CC BY
866
УДК 615:322
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ФЛАВОНОИДОВ В ЭКСТРАКТАХ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
© А.А. Лобанова1, В.В. Будаева2, Г.В. Сакович3
ФГУП ««Федеральный научно-производственный центр «Алтай»», Бийск,
659322 (Россия), е-mail: post@frpc.secna.ru
2ЗАО «Алтехнохим», Бийск, 659322 (Россия) е-mail: atch@frpc.secna.ru 3Институт проблем химико-энергетических технологий, Бийск, 659322 (Россия) е-mail: admin@ipcet.ru
Разработаны методики качественного и количественного определения флавоноидов и исследовано их содержание в экстрактах из растительного сырья различного происхождения.
Работа выполнена по проекту ХТРС 8.1.17 Введение
Биофлавоноиды - это обширная группа фенольных соединений растительного происхождения, имеющих общую дифенилпропановую структуру и обладающих капилляроукрепляющей (так называемой Р-витаминной активностью).
Успешное использование Р-витаминных препаратов при лечении и профилактике целого ряда заболеваний привлекло внимание многих исследователей с целью поиска новых источников и разработки технологии Р-витаминных препаратов.
Нами проведены исследования по возможности получения известных и новых препаратов, содержащих биофлавоноиды, с учетом растительных ресурсов Алтайского края.
Новые Р-витаминные препараты: экстракты шрота облепихи (жидкий и густой), экстракт шрота калины, экстракт корневищ бадана (жидкий и сухой), экстракт листа лопуха. Известные препараты: экстракты левзеи, боярышника, календулы.
Для оптимизации способов получения вышеуказанных экстрактов, стандартизации полученных препаратов очень важно разработать методику качественного и количественного определения биофлавоноидов в рассматриваемых объектах, которая является простой, нетрудоемкой и обладает хорошей точностью и воспроизводимостью.
Обсуждение результатов
Биофлавоноиды - сложные соединения с большим количеством реакционных групп, поэтому их химические свойства представлены в литературе достаточно широко.
Для качественного определения биофлавоноидов нами выбраны две наиболее характерные реакции: это реакция с хлоридом железа (III) и цианидиновая проба.
При взаимодействии биофлавоноидов с хлоридом железа (III) флавонолы (рутин, кверцетин, кемпферол) образуют комплексы, окрашенные в зеленый цвет, а флаваноны (дигидрофлавоны) — комплексы, окрашенные в коричневый цвет.
* Автор, с которым следует вести переписку.
но о
ок
О ,0 (зеленый)
\ /
>е*
ок
0 0 (коричневый)
>е*
В таблице 1 представлены результаты взаимодействия вышеуказанных экстрактов с хлорным железом.
Коричнево-зеленую окраску дают экстракты, имеющие в своем составе широкий спектр флавоноидов. Черное окрашивание с кратковременным появлением зеленого связано с присутствием дубильных веществ, содержание которых значительно превосходит содержание флавоноидов. Для лучшего наблюдения за окрашиванием сухие, густые и непрозрачные экстракты необходимо разбавлять в 10-50 раз.
Взаимодействие карбонильной группы флавоноидов со свободным водородом приводит к образованию насыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевые соединения, имеющие окраску от оранжевого до красно-фиолетового цвета.
В таблице 2 приведены результаты цианидиновой пробы. Обязательным является нагревание, некоторый временной интервал и сравнение с контрольной пробой на белом фоне.
