CC BY
158
УДК 615.22./322.074:581.192
А. П. Потанина (асп.), С. Р. Хасанова (к.фарм.н, доц.), Н. В. Кудашкина (д.фарм.н., проф., зав.каф.)
Разработка методики количественного определения флавоноидов в растительном сборе «Кардиофит»
Башкирский государственный медицинский университет, кафедра фармакогнозии с курсом ботаники основ фитотерапии 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3; тел. (347) 712285, e-mail: [email protected]
A. P. Potanina, S. R. Khasanova, N. V. Kudashkina
Development of the method of quantitative determination of flavonoids in the plant species «Cardiophytum»
Baskir State Medical University 3, Lenina Str., 450000, Ufa, Russia; ph. (347) 712285, e-mail: [email protected]
В статье рассмотрены исследования по разработке методики количественного определения суммы флавоноидов в растительном сборе «Кардиофит». Состав сбора разработан на кафедре фармакогнозии Башкирского государственного медицинского университета. В ходе разработки методики было изучено влияние различных условий экстрагирования сырья. Установлены параметры комплексообразования на выход флавоноидов. Рассчитана метрологическая характеристика методики. Разработанная методика предложена для включения в проект нормативной документации.
Ключевые слова: алюминия хлорид; инструментальный метод анализа; количественное определение; метрологическая характеристика; нормативная документация; рутин; сбор; спект-рофотометрия; стандартизация; флавоноиды.
Разработка современных методов стандартизации — одно из основных направлений в исследовании лекарственного растительного сырья и получаемых из него фитопрепаратов. Требования, предъявляемые к разработке нормативных документов, регламентирующих качество лекарственного растительного сырья, предусматривают, в частности, количественное определение основных действующих веществ '.
На кафедре фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии Башкирского государственного медицинского университета разработан оригинальный фитопрепарат «Кардиофит». Это растительный сбор, в состав которого входят 14 видов лекарственного растительного сырья (листья земляники, трава донника, плоды рябины, боярышника и другие) 2. У сбора выявлены антиоксидантные, антиаг-регантные, антикоагулянтные, антигипоксант-
Дата поступления 25.08.13
The article describes a study on the development of methods to quantify the amount of flavonoids in plant species «Cardiophytum». The collection is developed at the Department of Pharmacognosy of Bashkir State Medical University. During the development of the methodology was the influence of various conditions of the extraction of raw materials. The parameters for the complexation of flavonoids are established. Metrological characteristics techniques are calculated. The developed method is proposed for inclusion in the draft regulatory documents.
Key words: aluminum chloride; flavonoids; metrological characteristics; quantitative definition; routines; standard documentation; species; spectrophotometry; standardization; tool method of the analysis.
ные свойства 2'3. В настоящее время проводится разработка нормативной документации на сбор.
Целью данной работы является разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в растительном сборе «Кардиофит».
Материалы и методы исследования
Для количественной оценки флавоноидов нами выбран метод дифференциальной спект-рофотомерии с использованием в качестве комплексообразующего реагента хлорида алюминия, который используется в фармацевтической практике для анализа флавоноидсодер-жащих препаратов и лекарственного растительного сырья 4. Оптическую плотность комплексов флавоноидов с хлоридом алюминия измеряли с использованием спектрофотометра Shimadzu UV-1800 в УФ-области.
Результаты и их обсуждение
Выбирая стандартное вещество для количественного определения, мы учитывали состав флавоноидного комплекса и положение максимума поглощения алюминиевых комплексов в среде HCl. Наиболее близко по значению Anax комплекса AlCl3/HCl к извлечению растительного сбора (Anax комплекса AlCl3/HCl 401—405 нм) подходят рутин (Anax комплекса AlCl3/HCl 410-412 нм) и кверцетин (Anax комплекса AlCl3/HCl 410-422 нм). После проведения экспериментального сравнительного анализа УФ-спектров спиртового извлечения из сбора и растворов рутина и кверцетина был сделан вывод, что в качестве стандартного флавоно-ида следует использовать рутин и измерения проводить при длине волны 402 нм (рис. 1).
■4GO.OQ - I' J .11)
Рис. 1. УФ-спектры экстракта из сбора (1), рутина (2) и кверцетина (3) с хлоридом алюминия
В ходе разработки методики экспериментально с последующей статистической обработкой результатов было изучено влияние различных условий экстрагирования сырья на выход флавоноидов (табл. 1) и установлены параметры комплексообразования.
Установлено, что наибольший выход фла-воноидов достигается при использовании в качестве экстрагента 40%-го этилового спирта, при соотношении сырья и экстрагента, равном 1:50 и проведении трехкратной экстракции. Время достижения равновесной концентрации при экстрагировании флавоноидов из сырья составляет 30 мин. Экстракция происходит достоверно полнее при измельчении сырья до частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.
Экспериментально установлено, что оптимальное количество 5%-го раствора хлорида алюминия, обеспечивающее полноту образования комплекса, составляет 2 мл на 2 мл спиртового экстракта. Реакция комплексооб-разования развивается в течение 30 мин и следующие 1.5 ч комплекс сохраняет стабильность.
