид и высшие спирты алифатического ряда - изоамилол, изобутанол, 1-бутанол. Другим спиртам - гексанолу и 1-пропанолу присущи фруктовый аромат и сладкий эфирный запах. Значительно
облагораживает букет вин спирт с бензольным ядром 2-фенилэтанол, придающий ему оттенки розы, мёда. Эфирный, фруктово-ягодный запах присущ этилацета-ту, как всем сложным эфирам, образованным из алифатических кислот и спиртов. Подвижные жидкости с приятным ароматом представляют из себя низшие алифатические кетоны, представителем которых является ацетон. Приводимые в литературе значения пороговых концентраций летучих компонентов, образующих букет брожения, значительно колеблются, так как зависят от состава вин. Поэтому, выявление возможности влияния исследуемых соединений в количествах, продуцируемых опытными штаммами на органолептику вин, провели в сравнении с пороговыми концентрациям на воде [6]. Так, например, для эфиров она составляет 1,0 мг/ дм, вследствие чего даже малые количества этих соединений могут значительно отразиться на органолептической характеристике вина. Из идентифицированных высших спиртов, главным образом на аромат вин могут влиять изоамилол, гексанол и фенилэтанол, синтезируемые в количествах (табл. 1), значительно превышающих их пороговые концентрации - 3,0;7,0; 5,0 мг/дм3, соответственно. Низкие концентрации 1-пропанола,1-бутанола и изобутанола, у которых пороговые концентрации по воде составляют, мг/ дм3 300,0; 100,0 и 80,0, вероятно, в меньшей мере могут быть значимыми составляющими аромата. В сумме, количество высших спиртов во всех образцах варьировало незначительно, от 202,4 мг/дм3 до 236,9 мг/дм3, приближаясь к среднему уровню - 250 мг/дм3, характерному для сивушных спиртов, образующихся при сбраживании виноградного сусла [7]. Таким образом, летучий ароматообразующий комплекс, синтезируемый исследуемыми штаммами при естественном доступе кислорода, рН и температуре, благоприятных для бродильной активности дрожжей, в определенной мере свидетельствует об их нормальной метаболической деятельности в высокосахаристом сусле.
Таблица 1. Состав компонентов летучего комплекса сброженных субстратов
Показатели Массовая концентрация, мг/ дм 3
сусло / штамм
Ркацители-1 Ркацители-2 Траминер-3 Траминер-4
альдегиды
ацетальдегид 13,5 16,4 18,2 24,2
кетоны
ацетон 0,3 0,6 1,2 1,2
сложные эфиры
метилацетат 1,2 1,3 2,1 1,9
этилацетат 17,2 21,7 19,3 23,5
высшие спирты
пропанол-1 23,4 19,3 21,7 18,4
изобутанол 30,8 31,5 28,1 19,6
бутанол-1 2,1 1,6 1,2 1,2
изоамилол 145,5 150,0 132,5 127,6
гексанол 1,5 1,6 1,8 1,4
фенилэтанол 27,5 32,9 29,3 34,2
сумма выс- 230,8 236,9 214,6 202,4
ших спиртов
Известно, что исходная концентрация углеводов и аминокислот, участвующих в биосинтезе высших спиртов, а также их количество, утилизированное при брожении, способны воздействовать на сумму и качественный состав образующихся высших спиртов, однако не все авторы подтверждают прямую коррелятивную связь между ними. Идентифицированные в условиях наших экспериментов сивушные спирты, образованные при утилизации 25,6-27,6 г/100 см3 сахаров, в
зависимости от штамма, в количественном и качественном отношении находились в пределах, отмечаемых обычно в сухих белых виноматериалах, полученных из сусел с кондиционной для них сахаристостью [8]. Исследование опытных виноматериалов, полученных из сортов винограда Траминер и Пино-гри (сахаристость сусла 28,2 г/100 см3) по основным физико-химическим показателям показало варьирование их значений, свидетельствующее о различной степени проявления
физиолого-биохимической активности опытных штаммов. Концентрации компонентов колебались в следующих пределах: этанол 14,2-14,7% об., остаточные сахара 0,4-1,2 г/100 см3, титруемые кислоты 7,0-8,1 г/дм3, летучие кислоты 0,4-0,9 мг/дм3, диоксид серы 7,3-12,8 мг/дм3, редуктоны 4,9-11,4 мг/дм3. Виномате-риалы, полученные на основе жизнедеятельности опытных штаммов, способных к сбраживанию высокосахаристых сред имели хорошие органолептические характеристики и высокие дегустационные оценки. Экспериментальные образцы вин, были прозрачными, имели соломенный цвет, гармоничный вкус, тонкий нежный аромат с тонами, присущими данным сортам.
Выводы: исследования, направленные на поиск дрожжей-сахаромицетов, ассоциированных с виноградом, показали их целесообразность для скрининга ресурсных штаммов S.cerevisiae. Выявлена встречаемость среди природных популяций этого вида культур, способных к активному сбраживанию сред с повышенной концентрацией углеводов и формированию состава и качества сброженного субстрата,
отвечающего требованиям, предъявляемым к натуральным винам различных типов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Бурьян, Н.И. Микробиология виноделия . 2-е изд. Доп.-Симферополь: «Таврия», 2002. 403 с.
2. Бабьева, И.П. Методы выделения и идентификации дрожжей / И.П. Бабьева, В.И. Голубев. - М.; Пищевая промышленность, 1979. 116 с.
3. Kurtzman, C.P. The yeasts, a taxonomic study / C.P. Kurtzman, J.W Fell (eds.) - Amsterdam et el.: Elsevier, 2011. 2080 p.
4. Качалкин, А.В. Новые данные о распространении некоторых психрофильных дрожжевых Грибов в Московской области // Микробиология. 2010. Т. 79, №6. С. 843- 847.
5. Методы технохимического контроля в виноделии / под ред. В.Г. Гержиковой.- Симферополь: Таврида, 2009. 309 с.
6. Шприцман, Э.М. Влияние приёмов стабилизации на летучие компоненты вин / Э.М. Шприцман, И.В. Аронина // Виноградарство и виноделие СССР. 1978. №4. С. 24-27.
7. Родопуло, А.К. Основы биохимии виноделия. - М.: Легкая и пищевая пром-сть,1983. 239 с.
8. Нилов, В.И. Химия виноделия / В.И. Нилов, И.М. Скурихин. - М.: «Пищевая промышленность», 1967. 441 с.
BIOTECHOLOGICAL POTENTIAL OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE, SELECTED FROM VINEYARDS IN DAGESTAN
© 2016 D.A. Abdullabekova, E.S. Magomedova, G.G. Magomedov Pre-Caspian Institute of Biological Resources DSC RAS, Makhachkala
Physiological and biochemical properties of grapes-associated S. cerevisiae gathered from Daghestan vineyards are studied. It is revealed the occurrence of active strains among the natural population of S. cerevisiaew, hich have a promising biotechnological potential for natural wine making. It is investigated the ability of yeasts to active fermentation of high concentration carbohydrates and production of components influencing on a wine quality. Obtained data show the expedience to search strains among natural yeasts feasible for alcoholic beverage production.
Key words: yeasts, biopotencial, grapes, wine
Dinahanum Abdullabekova, Candidate of Technical Sciences, Leading Research Fellow. E-mail: dina2407@mail. ru
Elena Magomedova, Candidate of Biology, Leading Research Fellow. E-mail:[email protected] Gadji Magomedov, Research Fellow. E-mail: [email protected]