Таблица 1. Результаты взаимодействия флавоноидов с хлорным железом
№ п/п Наименование экстракта Наблюдаемое окрашивание
1 Раствор рутина Зеленое
2 Экстракт из шрота облепихи
а) жидкий Коричнево-зеленое
б)густой Коричнево-зеленое
3 Экстракт из шрота калины Темно-зеленое
4 Экстракт из листа лопуха Интенсивно зеленое
5 Экстракт корневищ бадана
а) жидкий Черное с кратковременным появлением зеленого
б) сухой Черное с кратковременным появлением зеленого
6 Экстракт левзеи Зеленое
7 Экстракт боярышника Интенсивно зеленое
8 Экстракт календулы Зеленое
Таблица 2. Результаты качественного анализа флавоноидов с помощью цианидиновой пробы
№ п/п Наименование экстракта Условия приготовления пробы Наблюдаемое окрашивание
1 Раствор рутина 1 мл Красно-коричневое
2 Экстракт из шрота облепихи
а) жидкий 1 мл, 40 °С, 4-5 мин Красно-коричневое
б)густой 1 г в 25 мл, 40 °С, 4-5 мин Красно-коричневое
3 Экстракт из шрота калины 1 мл, 40 °С, 10 мин Розовое
4 Экстракт из листа лопуха 1 мл, 40 °С, 5 мин Красно-коричневое
5 Экстракт корневищ бадана
а) жидкий 1 мл Не наблюдается
б)сухой 0,5 г в 50 мл Не наблюдается
6 Экстракт левзеи 1 мл, 40 °С, 4-5 мин Красно-коричневое
7 Экстракт боярышника 1 мл, 40 °С, 15 мин Красно-коричневое
8 Экстракт календулы 1 мл, 40 °С, 10 мин Красно-коричневое
Неудача с цианидиновой пробой в экстракте бадана связана с небольшим содержанием флавоноидов и интенсивной темной окраской исходного экстракта.
Из всех известных методов количественного определения флавоноидов наиболее интересными являются хроматографический метод [1] и метод, основанный на спектрофотометрировании комплексов флавоноидов с ионами металлов [2].
Нами был выбран метод спектрофотометрического анализа комплексов в связи с его большей экспрессностью и использованием оборудования, доступного для любой центральной заводской и других контролирующих лабораторий.
В качестве основы для разработки методики мы использовали метод [2], предполагающий спектрофотометрический анализ комплексов флавоноидов с хлоридом алюминия.
Отличие разработанной нами методики от описанной в литературе состоит в том, что:
— в качестве стандарта используется тот флавоноид (ГСО рутина, кверцетина, гесперетина и т.д.), максимум поглощения комплекса которого наиболее соответствует максимуму поглощения комплекса с хлоридом алюминия исследуемого образца;
— построение калибровочного графика проводят на основе раствора стандартного образца в 60%-ном спирте, а не в абсолютном спирте или ацетоне;
— в процессе анализа не используются добавки кислот, поскольку нами установлено, что они не оказывают стабилизирующего действия.
На рисунке 1 приведены спектры поглощения комплексов биофлавоноидов с хлоридом алюминия.
Как видно, для большинства исследуемых экстрактов в качестве стандарта может служить рутин, а определение содержания суммы биофлавоноидов в пересчете на рутин следует проводить в интервале ^тах 408-420 нм. Для экстрактов, имеющих максимум поглощения в области 421-435 нм, следует использовать в качестве стандарта кверцетин. В таблице 3 представлены результаты анализа некоторых экстрактов.
Как следует из приведенных данных, определение содержания флавоноидов в препаратах имеет удовлетворительную относительную погрешность измерения от 1 до 7%. По результатам исследований выпущены методики: «Определение массовой доли суммы Р-активных флавоноидов в жидких экстрактах из растительного сырья» (7508906.01007.00109); «Определение массовой доли суммы Р-активных флавоноидов в экстракте густом из шрота облепихи» (7508906.01007.00093).
Разработанная методика была использована при оптимизации способов получения Р-витаминных препаратов из плодово-ягодных жомов и шротов.
В частности, при оптимизации режимов получения экстрактов из шрота облепихи мы проследили изменение соотношения рутин : кверцетин в случае отклонения от температурного режима. Рутин — гликозид кверцетина — при перегревах реакционной массы гидролизуется с образованием кверцетина и соотношение рутин : кверцетин уменьшается, при этом наблюдается смещение максимума поглощения от 415 до 424 нм с небольшим изменением оптической плотности. Такое явление не снижает качества Р-витаминного препарата, поскольку кверцетин более активен, чем рутин.