Содержание флавоноидов в среднем составило 1.7 ± 0.047 %. Была рассчитана метрологическая характеристика методики. Относительная погрешность в 7 повторениях составляет 2.78%, а относительная погрешность отдельной варианты — 7.35% (табл. 2).
На основании проведенных исследований нами была предложена следующая методика.
Таблица 1
Влияние условий экстракции на содержание флавоноидов в сборе
Условия экстракции Содержание флавоноидов, % Условия экстракции Содержание флавоноидов, %
Концентрация спирта, % Время экстракции, мин
40 1.12 ± 0.061 10 0.93 ± 0.032
50 1.07 ± 0.062 20 0.97 ± 0.035
60 0.99 ± 0.045 30 0.98 ± 0.035
70 1.08 ± 0.056 40 0.91 ± 0.048
80 1.05 ± 0.054 50 0.93 ± 0.031
96 0.76 ± 0.035
Кратность экстрагирования Измельченность сырья, мм
однократно 1.37 ± 0.078 1 1.44 ± 0.042
двукратно 1.65 ± 0.081 2 1.26 ± 0.052
трехкратно 1.73 ± 0.092 3 1.03 ± 0.026
четырехкратно 0.86 ± 0.041 4 0.89 ± 0.048
5 1.09 ± 0.028
Соотношение сырья и экстрагента
1:10 0.26 ± 0.01
1:25 0.99 ± 0.05
1:50 1.41 ± 0.06
1:100 1.35 ± 0.04
Метрологическая характеристика методики
Таблица 2
n f X А X S S_ X P £% £ ,%
7 6 1.70 0.047 0.0026 0.0193 95% 7.35 2.78
Около 1.0 г (точная навеска) сырья, измельченного до размера частиц 1 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл и добавляют 50 мл 40%-го этилового спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане 30 мин. Извлечение фильтруют, избегая попадания частиц сырья на фильтр, в колбу вместимостью 150 мл. Экстракцию повторяют еще два раза, в течение 30 мин, используя по 45 мл 40%-го этилового спирта. Извлечение фильтруют в ту же мерную колбу, через тот же фильтр. Сырье и фильтр промывают 5 мл того же спирта, при необходимости доводят объем извлечения до метки этим же растворителем (раствор А).
2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 5% раствора хлорида алюминия в 95%-м этиловом спирте, доводят объем раствора 95%-м этиловым спиртом до метки и перемешивают (раствор Б). Через 30 мин измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 402 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 2 мл препарата, 1 каплю хлористоводородной кислоты и 95%-й этиловый спирт до общего объема 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность государственного стандартного образца (ГСО) рутина: 1 мл 0.05% спиртового раствора ГСО рутина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 5% раство-
Литература
1. Отраслевой стандарт 91500.05.001-00 Стандарты качества лекарственных средств. «Основные положения».
2. Пат. 2416424 РФ / Хасанова С. Р., Потанина А. П., Кудашкина Н. В., Басченко Н. Ж. // 2011. — Бюл. №11.
3. Хасанова С. Р., Потанина А. П., Кудашкина Н. В., Басченко Н. Ж., Макара И. С. // Кардиовас-кулярная терапия и профилактика.— 2009.— №8 (6).- С.377.
4. Государственная фармакопея СССР XI издания, выпуск 2.- М.: Медицина, 1990.- 400 с.
ра хлорида алюминия в 95%-м этиловом спирте, доводят объем раствора 95%-м этиловым спиртом до метки и перемешивают. Измерения проводят аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в % (Х) вычисляют по формуле:
X _ D1 -100%• V • V2 -V6 • a0-100 _ D0 • a• V3 -V4-V5 • (100-W)
где D1 — оптическая плотность испытуемого раствора;
D0 — оптическая плотность ГСО рутина; а — навеска сырья, г;
V \ — объем полученного экстракта сбора (150 мл); V2 — объем разведения аликвоты экстракта (25 мл);
V3 — объем аликвоты экстракта (2 мл); а0 — навеска ГСО рутина, г; V4 — объем раствора стандарта (100 мл); V5 — объем разведения аликвоты раствора стандарта (25 мл);
V6 — объем аликвоты раствора стандарта (1 мл); W — потеря в массе при высушивании сырья.
Таким образом, на основании проведенных исследований разработана методика спек-трофотометрического определения суммы флавоноидов в растительном сборе «Кардио-фит» в пересчете на рутин. Содержание флавоноидов в растительном сборе «Кардиофит» варьирует в среднем от 1.37 до 2.05%. В качестве нижнего порога содержания флавоноидов выбрана величина не менее 1.2%.
References
1. Industry standard 91500.05.001-00 «Quality standards of medicines. Basic provisions».
2. Khasanova S. R., Potanina A. P. Kudashkina N. V., Baschenko N. Zh. Herbal tea for prevention and treatment of chronic heart disease. Pat. RF no. 2416424, 2011.
3. Khasanova S. R., Potanina A. P. Kudashkina N. V., Baschenko N. Zh. Makara I. S. Cardiovascular therapy and prevention.— 2009.— no. 8 (6).— P.377.
4. State pharmacopeia of the USSR of the XI edition, release 2.— M: Medicine, 1990.— 400 p.