рутин кверцетин рамноглюкоза
Результаты представлены в таблице 4.
Рис. 1. УФ-спектры поглощения комплексов биофлавоноидов с А1С13:
1 - рутин; 2 - кверцетин; 3а, 3б - экстракты шрота облепихи жидкий и густой;
4 - экстракт листа лопуха; 5 - экстракт левзеи; 6а,б - экстракты корневищ бадана жидкий и сухой; 7 - экстракт боярышника; 8 - экстракт шрота калины; 9 - экстракт календулы
Для установления соотношения флавоноидов предварительно строили калибровочную кривую зависимости Хтах от соотношения рутин:кверцетин. В качестве стандартных образцов использовали ГСО рутина и кверцетина.
Таблица 3. Содержание суммы флавоноидов в препаратах
№ п/п Наименование экстракта Содержание флавоноидов в пересчете на рутин Стандартное отклонение Относительная погрешность измерения, %
1 Экстракт из шрота облепихи а) жидкий 1,45 г/л 0,04 г/л 2,7
б)густой 1,65 % 0,05 % 3,2
2 Экстракт из листа лопуха 1,06 г/л 0,07 г/л 6,6
3 Экстракт левзеи 0,99 г/л 0,01 г/л 1,4
4 Экстракт боярышника 0,39 г/л 0,02 г/л 6,1
5 Экстракт календулы 0,48 г/л 0,02 г/л 3,3
Таблица 4. Соотношение рутина и кверцетина в продуктах переработки шрота облепихи
№ п/п Наименование Хтах комплекса, нм Соотношение рутин : кверцетин, вес. ч. Отклонение от технологии
1 Шрот облепихи 415 1 : 0 —
2 Экстракт жидкий 415 1 : 0 —
3 Экстракт густой 419 4 : 1 Перегрев, длительное пребывание в аппарате
4 Жевательная резинка с экстрактом густым 424 5 : 3 Перегрев при смешении
Метод количественного определения флавоноидов в виде комплекса можно использовать для стандартизации известного фармпрепарата - жидкого экстракта левзеи; поскольку предложенный сегодня метод стандартизации этого экстракта по активному веществу плохо воспроизводится и является сложным и громоздким [3].
Кроме того, указанная методика позволила дополнительно провести анализ не только экстрактов из ягодного сырья, но и медицинских препаратов, которые ранее не исследовались на содержание флавоноидов.
Комплексы с А1С13, полученные из вышеуказанных веществ, имеют следующие максимумы
поглощения:
^тах, нм
экстракт черноплодной рябины — 405; 525
экстракт жома брусники — 415; 560
экстракт из листа облепихи — 400
экстракт из веток лимонника — 409
экстракт элеутерококка — 376
настойка аралии — 360
Полученные результаты свидетельствуют о широких возможностях разработанного метода и при использовании соответствующих стандартных образцов, можно провести количественное определение флавоноидов в известных фармпрепаратах.
Очевидно, что описанный выше метод может быть использован для контроля качества серии пищевых продуктов: бальзамов алкогольных и безалкогольных, имеющих очень сложный состав, включающий до 40 наименований лекарственного растительного сырья Алтайского края. Таким образом, проблема идентификации бальзамов и исключения фальсификатов с потребительского рынка может быть решена любой контролирующей организацией (органами госсанэпиднадзора, сертификации и т.д.), имеющей химическую лабораторию и оригиналы производителей бальзамов в качестве эталона.
Кроме того, в экстрактах из плодово-ягодного сырья при соответствующей доработке метода можно дополнительно определять содержание антоцианов (Хтах 520-580 нм), а также с помощью метода контролировать качество пищевых красителей, содержащих антоцианы.
Экспериментальная часть
Для получения экстрактов использовалось высушенное растительное сырье с влажностью не более 13%.
Жидкие экстракты получали многоступенчатой противоточной экстракцией с чередованием настоя и движением жидкости через экстракторы. Содержание сухих веществ в жидких экстрактах составляло 818% в зависимости от используемого сырья.
Густые экстракты получали сгущением жидких путем упаривания в вакууме. Содержание сухих веществ в густых экстрактах — 60-70%.
Использовали соответствующие Госфармакопее известные фармпрепараты.
УФ-спектры снимали на приборе 8ресоМ М-40.
Общая методика определения содержания суммы флавоноидов в жидких экстрактах.
В мерную колбу вместимостью 25 мл, предварительно взвешенную, переносят с помощью пипетки аликвоту анализируемого экстракта, равную 1 мл, и вновь взвешивают. В колбу с помощью пипетки добавляют 4 мл 5% раствора хлорида алюминия. Для приготовления раствора сравнения во вторую колбу вместимостью 25 мл с помощью пипетки переносят аликвоту (1 мл) анализируемого экстракта, после чего объем обеих колб доводят до метки 60% спиртом и оставляют на 30 мин. В случае помутнения растворов их фильтруют через бумажные фильтры в чистые стаканы.
Оптическую плотность измеряют в интервале 408-616 нм на длине волны максимума поглощения в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см, в рабочую кювету помещают раствор с добавленным хлоридом алюминия, в кювету сравнения - раствор сравнения. Если максимум поглощения расположен в области 408-420 нм, в качестве стандарта используют ГСО рутина.
Для постоения калибровочного графика зависимости оптической плотности от количества рутина в растворе точную навеску ГСО рутина около 0,05 г количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 50 см3, прибавляют отмеренные 40 мл 60% водного спирта, нагревают до 50-60 °С до растворения рутина, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят до метки 60% спиртом.
Для приготовления комплекса с хлоридом алюминия в мерные колбы А и Б вместимостью 25 мл переносят по аликвоте раствора рутина и обрабатывают аналогично указанному выше, получая при этом раствор с комплексом и раствор сравнения. Используют аликвоты раствора рутина, см3: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2. При этом количество рутина в 25 см3 спектрофотометрируемого раствора равно соответственно г х 103: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2.
Измеряют оптическую плотность при длине волны 415 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см; в рабочую кювету помещают раствор А, в кювету сравнения — раствор Б.
Калибровочный график зависимости оптической плотности (Б) от количества рутина в спектрофотометрируемом растворе (с) имеет вид прямой линии, проходящей через начало координат.
Массовую долю суммы Р-активных флавоноидов в исследуемых экстрактах в пересчете на рутин в мг/100 г (Х) вычисляют по формуле
с ■ Рр ■ 105 Х " М
где с - количество рутина в анализируемой аликвоте экстракта, соответствующее измеренной оптической плотности по калибровочному графику, г/25 см3; Бр - фактор разбавления (если такое проводилось); 105 -коэффициент пересчета в мг/100 г; М - масса экстракта, г.
Аналогично проводят определение при расположении максимума поглощения в области 421-435 нм. В качестве стандартного образца используют ГСО кверцетина.
Выводы
Разработаны методики качественного и количественного определения содержания суммы Р-активных флавоноидов и проведены исследования растительного сырья, экстрактов из плодово-ягодного сырья, нетрадиционных экстрактов из веток и листьев, а также известных фармпрепаратов на содержание витамина Р.
Список литературы
1. Киселева Т. Л., Самошина И.А. Количественное определение суммы флавоноидов в плодах боярышника // МРЖ. Сер. 22. №4. 1988. С. 30-32.
2. А. с. СССР № 1507394. Способ количественного определения флавоноидов в растительном сырье / В.В. Беликов, Н.Т. Колесник. 1989.
3. Фармакопейная статья ФС 42-1995-99 «Экстракт левзеи жидкий»
Поступило в редакцию 16 января 2004 г.
